（农产品加工及贮藏工程专业论文）乳糖酶高产菌株分离筛选、发酵产酶及酶学性质的研究.pdf

摘要 本论文系统研究了产乳糖酶微生物的分离筛选、发酵工艺和酶学性质，发现： ( 1 ) 通过产酶菌株的分离筛选，建立了一套快速、准确的乳糖酶高产菌株筛选 方法：以o n p g 作为产酶指示物，采用0 2 m l 的离心管为初筛工具；确定了合理、客 观的综合考察酶活和实际应用中的主要酶学性质两个方面，以o h a ；l h a 、l h a o h a ； 作用温度及热稳定性、作用p 1 1 及p h 稳定性多个指标组成的三级复筛方法。提出了一 种快速、客观的乳糖酶活力测定程序：引入修正系数0 h a l h a ，以o n p g 为表观指标， 除以修正系数，来代替l h a 。这样，既能提高测定速度，又能真实反映乳糖水解能力。 最终，采用o n p g 作为产酶指示物，从保定新天香乳品公司生产车间附近的土壤中筛 得一高产菌株，发酵液中0 h a = 2 2 4u m l 、l h a = i 7 1u m l 、0 h a l i a = 1 3 1 、最适温 度7 0 、最适p h 4 0 、热稳定性好( 7 0 ，1 0 m i n ) 。经菌落形态观察、分生孢子头显 微观察，初步鉴定为黑曲霉，是生产食品酶制剂的安全菌株。将d ：。菌株编号为 a s p e r g i l l u sn i g e rd 2 2 6 。 ( 2 ) 发酵工艺优化表明，黑曲霉d 。菌株产酶优化的培养基为：果胶0 3 、 玉米浆2 、豆粕粉1 5 、硝酸铵0 2 、k 2 h p o 。1 、n p 50 3 。优化发酵条件 为：接种量为孢子浓度1 0 4 m l ，发酵培养基的起始p h 为5 5 ，装液量为3 0 2 5 0 m l 摇床3 0 。c ，1 4 0 r p m ，培养7 天。经过发酵工艺优化，黑曲霉d ：。菌株产酶活力可达 6 5 3u m l 。 ( 3 ) 酶学性质研究发现，d ：。菌株乳糖酶的基本酶学性质为：最适作用温度为 7 0 。c ，作用温度较宽，7 0 处理1 0 m i n ，酶活力基本无损失，属于高温乳糖酶；最适 作用p h 为4 ，作用p h 较宽( 2 5 6 5 ) ，酶的p h 稳定范围在2 5 7 之间；k + 、c a 2 十、 z n “、m g “、p b 2 + 、e d t a 对乳糖酶的水解无抑制或激活作用；f e “、c u 2 十、w i n 2 + 对 水解有不同程度的的激活，其中，f e 2 + 在低浓度下有较高激活作用，c u 2 、m n 2 + 在高 浓度下激活较明显。 关键词：乳糖酶：菌种筛选：酶活测定；发酵优化；酶学性质 s t u d yo ns c r e e n i n go fh i g h y i e l d i n gs t r a i n s ，o p t i m u mo fl i q u i d f e r m e n t a t i o na n de l e m e n t a le n z y m ep r o p e r t i e s m a j o r ：p r o c e s s i n ga n ds t o r a g eo fa g r i c h l t u r ep r o d u c t s a u t h o u r ：l ix i n g f e n g t u t o r ：j i ay i n g m i n a b s t r a c t s y s t e m a t i cs t u d yo nt h es c r e e n i n go fl a c t a s e y i e l d i n gs t r a i n s ，l i q u i df e r m e n t a t i o no f l a c t a s eh i g hp r o d u c i n gs t r a i nd 2 2 6a n de n z y m ep r o p e r t i e sw e r ec a r r i e do u ti nt h i sp a p e n t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w i n g ： 1 w ei m p r o v e dt o o lo fp r i m a r ys c r e e n i n ga n df o u n dar e a s o n a b l em e t h o do fr e p e a t e d s c r e e n i n g ：u s i n go 2 m le p o n d o l ft u b ea sn e wt o o lo fp r i m a r ys c r e e n i n g ；m e t h o do ft h e s e c o n ds c r e e n i n gh a st h r e es t a n d a r d s ，i n c l u d i n go h a ，l h aa n dp r i m a r ye n z y m e p r o p e r t i e s t h ef e