（发酵工程专业论文）微包埋培养技术的建立及其在粘细菌分离纯化中的应用.pdf

、 关于学位论文使用授权的声明 r 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在 论文作者签名： 一1 冬 高莉乞导师签名汤t ，溅 lii|l 一 一 j i 1 3 3 固定化培养技术在粘细菌研究中的应用10 第二章微包埋培养技术的建立1 1 2 1 实验材料与仪器试剂1 l 2 1 1 菌株11 2 1 2 主要培养基12 2 1 3 主要实验试剂1 2 2 1 4 主要仪器设备与耗材1 4 2 1 5 分析软件15 2 2 实验方法15 2 2 1 纤维堆囊菌的培养1 5 2 2 2 微包埋培养技术的优化及应用1 5 2 2 3 纤维堆囊菌基因组d n a 的提取1 8 2 2 4 纤维堆囊菌1 6 sr r n a 序列的测定1 9 2 3 实验结果及讨论2 l 2 3 1 微包埋培养基本条件的建立及优化2 l 2 3 2s 0 0 1 5 7 2 和s 0 1 5 7 2 4 单细胞混合液的分离纯化2 8 2 4 本章小结2 9 第三章微包埋培养技术在纤维堆囊菌突变株分离纯化中的应用3 1 3 1 实验材料31 “ 3 1 1 菌株3 1 3 1 2 主要培养基3 2 3 1 3 主要实验试剂3 2 3 1 4 主要仪器设备及耗材3 2 j v 1 l 1 l 2 3 5 6 6 7 8 8 8 9 ， ， 山东：学硕 j 学位论文 3 2 实验方法 3 2 1 纤维堆囊菌的培养 3 2 2 微包埋培养w 5 3 2 3 2 3 纤维堆囊菌的发酵 3 2 4 发酵产物h p l c 检测 3 3 实验结果及讨论 3 4 本章小结 第四章微包埋培养技术在粘细菌资源开发中的应用初 4 1 实验材料与实验仪器 4 1 1 土样一3 8 4 1 2 菌株3 8 4 1 3 主要培养基3 8 4 1 4 主要实验试剂3 9 4 1 5 主要仪器设备及耗材4 0 4 1 6 软件工具4 0 4 2 实验方法4 1 4 2 1 粘细菌的培养4 1 4 2 2 孢囊杆菌亚目不同属的粘细菌对d k l 6 2 2 的助长4 1 4 2 3 包埋土样进行土壤中粘细菌的分离4 1 4 2 4 凝胶球粒内菌株的分类鉴定4 4 4 2 5 凝胶球粒内菌株的再培养4 8 4 2 6 菌落p c r 4 9 4 3 结果及讨论4 9 4 - 3 1 孢囊杆菌亚目不同属粘细菌对d k l 6 2 2 菌株的助长情况4 9 4 3 2 对土壤悬液进行包埋培养条件的确定5 i 4 3 3 孢囊杆菌亚目不同属的粘细菌作为助长菌株时包埋培养的结果5 6 4 3 4 凝胶球粒内粘细菌的再培养5 8 4 4 本章小结6 1 全文总结6 3 参考文献6 5 致谢6 9 攻读学位期间发表的论文7 0 学位论文评阅及答辩情况表7 1 i i i i v 1 1 1 1 。2 3 5 6 6 7 8 9 1o 13 13 c h a p t e r2 e s t a b l i s h m e n to f m i c r o e n t a p m e n tp r o t o c o li nm y x o b a c t e r i a 1 3 2 1m a t e r i a l sa n de q u i p m e n t s 1 4 2 1 1s t r a i n s 1 4 2 1 ：! m e d i a 1z ：! 1 3r e a g e n t s 1 4 ：! 1 4e q u i p m e n t s 16 2 1 5s o 讯v a r e s 17 2 ：! m e t h o d s 17 2 2 1c u l t u r eo f s o r a n g i u mc e l l u l o s u m 17 2 2 2o p t i m i z a t i o no f m i c r o e n t r a p m e n tc u l t i v a t i o n 17 2 2 3e x t r a c t i o nt h eg e n o m ed no f s o r a n g i u mc e l l u l o s u m 2 0 2 2 41 6 sr r n as e q u c i n go f s o r a n g i u mc e l l u l o s u m 2 1 2 3r e s u l t sa n dd i s c u s s i o n 2 3 2 3 1e s t a b l i s h m e n ta n do p t i m i z a t