（生物医学工程专业论文）各种纳米材料对聚合酶链式反应的优化及其机理的研究.pdf

【 p h d d i s s e r t a t i o ns u b m i t t e dt os h a n g h a ij i a ot o n gu n i v e r s i t y t h es t u d yo ft h ei m p r o v e m e n to fv a r i o u s n a n o m a t e r i a l so np c ra n dt h e i rm e c h a n i s m s c l a s s ：a 0 6 0 8 0 9l n u m b e r ：0 0 6 0 8 0 9 013 a u t h o r ：c a ox u e y a n a d v i s o r ：p r o f h uj u n s p e c i a l t y ：b i o m e d i c a le n g i n e e r i n g s c h o o lo fl i f es c i e n c ea n db i o t e c h n o l o g y s h a n g h a ij i a ot o n gu n i v e r s i t y s e p 2 1 s t ，2 0 0 9 - _ _ _ 舞 附件四 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：魄睡 日期：堋年7 月毒ie l 矗 附件五 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上方框内打“ ) 学位论文作：怖 指剥嗽： 懒 日期：加年7 , q - - 1 日 日期：冽年7 月f 日 鼻 上海交通大学博士学位论文答辩决议书 所在 姓名曹雪雁学号 0 0 6 0 8 0 9 0 1 3 生物医学工程 学科 指导教师胡钧 答辩 2 0 0 9 0 9 21 答辩 上海交通大学闵行校区生物楼2 号楼2 1 1 室 日期 地点 论文题目 各种纳米材料对聚合酶链式反应的优化及其机理的研究 曹铞驻毒范地研冼j 多种钠彰科对f c r 向害啕哥行5 枷珐挥讨逑 放鬻瘩论童弘得了下委舱镌是，i 避皇j 僦沁p 伙酗纳季耐矸丹函乃臣j2 夏 勰楚燃鸳黯鬻当勰黝瓣霜名 软七尘芗晴材料则能闭 - i 叶占饪极司钧聚舍醇也可7 f 用恢列f ；刀耵p 朋吓1 ：粼论文童孳新疑石创新性钵死j1f有舢誓确跫翟阢!狐二i!兰：i： 一众同专也也论文譬辫音边议授亍博掣y 严 加7 年| 月z i e l 职务姓名职称单位签名 主席 董亚明教授上海师范大学 一，蔼别 答 委员黄庆研究员中科院上海应用物理研究所 饭辩 委 委员 史向阳教授东华大学 (啦研一 员 会 委员郭守武 教授上海交通大学 夏埒死 成 事侈阜 员 委员刘建华教授上海交通大学 签 委员 名 委员 秘书 李鑫辉工程师上海交通大学谢 摘要 各种纳米材料对聚合酶链式反应的优化及其机理研究 摘要 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 是一种在体外模拟 体内d n a 复制的核酸扩增技术。该技术是目前最常用、也最重要的分子生 物学技术之一。然而，一些瓶颈问题限制了p c r 技术的进一步发展，如复 杂背景下产物特异性的问题、扩增效率的问题等。鉴于现有的优化剂的单 效性及副作用，需由新的技术理论和途径寻找可改进p c r 技术的物质。纳 米材料是一类具有特殊性能的、尺度为纳米级的新型超细材料。纳米材料 的概念形成于8 0 年代中期，由于纳米材料会表现出特异的光、电、磁、热、 力学、机械等性能，逐渐成为世界各国研究开发的重点，在信息存储、催 化、光吸收、发光、医药等领域展示了广泛的应用前景。能否利用纳米结 构催化或调控p c r 反应是一个值得尝试的选择。 本研究组在前期研究中发现，纳米金颗粒参与的p c r ( n a n o p a r t i c l e p c r ，n p p c r ) 能够显著提高产物特异性等p c r 的关键指标，纳米材料是 否均具有调控p c r 过程的作用是个值得探讨的问题。基于这点考虑，本论 文以再扩增体系和大鼠t h y 1 基因体系为筛选平台，对多种纳米材料的优 化作用进行了评估。 第1 页 摘要 研究结果表明：1 ) 纳米材料对p c r 过程的调控具有普遍性，但随物质 不同，调控能力有所差异。如金属单质纳米材料、金属氧化物纳米材料、 非金属单质纳米材料、非金属氧化物纳米材料及树枝状聚合物( d e n d r i m e r ) 对p c r 反应均有很好的优化作用，其中纳米碳粉和表面5 0 乙酰化的第五 代树枝状聚合物优化效果尤其显著。2 ) 纳米材料对p c r 的调控作用主要是 通过与生物分子之间相互作用实现的。在p c r 环境中，采用目测胶体溶液 颜色变化、p c r 扩增、紫外吸收变化和p c s 测量粒径变化等方法研究了纳 米材料和p c r 各组分的作用。并且分别研究了硬性纳米材料( 纳米金、纳 米碳粉、纳米二氧化钛等) 和软性纳米材料( 树枝状聚合物) 可能的作用， 提出了两种假设。硬性纳米材料更倾向于与d n a 聚合酶的静电相互作用， 我们认为这可以对p c r 反应体系中参与扩增的酶的用量进行调节，从而实 现对p c r 非特异性扩增的优化。而软性纳米材料能同时与模板、引物、酶 作用。我们推测d e n d r i m e r 能提高局部p c r 组分的浓度，从而增加了扩增 反应的可能性，提高扩增效率；在引物退火或者延伸阶段初期“引物一酶 一模板 复合物形成的时候，d e n d r i m e r 可能与模板、引物、酶有竞争作用， 促进了反应的特异性。 上述工作的完成将为今后拓展纳米材料在临床检测和诊断中的应用及 纳米材料在其他更广泛的生物领域的应用提供实验基础。 