a s i b l ea s s a yp r o c e d u r eo fl a c t a s ea c t i v i t yw a sp u tf o r w a r d ，n a m e l yu s i n g o h aa n do h a l h ar e p r e s e n tl h a t h eh i g h y i e l d i n gs t r a i nd 2 2 6w a ss c r e e n e db yu s i n g o n p ga si n d i c a t o rf r o ms o i ls a m p l e sa r o u n dp r o d u c t i o np l a n to fb a o d i n gt e n s u nd a i r y c o l t d d 2 。2 6s h o w e dr e l a t i v eh i g he n z y m a t i ca c t i v i t yi nl i q u i df e r m e n t a t i o n t h eo h a ， l h a ，o h a l h aw a s2 2 4 u m l ，1 7 1 u m l ，1 3 1 ，r e s p e c t i v e l y o p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s7 0 ，o p t i m a lp hw a s4 0 t h ee n z y m eh a dag o o dt h e r m o s t a b i l i t y ( 7 0 1 2 ，1 0 m i n ) a f t e r p r i m a r yi d e n t i f i c a t i o nt h el a c t a s e p r o d u c i n go r g a n i s mw a si d e n t i f i e da sa s p e r g i l l u sn i g e r a n ds a f e t ys t r a i n 2 o p t i m i z e dc u l t u r em e d i u mi nl i q u i df e r m e n t a t i o nw e r e ：p e c t i no 5 c o r nl i q u o r2 ， s o y b e a np o w d e r1 5 ，n i - h n 0 3o 2 ，k 2 h p 0 41 ，n p 一5o 3 o p t i m i z e d c u l t u r e c o n d i t i o nw e r e ：1 0 4s p o r ep e rm i li n o c u l u mq u a n t i t y , p h 5 5 ，3 0 ( 2 ，1 4 0 r p m ，3 0 2 5 0 m l a f t e r o p t i m u mo fl i q u i df e r m e n t a t i o n ，t h em a x i m u me n z y m ea c t i v i t yo fd 2 2 6w a s 6 5 3u m 1 3 t h et e s to fc r u d ee n z y m ei n d i c a t e dt h a to p t i m a lt e m p e r a t u r eo fd 2 2 6l a c t a s ew a s7 0 r e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s r e l a t i v e l ye x t e n s i v e t h el a c t a s eh a dg o o dt h e r m o s t a b i l i t yu p t o7 0 ca n d w a sh i g h e rt e m p e r a t u r el a c t a s e o p t i m a lp hw a s4 0a n di tw a ss t a b l ea tp h 2 5 7a tr o o mt e m p e r a t u r e ，t h em e t a li r o n sk + 、c a 2 + 、z n “、m g “、p b “、e d t ah a v en o i n h i b i t i o no nl a c t a s e f e 2 + 、c u 2 + 、m n 2 + h a dd i f f e r e n ta c t i v a t i o n , f e 2 + h a sh i g ha c t i v a t i o na t l o wd e n s i t yw h i l ec u “、m n 2 + h a v eh i g ha c t i v a t i o na th i g hd e n s i t y k e yw o r d s ：1 3 - g a l a c t o s i d a s e ；s t r a i ns c r e e n i n g ：l a c t a s ea c t i v i t ya s s a y ：l i q u i d f e r m e n t a t i o n ；e n z y m ep r o p e r t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为狭得洹j e 盘些太堂或其它 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：建、墨磷 签字日期：文内午年石，挣弓日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解煎j e 壅些太堂有关保留及使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门( 机构) 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被奄( 借) 阅。本人授权逦j e 盛些太堂可以将论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等方法加以保存或编成学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 学位论文作者签名：喜考啤 签字日期：如c 产t - 月a 弓日 导师签名： 圜 签字日期：文牛年6 月矗弓日 乳糖酶高产菌株分离筛选、发酵产酶及酶学性质的研究 1 1 本研究的目的和意义 1 引言 乳糖酶( 工丑c t a s e 。e c3 2 _ l 2 3 ) ，其系统名为8 - d 一半乳糖苷半乳糖水解酶( g - d - g a l a c t o s i d e g a l a c t o h y d r a s e ) ，或简称b 一半乳糖苷酶( b - g a l a c t o s i d a s e ) 。一般说来，该酶有两种催化性质：一是 催化水解反应，将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖；二是催化转移反应，在乳糖分子的半乳糖一侧连 接卜4 个半乳糖，生成低聚半乳糖( g a l a c t o o l i g o s a c c h a r i d e ，g o s ) “1 。 乳糖酶在工业中具有广泛的应用价值，概括起来，主要包括食品工业、医药工业、环境保护、 分析方面。 中国食品添加剂标准化委员会第1 9 次年会于1 9 9 8 年在江苏省靖江市召开，会议讨论并通过 了将乳糖酶列为食品添加剂新品种的决定”。，为其在食品工业中的应用奠定了基础。 利用乳糖酶水解乳糖的能力，生产低乳糖制品( 如乳糖水解乳、低乳糖奶粉等) ，可以有效 解决“乳糖不耐症”问题“。这是目前乳糖酶在食品工业的最大用途之一。乳及乳制品含有丰 富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素和多种矿物质，尤其是钙含量高， 钙磷比例适当，易被人体消化吸收，还含有免疫球蛋白等抗病因子，所以乳及乳制品有“近乎完 美的食物”的美称，是人类改善营养、增强体质不可缺少的理想食品“。乳糖是乳中最主要的 碳水化台物。牛乳中乳糖含量约占4 7 5 o ，占其总糖量的9 8 以上，是牛乳能量的主要来源。 然而，不是所有的人群都可以享用牛奶，特别是亚洲地区，患有“乳糖不耐症”而导致不 能食用牛乳的人群比例相当大。据报道，亚洲人口中约有7 0 的人患有程度不同的“乳糖不耐症” “。根据颜纪贤等人“”的研究报道，我国成年人饮用牛乳后乳糖吸收不良的发病率高达8 6 7 ， 乳糖不耐受指数为0 9 。所谓“乳糖不耐症”是指由于人体小肠内缺乏分解乳糖的b - 半乳糖苷酶， 饮用牛乳或乳制品后引起的对乳糖不耐受的非疾病性症状，主要表现为消化不良、腹胀、肠呜、 呕吐、急性菔痛或腹泻等1 “。由于“乳糖不耐症”的普遍存在，使相当一部分人无法像正常人 一样接受牛乳这一天然、具有良好平衡性的食品，这成为阻碍我国乳品工业发展的主要障碍之一。 一般水解7 0 8 0 孚l 糖即可解决“乳糖不耐症”的问题，目前，降低乳糖的方法有三种：超滤法、 化学酸水解法和酶解法，其中酶解法最适合生产低乳糖牛奶“。用b 一半乳糖苷酶水解牛乳或乳 制品中的乳糖，可以有效地消除人体对乳糖的不耐受症状，对于发展我国乳品工业，提高人们的 健康水平具有十分重要的意义”1 。 此外，乳糖酶在食品工业中还有许多其他用途。利用乳糖酶的水解作用，能够提高浓缩乳 制品的质量，克服奶粉、炼乳、冰淇淋等的乳糖析出，延长货架期；片j 于发酵乳制品中，可以缩 短发酵时间，减少蔗糖用量“。 医药工业中乳糖酶可作为助消化类药物，适用于婴儿各种消化不良症，如先天性乳糖酶缺乏 症，因胃障碍及缺铁所致的幼儿慢陛腹泻、幼儿及新生儿腹泻。霉菌乳糖酶更适合作为医用酶制 剂，因为它的最适p h 与胃液环境相一致，将其制成口服药剂，口服后可以有效防止乳糖不耐症 2 8 2 9 ) 河北农业人学硕士学位论文 乳糖酶在环境保护中有着重要的应用。乳清是乳品工业的主要副产品t 其中含_ ，0 6 听。