i o no f m i c r o e n t r a p m e n tc u l t i v a t i o n 2 3 2 3 2i s o l a t i o nt h em i x t u r eo fs 0 0 15 7 2a n ds ol5 7 2 4w i t hm i c r o e n t r a p m e n t c u l t i v a t i o n 3 ( ) 2 4b r i e fs u m m a r y 31 c h a p t e r3 a p p l i c a t i o no fm i c r o e n t r a p m e n t c u l t i v a t i o ni ns e l e c t i n g s o r a n g i u m c e l l u l o s u mm u t a n t s 3 3 3 1m a t e r i a l s 3 3 3 1 1s t r a i n s 3 3 ：；1 ：! m e d i a 3 4 山东，：学硕! 学伫t j = 3 1 3r e a g e n t s 3 4 3 1 4e q u i p m e n t s 3 4 3 2m e t h o d s 3 4 3 2 1c u l t u r eo f s o r a n g i u mc e l l u l o s u m 3 4 3 2 2c u l t u r ew 5 3 2w i t hm i c r o e n t r a p m e n tc u l t i v a t i o n 3 5 3 2 3f e r m e n t a t i o no f s o r a n g i u r nc e l l u l o s u m 3 5 3 2 4h p l ca s s a y j ) 3 。3r e s u l t sa n dd i s c u s s i o n 3 6 3 4b r i e fs u m m a r y 3 7 c h a p t e r4 a p p l i c a t i o n o fm i c r o - e n t r a p m e n tc u l t i v a t i o n i nt h e e x p l o i t a t i o n o f m y x o b a c t e r i a 3 9 4 1m a t e r i a l sa n de q u i p m e n t s 4 0 4 1 1s o i ls a m p l e 4 0 4 1 2s t r a i n s 4 0 4 1 3m e d i a 4 0 4 1 4r e a g e n t s 4 1 4 1 5e q u i p m e n t s 4 2 4 1 6s o f t w a r e s 4 2 4 2m e t h o d s 4 3 4 2 1c u l t u r eo f m y x o b a c t e r i a 4 3 4 2 2s t i m u l a t i o n st od k l6 2 2f r o md i f f e r e n tg e n u s e s 4 3 4 2 3i s o l a t i o no fm y x o b a c t e r i af r o ms o i lw i t hm i c r o - e n t r a p m e n tc u l t i v a t i o n 4 3 4 2 4c l a s s i f i c a t i o no fs t r a i n si ng e lb e a d s 4 6 4 2 5s u b c u l t u r eo fc e l l si ng e lb e a d s 5 0 4 2 6c o l o n yp c r ，l 4 3r e s u l t sa n dd i s c u s s i o n 5 l 4 3 1s t i m u l a t i o n st od k l 6 2 2f r o md i f f e r e n tg e n u s e s 5 1 4 3 2o p t i m i z a t i o no fm i c r o e n t r a p m e n t c u l t i v a t i o ni nm y x o b a c t e r i a e x p l o i t a t i o n 5 3 4 3 3m i c r o e n t r a p m e n tc u l t i v a t i o nw i t hd i f f e r e n tm y x o b a c t e r i u ma sh e l p e r 5 8 4 3 4s u b c u l t u r eo f c e l l si ng e lb e a d s 6 0 4 4b r i e fs u m m a r y 6 3 s u m m a r y o ) r e f e r e n c e s o ， a c k n o w l e d g e m e n t s ，i 山东久学硕 ：学位论史 中文摘要 社会性的粘细菌在生长过程中呈现出聚团生长和细胞密度依赖性等社会性 行为。