关键词：纳米材料，d e n d r i m e r ，纳米p c r ，优化，作用机制 a b s t r a c t t h es t u d yo ft h ei m p r o v e m e n to fv 久r i o u s n a n o - m a t e r l o u so np c ra n dt h e i rm e c h a n i s m s a b s t r a c t p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ( p c r ) i sa l li nv i t r od n aa m p l i f i c a t i o n t e c h n o l o g y p c rc o m e si n t oo n eo ft h em o s tc o m m o na n di m p o r t a n tm o l e c u l a r b i o l o g i c a lt e c h n i q u e si nt h el a s tt w e n t yy e a r s h o w e v e r , t h i st e c h n o l o g ys t i l l f a c e ss e v e r a l b o t t l e n e c k s ，e g t h el o wy i e l d ，l o ws e n s i t i v i t y , t h el o w s p e c i f i c i t y , e t c i ti sp r o v e nt h a tb ya d d i n ga d d i t i v e s ，s o m en o n s p e c i f i ca m p l i f i c a t i o n p r o b l e m sc o u l db es o l v e dt oc e r t a i ne x t e n t h o w e v e r , f i n d i n gn e wa d d i t i v e st o e n h a n c et h es p e c i f i c i t ya n de f f i c i e n c yo fp c ri ss t i l lv a l u a b l ea n dr e m a i nag r e a t c h a l l e n g e n a n o - m a t e r i a li sd e f i n e da sas o l i dm a t e r i a lc h a r a c t e r i z e db ya tl e a s t o n ed i m e n s i o ni nt h en a n o m e t e r r a n g e n a n o m a t e r i a l sa r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t w i t ho t h e rm a t e r i a l sb e c a u s eo ft h e i rs p e c i a l p r o p e r t i e ss u c h a sr e a c t i v i t y , s t r e n g t ha n de l e c t r i c a lp r o p e r t i e s ，o p t i c a lc h a r a c t e r i s t i c s s i n c et h em i d d l eo f 19 8 0 s ，n a n o m a t e r i a l sh a v eb e e nu s e di nw i d e p o t e n t i a lp r o s p e c t sa b o u t i n f o r m a t i o ns t o r a g e ，c a t a l y s t s ，p h o t o a b s o r p t i o n ，b i o m e d i c i n e ，e t c i nt h ep r e v i o u sw o r k ，o u rg r o u pr e p o r t e dt h eo p t i m i z a t i o no fp c rb y a d d i t i v en a n og o l d ，w h i c hc o u l dc o n s p i c u o u s l yi m p r o v et h ek e yc h a r a c t e r so f 第m 页 a b s t r a c t p c rq u a l i t y , e g t h es p e c i f i c i t y w h e t h e rs a n e m a t e r i a l sh a v et h ef u n c t i o no f i m p r o v i n gp c rp r o c e s si sw o r t h yo fd i s c u s s i o n i n t h i st h e s i s ，w ee x p l o r e v a r i o u sn a n o - m a t e r i a l sa ss p e c i f i c i t ya n de f f i c i e n c ye n h a n c e r si np c r , i n c l u d i n g h a r dn a n o - m a t e r i a l s ( a u - n a n o p a r t i c l e s ，c a r b o n - n a n o p a r t i c l e s ，t i 0 2 一n a n o p a r t i c l e s ， e t c ) a n ds o t tn a n o m a t e r i a l s ( d e n d r i m e r ) t w ot e s ts y s t e m si n c l u d i n ga n e r r o