o9 的蛋白质、4 0 5 o 的乳耱。因为人体不能吸收利用乳糖，除少部分作为饲料大部力蹲放制 自然界。由于乳糖的b o d 值非常高( 3 4 0 0 0 4 2 0 0 0 ) ，造成严重的环境污染”。利月j 乳糖酶的 各种催化作用，可以综合利用乳糖，生产乳清糖浆、半乳糖果葡糖浆和功能性低聚、卜咒鞔r ( j ( 蛉1 | 3 1 1 利用乳糖酶开发低聚半乳糖是当前食品酶工程和乳品工业领域内的研究热点”二、“、i ：l ；e 、 7 孔 糖是以牛乳或乳清中的乳糖为原料，经b 半乳糖苷酶催化作用生成的一种功能性低裂概：“i 。九 糖分子的半乳糖一侧连接半乳糖，属于葡萄糖和半乳糖组成的杂低聚耱，其结构驯铡i - j 巧? i ! - i ： o hzc - o h n = l - l ，b 键迎 蓝 图i - i 低聚半乳糖的化学结构 f i g l 一1c h e m i c a l $ t r t l c t t t r eo f 。g a l a c t o o l i g o s a c c h a r l d e 低聚半乳糖是一种具有天然属性的功能性低聚糖，其热稳定性好，对酸、碱稳定性高，并且 具有许多生理功能”1 ：( 1 ) 双歧杆菌增值因子及相关的生理功能，如促进有机酸生成、使肠 道p h 下降抑制外源菌的生长、生成大量短链脂肪酸、产生b 族维生素等。( 2 ) 低能量，产热 为l 7 c a l ，g 。通过小肠酶分解试验及1 4 c 标记的排泄试验，结果表明低聚半乳糖不被机体消化系统 所吸收，可直接到达大肠被肠道细菌所利用。( 3 ) 低龋齿性。体外试验表明，低聚半乳糖不能被突 变链球菌( s t r e p t o c o c c u s m u t a n s ) 等口腔细蔼作为发酵底物来生成不溶性葡聚糖，也不产生乳酸。 ( 4 ) 改善脂质代谢。降低总血清胆固醇浓度，提高血清中高密度脂蛋白所占比例。用切除卵巢的人 鼠做实验，与对照相比，血清总胆固醇含量显著降低。这可能与g o s 促进了丙酸的产生有关。 ( 5 ) 改善矿物元素的吸收作用。促进对钙的吸收，同时使肠道对钙的吸收有降低倾向。 分析方面，将乳糖酶和其他酶( 如过氧化物酶、葡萄糖氧化酶) 联合使用可以分析冰淇淋、 干酪和奶粉中的乳糖含量，该法简便快捷，费用低廉“。 随着人民生活水平的提高和对食品的营养要求，乳制品将成为首要食品。国家大力发展乳品 工业以提高全民营养状况、增强人民体质，我国于2 0 0 0 年1 1 月1 5 日正式启动“学生奶计划”， 目前已推广到全国2 8 个省会和大中城市，旨在从青少年时期改善学生营养状况”。然 而，由于“乳糖不耐症”的普遍存在，他们饮用牛奶后会山现腹胀、腹鸣、腹痛甚至腹泻等不同 程度的症状，甚至被误认为“学生奶中毒”，造成不必要的恐慌，影响“学生奶计划”的实施”。“。 另一方面，随着我国乳品t 业的飞速发展和乳制品结构的调整，势必产生大量副产物：乳清。 2 乳糖酶高产菌株分离筛选、发酵产酶及酶学性质的研究 但目前乳清尚未得到很好的利用，如将其直接排放到自然界中，将造成严重的环境污染。 利用乳糖酶的催化能力，可以有效解决“乳糖不耐症”，推进政府实施“学生奶计划”的大 面积推广，提高人民健康水平，增强民族体质：提高乳制品的质量，增加乳制品的消费量和经济 效益，促进我国乳品工业发展；变废为宝，治理环境污染，保护我国环境。因此，乳糖酶将在解 决上述问题中发挥关键作用，并在经济、社会、环保等方面的产生巨大效益。 1 2 国内外现状与研究进展 有关乳糖酶的应用研究，国外从上世纪6 0 年代，国内从8 0 年代进行了广4 泛的研究。到目前 为止，已经报道了一些乳糖酶产酶菌株，并对其诱变育种及产酶优化，分离纯化及酶学性质，酶 的固定化及应用等方面进行了深入的研究。近年来关于乳糖酶的分子生物学方面的研究也很多， 并且已有工程菌问世。 1 2 1 产乳糖酶的微生物 乳糖酶的天然来源十分丰富，包括多种植物、动物和微生物。”1 。由于微生物的快速生长和 高效代谢的生物学特性，使得其成为工业化酶制剂的主要来源，许多霉菌、酵母菌和细菌能产生 乳糖酶。有关乳糖酶的不同来源见表卜1 ： 表1 - 1 乳糖酶的主要来源 t a b l e l 1m a i ns o u t c so f $ - g a l a c t o s i d a s e 主要米源 名称 植物 动物 细菌 酵母菌 霉菌 杏、桃、咖啡、苜蓿、芝麻、玉米、大豆、鹰嘴豆等 脑、肠、皮肽组织 大肠杆菌( e s c h e r c h i ac o l o 、嗜热脂肪芽孢杆菌( b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 、巨人芽孢杆菌 ( b a c d t u sm e g a t e r i u m ) 、德氏乳杆菌保加利皿砸种( l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i is u b s pb u l g a r i c u s ) 、 嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) 、瑞士乳杆菌( l a c t o b a c i u u