具体表现为，当细胞的接种密度低于1 0 c e l l s m l 时，细胞不能在新的环境 中生长起来，而细胞一旦生长起来，大量的细胞聚集在一起形成一个个紧密的菌 团。粘细菌这种协同成长的特性严重限制了粘细菌的分离纯化工作，如纤维堆囊 菌埃博霉素生物合成改造后期突变株的分离纯化。 在本文的工作中，我们以s a c a c l 2 体系为基础进行包埋条件的优化，建立 了以1 2 s a 为凝胶介质，2 s r c l 2 为交联剂的包埋体系。通过此体系，我们制 备得到了为直径为1 2 士0 5m i l l 的凝胶球粒，其中约8 0 的凝胶球粒直径为l m m 以内；每毫升s a 凝胶可制备1 5 0 0 2 5 0 0 个球粒。将分散至单细胞状态的纤维堆 囊菌细胞包埋在海藻酸锶凝胶球粒中。通过控制单细胞悬液的浓度及凝胶球粒的 直径及数目，实现了对单个纤维堆囊菌细胞的包埋。通过与高浓度、未包埋的纤 维堆囊菌细胞共同培养，最终实现了凝胶球粒内单个细胞的生长。含有细胞的凝 胶球粒在高浓度磷酸盐的平板上溶胀后，通过将其转接到正常的培养基上，实现 了对内部细胞的扩大培养，从而获得了纯化的单克隆。应用此方法，我们将预先 混合的、同源性为9 9 的两株纤维堆囊菌进行分离。随机挑选的18 个凝胶球粒 内的细胞经1 6 sr r n a 测序证实，球粒内部生长起来的细胞为同种细胞。由此， 我们实现了对纤维堆囊菌混合培养物的分离纯化。此技术一方面利用海藻酸盐凝 胶介质的交联结构将细胞限定在一定的空间内，阻断了纤维堆囊菌细胞生长过程 中的粘连聚集；另一方面，通过将包埋有单细胞的凝胶球粒与未包埋的高浓度细 胞共同培养，利用凝胶介质形成的交联网孔允许细胞生长所需要的生长起始因子 自由通过的能力，帮助凝胶球粒内极低密度的细胞克服细胞密度依赖性而顺利生 长增殖。 在建立的微包埋培养技术的基础上，我们以纤维堆囊菌野生菌株作为助长菌 株，对实验室前期得到的埃博霉素生物合成改造突变株进行包埋纯化。随机挑选 4 株经包埋培养得到的突变株进行e p o t h i l o n e 产量检测，得到了具备突变株遗传 特性的、埃博霉素产量存在显著差异的单克隆。该技术克服了纤维堆囊菌突变株 传统分离纯化过程中纯化效率低下且耗时较长的弊端，将大大加快纤维堆囊菌次 级代谢途径 粘细菌 有许多的局 在许多情况 受到其它快 埋培养技术 作为助长菌 目特异性探 列( 4 4 8 b p ) 了大量溶细 粘细菌。对 鉴定后再次证实我们得到了新的粘细菌菌株。微包埋技术在开发土壤中尚未培养 的粘细菌资源工作上可能具有重要的应用潜质。由于目前人工培养方法的限制， 我们仅得到了部分菌株的可培养形式。 关键词：粘细菌；纤维堆囊菌；凝胶球粒；纯化；资源开发 i i 山东- ：学面：! 。学位论文 a b s t r a c t t h em y x o b a c t e r i as h o wt y p i c a ls o c i a lb e h a v i o r s ，s u c ha sc e l ld e n s i t y - d e p e n d e n t g r o w t hp a t t e r n sa n dg r o w i n gc l o s et o g e t h e r w h e nt h ei n o c u l u mi sb e l o w10 5c e l l s m l ， i ti sd i f f i c u l tf o rt h ec e l l st oi n i t i a t eg r o w t h ? b u to n c et h e yg r o wu pf r o mas t r o n g i n o c u l u m ，t h e yw i l lp a c kc l o s e l yt o g e t h e r t h e i rc h a r a c t e r i s t i co fc o m p l e xc o o p e r a t i v e g r o w