r - p r o n e t w o r o u n dp c ra n dan o n s p e c i f i ca m p l i f i c a t i o ns y s t e mw e r e e m p l o y e di nt h i ss t u d y w ef o u n dt h a ti nt h ep r e s e n c eo ft h en a n o m a t e r i a l sw i t ha p p r o p r i a t e c o n c e n t r a t i o n s ，p c ra m p l i f i c a t i o nc a nb eo p t i m i z e dt oe n h a n c eb o t hs p e c i f i c i t y a n de f f i c i e n c y w ei d e n t i f i e dn a n oc a r b o na n do n eo fd e n d r i m e r s d e r i v a t i v e s ( g 5 5 0 a c ) w e r ee s p e c i a l l yp o t e n te n h a n c e r s ，o f t e no u t p e r f o r m i n gc o n v e n t i o n a l e n h a n c e r i na d d i t i o n ，w es t u d i e dt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nn a n o - m a t e r i a l sa n d p c rc o m p o n e n t si nr e a lp c rc o n d i t i o nu s i n gm a n ym e t h o d s w ef o u n dt h a t h a r dn a n o m a t e r i a l sw e r et e n dt oi n t e r a c tw i t hd n a p o l y m e r a s e ，w h i l es o f t n a n o - m a t e r i a l sc o u l dh a v ei n t e r a c t i o nw i t hd n a p o l y m e r a s e ，p r i m e r sa n d t e m p l a t e a tt h es a m et i m e w es u p p o s e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no fd n a p o l y m e r a s ec o u l db ea d ju s t e db yi n t e r a c t i n gw i t hh a r dn a n o - m a t e r i a l s ，t h e r e b y s i g n i f i c a n t l yi m p r o v i n gt h es p e c i f i c i t yo fp c r o n t h eo t h e rh a n d , w et h o u g h t s o f tn a n o - m a t e r i a l sc o u l dg r e a t l yc o n d e n s et h ec o n c e n t r a t i o n so fav a r i e t yo f p c r c o m p o n e n t sl o c a l l yt oi n c r e a s et h ee f f i c i e n c yo fa m p l i f i c a t i o n ；i tw a sa l s o 第页 a b s t r a c t p o s s i b l e t h a t c o m p e t i t i o nm i g h t o c c u rb e t w e e n p r i m e r s ，t e m p l a t e ，d n a p o l y m e r a s ea n ds o f tr a r e - m a t e r i a l sd u r i n gt h ea n n e a l i n go ft h ep r i m e r st ot h e t e m p l a t eo rd u r i n gf o r m a t i o no ft h es y n t h e s i sc o m p l e xc o n s i s t i n go fp r i m e r , t e m p l a t ea n dd n ap o l y m e r a s e ，t h e r e b ye n h a n c i n gt h es p e c i f i c i t yo fp c r t h e t h e s i sw o r ks h o w st h a tn a n o - m a t e r i a l sa r e v e r y u s e f u li n e n h a n c i n gt h e s p e c i f i c i t ya n de f f i c i e n c yo fp c r , a n dh a sp r o v i d e dt h ee x p e r i m e n t a lb a s i sf o r b r o a d e n i n gt h ea p p l i c a t i o no fn a n o m a t e r i a l si nc l i n i c a lt e s ta n dd i a g n o s i s k e y w o r d s ：n a n o - m a t e r i a l s ，d e n d r i m e r , n p - p c r , o p t i m i z a t i o n ，m e c h a n i s m s 第v 页 目录 摘要。 