sh e l v e t i c u s ) 等 乳酸克鲁维酵母( k l u y v e r o m y c e sl a c t i s ) 、脆壁克鲁维酵母( k l u y v e r o m y c e s f r a g i l i s ) 、热带假丝酵 母( c a n d i d ap s e u d o t r o p i c a l i s ) 黑曲霉( a s p e r g i u u sn i g e r ) 、米曲霉似s p e r g i l l u so r y z a e ) 、黄曲霉( s p e r g i u u s f l a v u s ) 、亮白 曲霉( a s p e r g i l l u sc a n d i d u s ) 、臭曲霉( a s p e r g i l l u s f o e t i d u s ) 、米根霉( r h i z o p u so r y z a e ) 、微小毛 霉( m u c o r p u s i l l u s ) 、产黄青霉( p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m ) 等 由于乳糖酶主要用于与人体、健康有关的食品、医药工业等方面，所以生产上使用的菌株必 须是无毒的安全菌株，即必须具有g r a si g e n e r a l l yr e c o g n i z e da ss a f e ) 资格。由于巢曲霉、 米曲霉、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母曾经历过多次试验，在历史上尚未发生过中毒现象， 所以它们是公认的安全菌株，普遍作为1 二业化生产的酶源”4 ”。大肠杆菌的乳糖酶主要用于生化 和分析试剂”1 。当前乳糖酶菌种分离、筛选的研究热点是关于产高温乳糖酶的菌种选育。但是， 产嗜热酶的菌株通常酶活力都比较低。 河北农业大学硕士学位论文 1 2 2 关于诱变育种及产酶优化的研究 为了提高酶的产量，人们从诱变育种和优化产酶条件等方面进行了大量的研究工作。 n v e v a l a i n e n 采用y 射线和亚硝基胍对黑曲霉分生孢子进行了多次诱变，从突变株中筛得一高产 菌株，酶活提高了4 倍左右。李强军利用紫外诱变，经优化产酶后，酶活达到1 2 u m l 1 。李玉 强采用低能离子注入诱变育种技术，选育到一株发酵液酶活力达7 0 0 u l 的乳糖酶生产菌株米曲 霉a - u n 5 1 8 1 。 发酵工艺优化方面，不同碳源对产酶影响很大。李强军研究发现，果胶对黑曲霉乳糖酶的诱 导性很强，其诱导效果远远超过乳糖。对其中可能起诱导作用的物质解析发现，二p 乳糖醛酸比半 乳糖酵酸二聚体诱导性更强“。有机氮源对米曲霉发酵产酶影响根大。此外，添加表面活性剂如 吐温- 8 0 ，烷基酚聚氧乙烯醚等可以提高产酶量、缩短产酶时间。李玉强在优化米曲霉a u n 5 1 8 发酵条件时发现，该菌株在液态培养条件下呈“菌丝球”状，并且菌丝球的形态对产酶影响很大 t a s 1 2 3 关于分离、纯化及酶学性质的研究 乳糖酶的酶学性质包括酶的基本性质、催化特性及酶的底物特异性和反应机制几个方面。不 同微生物来源的乳糖酶酶学性质差异很大，如：最适温度、最适p h 及其稳定性各不相同”1 ，如 表12 所示： 表1 - 2 不同微生物来源的乳糖酶的特性 t a b l e l - 2p r o p e r t i e so f l a c t a s ef r o md i f f e r e n tm i c r o b i a ls o u f c e s 细菌产生的乳糖酶是胞外酶，在培养过程中不能分泌到培养基中，需破壁才能分离、提取。 最适温度较低，通常在4 0 。c 左右，为常温乳糖酶。但耐热细菌乳糖酶的作用温度很高，最高温度 可达9 0 。c 。火肠杆菌产生的乳糖酶研究的最彻底，并己大量应用于生化分析中。因其产量低及可 能的毒性问题，迄今来崩于工业化生产”。 酵母菌乳糖酶通常是胞内酶，分离提取需破碎细胞“。酶的最适温度很低，一般在3 75 c ， 生产中容易污染杂苗：该酶对酸、热不稳定，当存在某些激活离子时，才有最大酶活力。但是， 酵母菌容易培养，液态深层培养条件下可产生大量乳糖酶。同时，酵母乳糖酶的最适口h 近于中 性，与牛乳的天然p h 接近。这些优点掩盖了它的不足，使得酵母乳糖酶得以成功地开发。乳酸 克鲁维酵母和脆壁克鲁维酵母是目前生产乳糖酶的主要酵母菌种。 霉菌产生的乳糖酶是胞外酶，既可以采_ 【 j 固态培养也可以采j t j 液态深层培养米生产，在发酵 4 乳糖酶高产菌株分离筛选、发酵产酶及酶学性质的研究 过程中酶分泌到培养基，发酵成本低、分离提取较为方便。霉菌乳糖酶是高温乳糖酶，最适温度 较高，一般在5 0 c 以上，生产中能够有效防止杂菌污染：对热和酸的稳定性较好，不需要活化离 子和稳定剂，比酵母乳糖酶更适于崮定化酶的制造。目前应用较多的霉菌乳糖酶产生茁是黑曲霉 和米曲霉“。 关于乳糖酶的水解作用机制，w a l l e n f e l s 等人脚1 的研究表明，利用1 3 半乳糖苷酶水解乳糖， 最少包括三个步骤，最后一步变现水解或转移活性。