t hh a sb e e nab a r r i e rf o rs e p a r a t i n gm y x o b a c t e r i a ，i n h i b i t i n gt h es e l e c t i o no f s o r a n g i u mc e l l u l o s u mm u t a n t sd u r i n gt h eg e n e t i ce n g i n e e r i n go ft h ee p o t h i l o n e b i o s y n t h e t i cg e n ec l u s t e r , f o re x a m p l e i nt h i sw o r k ，w eu s e ds o r a n g i u mc e l l u l o s u ma sam o d e l as i n g l es c e l l u l o s u m c e l le m b e d d e di n t oa l g i n a t eg e lm i c r o - b e a d s ( d i a m e t e ro ff o r m a t i v eb e a d s ：1 2 士0 5 i t l i n ) w a sa b l et ob et r i g g e r e dt of o r ms i n g l e c e l lc o l o n i e sw h e nt h eb e a d sw e r e c o i n c u b a t e dw i t hah i g hc o n c e n t r a t i o no fu n p a c k e ds c e l l u l o s u m t h eb e a d sw e r e d i s s o l v e do nm e d i u mc o n t a i n i n gah i g hc o n c e n t r a t i o no f p h o s p h a t e ，a n dt h er e l e a s e d m i c r o 。c o l o n i e sw e r ef u r t h e rc u l t u r e di nn o r m a lg r o w t hm e d i u mt oo b t a i np u r i f i e d c l o n e s t h e d e v e l o p e dp r o t o c o lw a se f f i c i e n t a t s e p a r a t i n gm i x e dc u l t u r e s o f s c e l l u l o s u ms t r a i n st h a tw e r ei s o l a t e df r o mt h es a m es o i ls a m p l ea n dw e r eh i g h l y s i m i l a r o nt h eo n eh a n d ，t h i st e c h n o l o g ym a k e su s eo ft h eg e lm a t r i xt ol i m i tt h e c l u s t e r i n go fs c e l l u l o s u mc e l l sd u r i n gg r o w t h ；o nt h eo t h e rh a n d ，t h ec r o s s 1 i n k e d s t r u c t u r e st h a ta r ef o r m e dp e r m i tt h ep e n e t r a t i o no fn u t r i e n t sn e c e s s a r yf o rg r o w t h w i t ht h eh e l po ft h eu n p a c k e ds c e l l u l o s u mc e l l so u t s i d eo ft h eb e a d s ，t h es i n g l ec e l l i nt h eg e lb e a ds u c c e e d sa to v e r c o m i n gt h ec e l l - d e n s i t y r e q u i r e m e n ta n dg r o w su pi n t o ac o l o n y w ep r e d i c tt h a tt h i sm e t h o dw i l lb e c o m es t a n d a r df o r o b t a i n i n gs i n g l e c o l o n i e sf r o mc o o p e r a t i v e l yg r o w i n gm y x o b a c t e r i a o nt h eb a s i so ft h ed e v e l o p e dm e t h o d ，w ep u r i f i e das c e l l u l o s u mm u t a n tt o o b t a i ns i n g l ec o l o n i e su s i n gas c e l l u l o s u mw i l d t y p es t r a i na st h eh e l p e r i n t e r e s t i n g l y , w eo b t a i n e ds i n g l ec o l o n i e sw i t ht h eg e n e t i ct r a i t so ft h em u t a n t h p l cr e v e a l e dt h a t t h ec o l o n i e sw ep u r i f i e dh a ds u b s t a n t i a ld i f f e r e n c e si nt h ep r o d u c t i o no fe p o t h i l o n e i i i s t r a i n sf r o mt h es a m es o i ls a m p l e u n f o r t u n a t e l y , a f t e rs e v e r a la t t e m p t st oc u l t u r et h e s t r a i n sf r o mt h eb e a d s ，w ef o u n dt h e r ew e r eo n l yaf e ws t r a i n st h a tc o u l db ec u l t u r e d w i t hs t i m u l a t i o no ft h eh e l p e r s e q u e n c i n go ft h ee n t i r e16 sr r n ag e n es u g g e s t e dt h a t t h es t r a i n sf r o mt h eg e lb e a d sw e r en o v e lm y x o b a c t e r i as t r a i n s t h ed e v e l o p e d p r o t o c o lw i l lm a k e i tp o s s i b l et oe x p l o i tn o v e lu n c u l t u r e dm y x o b a c t e r i a k e yw o r d s ：m y x o b a c t e r i a ；s o r a n g i u mc e l l u l o s u m ；g e lb e a d s ；p u r i f y ；r e s o u r c e s e x p l o i t a t i o n i v d n t p e b e d t a h h p l c d e o x y r i b o m u c i e o s i d et r i p h o p h a t e e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n e t e t r aa c e t i ca c i d h o u r h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y i p t g i s o p r o p y ld - d - 1 一t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e i s k s l b m l n n r p s o r f p b s p c r p k s r p m s s a i n s e r ts e q u e n c e 1 3 - k e t o a c y l - a c ps y n t h a s e l 嘶a b e r t a n im e d i u m m i n u t e n o n r i b o s o m a lp e p t i d es y n t h