步骤如下： ( 1 ) 酶+ 乳糖卜酶一乳糖； ( 2 ) 酶一乳糖卜半乳糖基一酶+ 葡萄糖； ( 3 ) 半乳糖基一酶+ 受体 半乳糖基一受体+ 酶。 w a l ! e n f e l s 和w e l l f 5 1 根据多年的研究推测了乳糖的水解机制，如图i - 2 所示。 图1 - 2 乳糖酶的永解作用机制 f i 9 1 2t h eh y d r o l y s i sm e c h a n i s mf o rt h ea c t i o no f l a c t a s eo i ll a c t o s e 由图1 - 2 可以看出，b 半乳糖苷酶的活性位点有两个功能团：硫氢基和咪唑基，其中硫氢基 可作为广义酸时半乳糖苷的氧原子质子化，味i 唑基可作为亲核试剂技工半乳糖分子的第一个碳原 子上的亲和中心。当半乳糖苜的受体是水时，发生的是水解；如果受体是糖时，则可以生成三糖 以上的低聚半乳糖。 目前的研究热点在转移反应的机制和底物作用特异性上。不同来源的乳糖酶转糖苷反应的键 特异性差异很火。s t e p h a nr e u t e r 研究发现，米曲霉乳糖酶在1 3 - ( 1 6 ) 键和1 3 - ( 1 4 ) 键连接中，更青 睐丁1 3 - ( 1 6 ) 键的连接。a j i s a k ae t a i 等报道，用米曲霉乳糖酶在类似条件f ，比例为4 ：1 【5 ”。 庄动力学模型方面，不同菌株的转移能力尚有待于深入研究。 1 2 4 关于酶的固定化及酶在生产上的应用 由于同定化酶具有可以反复使用、易于- 底物分离，能实现连续反应等优点，故人们对乳糖酶 河北农业大学硕十学位论文 的固定化进行了火量的研究工作，所用的固定化方法有：( 1 ) 共价交联法；( 2 ) 吸附法；( 3 ) 吸附 交联法；( 4 ) 包埋法：( 5 ) 超滤膜滞留法。国外已经使用固定化酶生产功能性乳制品低乳糖制品， 并应用于政府实旌的“学生奶计划”之中。 当前研究热点是使用固定化酶处理工业废料乳清。生产功能性低聚糖低聚半乳糖。国内外 对此投入了大量的人力物力，以求取得高的g o s 得率。m i g u e 用多微孔的p v c 膜将米曲霉的乳 糖酶固定，使乳清超滤浓缩液连续流过反应器，当乳糖转化率为2 5 4 0 时，可得到较高的 g o s 得率”“。王莜兰报道以壳聚糖同定的乳糖酶，在填充床反应器上的得率最高达6 2 ”“。最 近，秦燕报道采用聚丙烯酰胺凝胶对乳糖酶进行包埋，当a r c ：d i s = 2 0 ：1 时，胶浓度为1 2 5 时， 取得撮佳包埋效果。当乳糖浓度为4 0 ，反应停留4 0 m i n ，g o s 得率可达4 0 口“。 非水相体系对酶转移催化的有一定的影响。高浓度的底物可以提高低聚糖的产率，可是乳糖 浓度提高受溶解度的限制，降低水分活性的另一方法是采用有机溶剂，使用有机溶剂有利于低聚 糖的生成”。归莉琼报道在以环乙烷和乙酸乙酯为有机相主体，以树脂固定化乳糖酶催化反应， 低聚半乳糖得率可达6 4 7 8 口”。对非水相体系中酶的催化行为的改变及反应机制有待于进一步 的研究。 1 2 5 关于酶的分子生物学及工程菌 和其他生物学领域一样，近年来关于乳糖酶分子生物学方面的研究也很多，基冈工程技术的 发展特别是真核表达系统的发展为乳糖酶的生产展示出广阔的前景，并且有工程菌问世。b e r k a 克隆了米曲霉突变株c c c l 6 1 ( a t c c 7 4 2 8 5 ) 的乳糖酶基因，并以该突变株为受体菌，将自身的多 拷贝基因置于g a l a 启动子之下，导入其中，阳性克隆子的乳糖酶蛋白表达量为l m g m l 发酵液， 乳糖酶活性达5 0 0 u i m l 以上，比原始菌提高了1 0 0 倍”。张伟等报道从产酶菌株亮白曲霉中克 隆到乳糖酶基因，并在毕赤酵母中得到表达，表达量近6 肌j “；陈卫、张灏将来源于嗜热脂肪 芽孢杆菌的耐热乳糖酶基因克隆至人肠杆菌中并得到高效表达，酶活力提高了5 0 多倍”“。但由 于乳糖酶主要应用于食品、医药方面，对转基因食品可能存在的潜在危害，各国政府的态度不一， 正处在实验室规模中。 1 3 主要内容和总体目标 有关乳糖酶在食品工业中的应用研究引起了人们的极大关注，已经成为食品生物技术领域的 新热点之一。国外从上世纪6 0 年代，国内从8 0 年代进行了大量的工作，但至今尚未人规模生产， 这主要是”。“：( 1 ) 研究和开发的酶对o n p g ( 邻硝基苯酚b d 一吡喃半乳糖苷) 活性高对乳 糖活性小：( 2 ) 酶的作用温度低，热稳定性差，t 业生产中很容易染菌： ( 3 ) 发酵液酶活低、 提取复杂，成本高。( 4 ) 乳糖酶主要应用于食品、医药方面，对j ：程菌所可能的潜在危害，各固 态度不一，其安全性有待于进一步提高。 在解决这些问题的过程中，高温乳糖酶受到了普遍关注筛选作用温度高、热稳定性好、 对乳糖有较高活性的乳精酶产生菌成为许多研究者的j 作重点l 。本试验从自然界中乳糖酶产 生菌分离入手，对菌株的初筛、复筛及酶活测定方法进行了研究：优化了高产菌株的发酵产酶 6 乳糖酶高产菌株分离筛选、发酵产酶及酶学性质的研究 条件，进一步提高了酶活力；同时，探讨了乳糖酶的基本酶学性质；为乳糖酶的工业化生产建 立技术平台。 