e t a s e o p e nr e a d i n gf r a m e p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y k e t i d es y n t h a s e r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e s e c o n d s o d i u ma l g i n a t e 酶 脱氧三磷酸核糖核苷 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 小时 高效液相色谱 异丙基- 岱- d 硫代半乳 糖苷 插入序列 p 一酮酰- a c p - 合酶 l b 培养基 分钟 非核糖体肽合成酶 开放阅读框 磷酸缓冲液 聚合酶链式反应 聚酮合酶 每分钟转数 秒 海藻酸钠 v 山乐：学f l i 。学位论文 u v x - g a l v l u l t r a v i o l e ts p e c t r u m紫外光谱 5 溴4 氯3 吲哚 5 - b r o m 。- 4 - c h l 。r o i n d 。1 y l p - d g a l a d 。s i d e p d 半乳糖苷 簟， 一 - _ j 细胞形为的革兰氏阴性细菌， 它们所具有的滑行运动( g l i d i n gm o t i l i t y ) 的特性使它们的克隆呈现出扩展的薄 菌膜( s w a r m ) 。饥饿的情况下，粘细菌的营养细胞聚集在一起，通过细胞的定 向运动形成子实体( f r u i t i n g b o d y ) 。粘细菌的子实体呈现出不同的复杂性，其典 型大小为5 0 5 0 0 “m ，肉眼即可观察到。在成熟的子实体中营养细胞变成短的粘 孢子( m y x o s p o r e ) 。由于粘孢子具有很强的抗逆性，粘细菌可以顺利渡过不良的 生存环境。 1 1 1 滑行运动 粘细菌广泛分布在各种类型的土壤中，尤其在接近中性( 即口h5 8 ) 的土 壤中数量和种类最为繁多，也可以在朽木、树皮、地衣和草食动物的粪便等腐物 上生长【，偶尔也可在植物叶片表面发现粘细菌【4 1 。由此可以理解，粘细菌不可 能像水环境中的它种细菌一样依靠鞭毛运动。滑行运动被认为是粘细菌适应其生 存环境的一种策略。粘细菌在滑行运动粘细菌形成薄而扩展的菌落，这种运动同 时伴随着细胞的弯曲和粘液的分泌。滑行运动细胞会产生粘液痕迹，m y x o c o c c u s x a n t h u s 的细胞在固体介质表面沿细胞长轴方向运动。通过对突变株的研究揭 示，黄色粘球菌的运动由两个独立的遗传系统调控：a 运动系统，调控单独的个 体细胞运动；s 运动系统，调控菌落和聚集过程中细胞群体的运动 5 】。s 运动有利 于多细胞行为的发生，如子实体的形成等。 1 1 2 捕食 粘细菌可以降解大分子物质，如蛋白质、纤维素、肽糖苷、脂肪等；同时， 粘细菌可以降解原核生物或真核生物完整的细胞和它们的亚细胞组分。粘细菌能 够分泌一系列的水解酶，它们的生长受细胞周围酶的局部浓度和水解产物扩散程 度的影响。在对m x a n t h u s 研究中发现，当提供大分子营养物质时，粘细菌表现 1 山东j i 学硕j 二，j r , t , 位论文 出“w o l fp a c k ”的群体行为【1 】。研究人员通过维持不同的m x a n t h u s 细胞浓度， 对其营养物质进行优化时发现，当以蛋白质水解物质代替大分子时， m x a n t h u s 可以在较低的接种浓度下正常生长起来，但是它只能在高浓度细胞时才能利用等 量的大分子物质 3 】。这一系列的捕食行为正是靠粘细菌的特征性菌膜运动来实现 的，而对粘细菌形成的子实体内部的粘孢子来说，该抗逆结构正是维持了其高浓 度的局部细胞的结构，这点成为粘细菌能够在营养条件改善时迅速萌发捕食的 关键【1 1 。 1 1 3 社会学行为 原核生物的细胞行为主要是单细胞的活动。在较为复杂的类群中，也涉及细 胞的群体行为。其中，粘细菌( m y x o b a c t e r i a ) 表现得尤为突出，包括细胞的摄食、 运动、多细胞形态的发生( 子实体的发育和粘孢子的形成) 等都具有很强的社会性 ( s o c i a l i t y ) 6 1 。随着人们对于粘细菌的多细胞形态发生及其分子调控机制的较为深 入的了解【7 】，在试图揭示其滑行运动机制的过程中，越来越多的证据表明，粘细 菌的滑行运动在其多细胞形态发育和社会学行为中起到了十分重要的作用，成为 一个新的研究热点。 相互协作的运动行为是基于胞内和胞外相互作用的结果，对m x a n t h u s 细胞 表面结构和胞外附属物的研究证明了这一点。对脂多糖合成的干扰使m x a n t h u s 细胞丧失了a 运动的能力，胞外附属物一般只在细胞的一极出现，如菌毛和纤 毛被认为通过细胞和细胞间的相互作用在保持细胞成群过程中有重要作用。部分 胞外基质是由细胞外膜上的菌毛构成的，当细胞浓度增高导致细胞间紧密联系 时，能够增加菌毛的形成】。协同运动的另一个现象是波浪状行进，并产生波纹 图案【8 】，这是由同步向前运动的细胞堆积而成，并以2g m m i n 的最大速度向前 行进。添加肽聚糖或其亚组分可诱导产生这种运动行为。 在粘细菌细胞的群体行为中，子实体的发育和粘孢子的形成最为引人注目。 当粘细菌处于饥饿、干旱等不利环境时则启动多细胞结构的分化，在固体表面上 逐步发育为肉眼可见、颜色鲜艳的子实体。子实体的大小一般在5 0 5 0 0 9 m ，颜 色可能为白色、棕色、亮黄色、桔色、红色或淡紫色。同时在其内部形成粘孢子 ( m y x o s p o r e ) 。小孢子囊和子实体的形状、大小、颜色等是粘细菌种的鉴定特征。 2 t t 、 山东：学硕j ：学位论文 子实体的形成可被营养物质的缺乏所诱导，并被营养物质浓度、p h 值、阳 离子和温度所控制【6 。它是一个营养细胞群协同作用的形态发生过程。子实体的 形成过程包括以下几个步骤：( 1 ) 大量的细胞群在形态发生过程中失去其自身 特性；( 2 ) 杆状营养细胞停止生长；( 3 ) 在菌落的特定位置，细胞聚集形成聚 集体；( 4 ) 细胞表面分子使细胞粘在一起；( 5 ) 大约有6 5 - - 9 0 f l 勺无组织粘合 的细胞发生自溶；( 6 ) 开始形成子实体的特殊结构元件( 茎，底盘，小孢子囊 壁) ；( 7 ) 特定形状的子实体形成；( 8 ) 在成熟期，杆状的营养细胞经过胞内 的形态发生转变成为各种形状的粘孢子【l 西】。粘细菌的粘孢子具有较强的抗性， 它耐热，抗干燥、辐射和去污剂。粘孢子在土壤中可存活1 0 年以上，是典型的休 眠体，可作为分离和保存粘细菌的理想材料。在最佳条件下，子实体的形成需要 1 2 1 4 h ，而对其内部的调节过程目前还知之甚少。 粘细菌尽管在系统分类上属于细菌，但更接近真核生物，它表现出与真核生 物更多的相似性，分化发育过程中涉及的细胞之间的信号传导模式也更接近真核 生物。因此粘细菌可作为研究信号调控的理想体系。对粘细菌多细胞形态发生分 子调控的研究，不但对认识原核生物的细胞分化发育，而且对理解生命的进化过 程、真核生物的细胞行为和分化发育的分子调控等具有重要意义。 1 1 4 细胞密度依赖性及聚集生长 粘细菌的社会性细胞行为不仅存在于其运动和发育过程中，在生长阶段的突 出表现就是细胞密度依赖性生长( c e l l - d e n s i t yd e p e n d e n tg r o w t h ) 。在生长起始阶 段如果以较高的浓度( 1 0 5 c e l l s m 1 ) 接种到营养丰富的液体培养基中时，细胞能 够以一定的速率生长繁殖；但是当以较低浓度接种时，细胞生长的停滞期大大延 长甚至最终导致细胞死亡。 粘细菌通过协同生长降解包括其他细胞在内的大分子有机物来获得生长所 需要的碳源、氮源和能源【9 1 。粘细菌能够产生大量的溶细胞性裂解酶和蛋白水 解酶类】。研究人员对m x a n t h u s 的研究中发现，m x a n t h u s 在以大分子不溶性的 蛋白质c a s e i n 为唯一氮源时表现出明显的细胞密度依赖性；当细胞的接种量小于 1 0 5 c e l l m l 时，细胞的生物量不会增加。如果培养基中含有水解的c a s e i n ( c a s i t o n e ) ， 细胞可生长的最低接种密度明显降低，但此时生长速率没有明显的变化【3 】。这一 山东人学f 吸 学位论义 点说明细胞外降解不溶性大分子c a s e i n 的蛋白酶与细胞密度存在直接关系。这可 能意味着，粘细菌以缓慢的滑行运动实现了细胞之间的接触，由此形成了细胞紧 密聚集的菌膜( s w a r m ) ，依靠这种形式的运动和捕食恰怡维持了细胞周围较高 的局部胞外酶浓度，这样粘细菌细胞利用一个群体潜在的能量可以高效产生大量 的胞外酶，在局部达到较高酶浓度的同时又最低限度地减少了其扩散【l0 1 。对 m x a n t h u s 胞外酶的系列研究也说明粘细菌可能利用较为复杂的胞外基质对蛋 白进行绑定、变性、水解，从而为自己提供营养物质【l 厶1 3 】。 由于较低的接种量而导致的延滞期延长甚至细胞不能在新环境中生长的现 象在其他种类的细菌中也普遍存在。接种到新环境中的细胞由于要适应新的环 境，细胞的代谢活