本实验研究内容包括以下三个方面： ( 1 ) 从自然界中进行产酶菌株的分离、筛选，比较不同的筛选方法、酶活力测定方法对筛选 的影响；建立快速、准确的筛选方法，客观、快速的酶活力评价方法；对高产苗株进行初步鉴定。 ( 2 ) 研究高产菌株发酵产酶的条件，通过培养基成分和培养条件的优化，确定发酵1 二艺，进 一步提高菌株的产酶活力。 ( 3 ) 对高产菌株的粗酶液进行初步研究，确定乳糖酶的基本的酶学性质。 通过以上内容的研究，预期达到以下结果： ( 1 ) 建立高效、快速的筛选方法以及快速、准确的乳糖酶测定方法，获得高酶活的安全菌株。 ( 2 ) 优化高产菌株的发酵产酶条件，降低发酵成本，进一步提高酶活力。 ( 3 ) 确定乳糖酶的基本酶学性质。 浏北农业大学硕士学位论文 2 1 试验材料 2 1 1 分离源 2 材料与方法 保存菌种：河北农业大学食品科技学院生物工程系提供。 土样、水样、乳样：石家庄三鹿集团，保定新天香乳品公司提供。 2 1 2 试验菌种 黑曲霉a 、b 、c 、d 、e 系列：本实验工作筛选得到。 2 1 3 主要培养基 培养基的配制方法参照文献介绍“删，并加以改进。 富集培养基1 ：乳糖2 ，蛋白胨0 1 ，酵母膏0 1 ，琼脂2 ，1 2 1 灭菌1 0 1 - f i n 后用1 0 的h c l 调p h5 5 。 霉菌富集培养基2 ：以乳糖代替察氏培养基中的蔗糖，1 2 1 灭菌2 0 r n i n 。 初筛培养基：乳糖2 ，蛋白胨0 1 ，( n i - h ) 2 s 0 4 0 1 4 ，k h 2 p o a 0 2 ，c a c l 2 0 0 3 ，m g s 0 4 o 0 3 tt o w e e n - 8 0o ，2 ，琼脂2 o ，f e s 0 45 0 m g m l ，m n s o , 1 6m g m l ，z n s 0 41 4m r 1 1 l ，c o c l 2 2 0 m g m l ，p h 5 5 ，1 2 1 。c 灭菌1 0 m i n 后冷却到6 0 。c ，加入微滤除菌的o 1 o n p g 母液。摇匀后用 灭菌的滴管在超净台上将其加入灭菌的9 6 孔板或o 2 m l 的离心管，每孔或管约0 1 m l ，凝吲后置于 冰箱冷藏备用。 摇瓶复筛培养基：果胶l ，豆车臼粉2 ，玉米浆1 ，k 2 h p 0 4l ，( n h 4 ) 。s o , l ，p h 调至 5 5 ，1 2 1 灭菌l o m i n 。 2 1 4 主要试剂 o n p g ：b b i 进口、上海生物工程有限公司分装 乳糖：北京益利精细化工公司； 葡萄糖测定试剂盒：保定长城试剂公司： 果胶：f l u k a ，s i g m a ： 玉米浆：华北制药厂； 发酵原料：豆粕、花生粕、麸皮均为市售： 表面活性剂：天津东丽区北1 一化_ - l = 助剂厂； 其它试剂均为分析纯和化学纯； 乳糖酶高产菌株分离筛选、发酵产酶及酶学性质的研究 2 1 5 主要仪器设备 f l c 一3 洁净工作台：哈尔滨市东联公司； s p x 一1 5 0 b z 生化培养箱：上海博迅实业公司： p h s 一3 c 数字酸度计：杭州东星仪器设备厂； l d 2 x 一4 0 立式自动灭菌器：上海申安医疗器械厂 h z q q 全温振荡器：哈尔滨市东联公司： 7 2 1 b 分光光度计：上海第三分析仪器厂； m i l i p o r e 超滤系统：日本密理博公司； 2 2 主要试验方法 2 2 1 样品资源的采集 根据乳糖酶产生菌的生态学特点和微生物采样的一般方法“，从石家庄三鹿集团、保定新天 香公司乳品生产车间附近、奶源基地采集了7 1 个土样、水样和乳样。 2 2 2 产酶菌株的分离及初筛 参照文献报道”6 “，并作适当修改，取2 9 样品，加1 8 m l 无菌生理盐水。制成悬浮液。吸取 l m l 上清液稀释至适宜浓度，取o 1 m l 菌液均匀涂布于以乳糖为唯一碳源的霉菌富集培养基，3 0 培养。4 8 h 后，将长出的单菌落转接初筛培养基，3 0 。c 培养3 d 。在超净台中向初筛小管喷洒灭 菌的1 0 n a 2 c 0 3 溶液，静置数分钟；挑取颜色变黄的小管按颜色深浅进行降序排列、编号。依 次转接保存剁面，3 0 。c 培养至孢予成熟，于冰箱4 。c 保藏。 2 2 3 高产菌株的三级复筛 ( 1 ) 一级复筛 将初筛菌株转接斜面活化，待孢子成熟后接种复筛培养基，进行摇瓶发酵，每株一瓶，每瓶 三环。发酵条件为：3 0 * ( 2 ，1 2 0 r p m ，装液量3 0 m l 2 5 0 m l 。三天后测定酶活，以o h a 为一级复筛 指标，筛出o h a 大于2 0 n p g m l 的菌株进入二级复筛。 ( 2 ) 二级复筛 将一级复筛获得菌株制成孢子悬液，调节孢子浓度为1 0 a m l ，接种复筛培养基发酵，每株三 瓶，每瓶l m l 。培养条件同二级复筛，二天后测定酶活。以l h a 为二级复筛指标，筛山l h a 大 于1 5 l a c r r d 的菌株，进入三级复筛。 ( 3 ) 三级复筛 将二级复筛获得菌株进行摇瓶发酵，培养条件同二级复筛。进行酶学性质测定，包括作用温 度及热稳定性、作用p h 及p h 稳定性。以酶活和酶学性质为指标，综合l h a 、o h a l h a ，选 河北农业大学硕士学位论文 取作用温度和p h 较宽的菌株为高产菌株。 2 2 4 乳糖酶活力的测定程序 本试验提出并采用了一种准确、快速的乳糖酶活测定程序，即以o h a 为间接指标、以 o h a l h a 为修正系数代替l h a 的测定方法。 ( 1 ) 以o n p g 为底物的酶活测定 参照文献“2 ，吸取i m l ，o 2 5 o n p g 溶液于试管中，加入2 5 m l 、p h - - 4 、0 2 m 醋酸缓冲 液，5 5 。c 水浴中预热5 m i n ，加入适当稀释的酶液0 5 m l ，继续保温1 5 m i n ，取l m l 反应液加入盛 有l m l 、5 n a 2 c 0 3 溶液的试管中，定容至1 0 m l ，于分光光度计4 2 0 n m 比色。以加热灭活的酶 液同样处理作为空白。 在上述条件下，每分钟水解产生11 1m o l o n p 的酶量定义为1 0 n p g 单位，记为o h a ( o h a = o n p g - h y d r o l y z i n ga c t i v i b ，) 。 ( 2 ) 以乳糖为底物的酶活测定 参照文献”i ，吸取2 m l 、p h = 4 、5 乳糖醋酸缓冲液于试管中，5 5 。c 预热5 m i n ，加入适当 稀释的酶液0 5 m l ，反应1 5 r a i n ，于沸水浴中热处理3 m i n 。吸取l oul 乳糖反应液加入盛有1 5 m l 葡萄糖测定试剂盒的小试管中，3 7 。c 水浴反应1 5 m i n ，于5 0 5 r i m 下测定吸光光度值。以蒸馏水同 样处理为空白管，以加热失活的乳糖水解液同样处理为对照管，以葡萄糖标准液为标准管。 在上述条件r ，每分钟水解产生1i tm o l 葡萄糖的酶量定义为i l z c 单位，记为u 王a ( l h a = l a c t o s e * h y d r o l y z i n ga c f i v i 可) 。 ( 3 ) 计算修正系数o h a l h a 根据( 1 ) ，( 2 ) 结果，计算修正系数o h a i m a 。 0 乳糖酶高产卤株分离筛选、发酵产酶及酶学性质的研究 3 结果与分析 3 1 乳糖酶高产菌株的分离、筛选及鉴定 3 1 ，l 样品来源与产酶菌株的分离结果 从不同生态环境共采集样品7 1 个，从中分离到单菌落7 8 5 个，获得产酶菌株2 2 1 个。不同 分离源菌株结果见表3 - 1 ： 表3 - 1 不同生态环境、不同类型样品的分离结果 t a b l e , 3 - 1t h er e s u l t so f i s o l a t i o n f r o m d i f f e r e n t t y p e s o f d i f f e r e n t b i o l o g i c a ls a m p l e s 注：“+ ”、“+ + ”、“+ + + ”、“+ + + + ”表示颜色逐渐加深，咀下l 司。 从中可以看出，土样和乳样中分离到的菌株数量较多，变黄菌株数多，并且初筛小管黄色较 深。土样中绝大部分菌株来源于乳品加工厂，很少一部分来自奶源基地，可能是由于来源于乳品 加工厂的土样比奶源基地的土样更多的接触牛奶”“。此外，季节对筛菌工作影响很大，春季土样 明显高于冬季土样。酸牛乳比甜牛乳分离出菌株多，且黄色深，估计是酸牛乳中的蔗糖少且呈酸 性，有利于产乳糖酶霉菌的生k 。 样品资源的采集对目标菌株的分离、筛选是至关重要的，它直接影响到试验成败的儿率。采 集适宜目标菌株生态学特点的不同类型样品，能够减少盲目性、提高筛菌成功率，但在实际工作 中最容易被忽视。从本试验工作来看，乳糖酶高产菌株的生态特点主要为：来源于春季、生产历 史长的乳品加工厂的松散、湿润士样和发霉的酸牛乳。 3 1 2 产酶菌株的初筛 以o n p g 为产酶指示物，经过平板分离、o 2 r n le p o n d o l f t u b e s 初筛，从7 8 5 个单菌落中得到 了2 2 l 株培养基颜色变黄的菌株，其中曲霉占大多数，其次为青霉。菌株编号为a 、b 、c 、d 、 e 系列。挑选几株不变色与变色深浅不同的菌株进行摇瓶试验，分别测定o h a 值，试验结果如 表3 - 2 ： 河北农业大学硕士学位论文 表3 - 2 不同菌株小管颜色与摇瓶试验的关系 t a b l e 3 2t h er e l a t i o nb e t w e e nc o l o ro f o 2 m lt u b e sa n di t sl i q u i df e r m e n t a t i o nt e s t sf r o md i f f e r e n ts t r a i n s 菌株 b 1 5 b 1 6 a 1 3b 4 a 3a 5c 5b ia 2d 2 1 8 d 2 2 8d 2 ，3 3 小管颜色 一一一 + + +抖+ + + + + + + + + 摇瓶试验0 0 2 0 0 0 1 90 0 0 00 2 8 90 2 5 20 2 1 20 7 3 8 0 8 2 71