a b s t r a c t 第一章绪论 目录 i i i 1 1 1 纳米材料。l 1 1 1 纳米粒子的特性2 1 1 2 纳米材料在生物技术中的应用6 1 2 聚合酶链式反应概述9 1 2 1p c r 技术基本原理1 0 1 2 2p c r 技术优化方法简介1 l 1 3 纳米材料在p c r 应用中的研究进展1 6 1 3 1 纳米材料对p c r 扩增的优化1 6 1 3 2 纳米材料优化p c r 的机理研究2 0 1 4 本论文的研究目的和意义2 3 i 4 1 研究意义2 3 1 4 2 研究目标2 4 1 4 3 章节安捧2 4 参考文献2 5 第二章纳米材料的筛选 3 2 2 1j ；l 言3 ：1 2 2 材料及方法3 3 2 2 1 纳米材料3 3 2 2 2p c r 相关试剂3 8 2 2 3 主要器材3 8 2 2 4p c r 筛选体系3 9 2 2 5 纳米材料用量的优化4 0 2 2 6 检测和评估方法4 0 2 3 结果4 1 目录 2 3 1 纳米材料对再扩增体系的影响4 l 2 3 2 纳米材料对大鼠t h y l 基因体系的影响4 5 2 4 讨论4 7 2 5 本章小结4 8 参考文献一4 9 第三章硬性纳米材料优化p c r 反应的机理研究 5 3 3 i 引言5 3 目录 4 。3 1 表面电荷和电量对优化浓度的影响7 7 4 3 2d e n d r i m e r 材料表面对优化浓度的影响7 8 4 3 3 用p c r 扩增的方法研究d e n d r i m e r 与p c r 组分的相互作用8 l 4 3 4 用p c s 实验研究d e n d r i m e r 与b s a 的相互作用8 4 4 4 讨论8 6 4 5 本章小结8 8 参考文献8 8 第五章总结和展望 9 1 5 1 研究的结果和意义9 l 5 2 本研究的创新点。9 2 5 3 展望9 3 附录一缩略词表 攻读博士学位期间已发表或录用的论文 攻读博士学位期间参与的科研项目 致谢 9 4 9 5 9 6 9 7 - 第一章绪论 1 1 纳米材料 第一章绪论 在充满生机的二十一世纪，信息、生物技术、能源、环境、先进制造技术和国防的 高速发展必然对材料提出新的需求，元件的小型化、智能化、高集成、高密度存储和超 快速传输等对材料的尺寸要求越来越小；航空航天、新型军事装备及先进制造技术等对 材料性能要求越来越高。新材料的创新，以及在此基础上诱发的新技术、新产品的创新 是未来l o 年对社会发展、经济振兴、国力增强最有影响力的战略研究领域，纳米材料 将是起重要作用的关键材料之一。纳米材料和纳米结构是当今新材料研究领域中最富有 活力、对未来经济和社会发展有着十分重要影响的研究对象，也是纳米科技中最为活跃、 最接近应用的重要组成部分。同时，相应发展起来的纳米技术被公认为是2 l 世纪的三 大支柱科学之一，由于其可能导致人类未来生产和生活方式的革命性变化，现已成为当 前世界各国投入最多，发展最快的科学研究和技术开发领域之一 1 - 3 最早提出纳米技术的是著名的物理学家，诺贝尔物理学奖获得者理查德费曼( r f e y n m a n ) 。2 0 世纪6 0 年代，他在美国物理学会年上做了一次主题为“窥究到底，空间 还多的很( t h e r ei sp l e n t yo fr o o ma tt h eb o t t o m ! ) ”的演讲。他以大英百科全书可以写在 一根针头上为例，揭示了微小计算机、微小工厂、原子重组等微小世界的理念，并预言 如果我们对物体微小规模上的排列加以某种控制的话，我们就能使物体得到大量的异乎 寻常的特性，就会看到材料的性能产生丰富的变化。他所说的材料就是现在的纳米材料。 纳米材料由于其独特的物理化学性质，从而展现了一系列新异的物理、化学特性， 并涉及到体相材料中所忽略的或根本不具有的一些基本物理、化学问题。自2 0 世纪8 0 年代以来，纳米材料作为一种新材料，逐渐成为世界各国研究开发的重点，在信息存储、 催化、光吸收、发光、医药等领域展示了广泛的应用前景【4 ，5 】。 第i 页 第一章绪论 1 1 1 纳米粒子的特性 随着现代科技的发展，人类认识和改造物质世界的能力已经从宏观领域深入到微观 领域，深入到纳米尺度的范畴。纳米是一种度量单位，l n m 等于l o 一。纳米粒子 ( n a n o p a r t i c l e ，n p ) 是指结构单元小于1 0 0 r i m 的超细材料。它的微粒尺寸大于原子簇， 小于通常的微粒，一般为l 1 0 2n l t l ( 见图1 1 ) ，介于原子、分子与宏观体相之间，是 一种过渡态。由有限个原子或分子组成，能保持物质原有的化学性质，处于热力学上不 稳定的亚稳态的原子或分子群，是一种新的物理状态，与等离子体共称为物质的“第四 态一。与传统晶体材料相比，纳米材料具有高强度( 硬度) 、高扩散性、高塑性( 韧性) 、 低密度、低弹性模量、高电阻、高比热、高热膨胀系数、低热导率、强软磁性能。 图i l 小型物体的尺寸【6 】( a ) 蟑螂；( b ) 人类的毛发；( c ) 蓼属植物的花粉粒；( d ) 红细胞；( e ) 钴 的纳米晶体阵列；( f ) 钯的半壳聚集体；( g ) 阿司匹林分子 f i g 1 - ls i z e so f r e p r e s e n t a t i v e s m a l l o b j e c t s ( a ) ac o c k r o a c h c o ) ah u m a nh 疵( c ) p o l y g o n u mp o l l e ng r a i n ( d ) r e db l o o dc a l l s ( e ) c o b a l tn a n o c r y s t a l 鲫p e r 蜥( f ) a na g g r e g a t eo fh a l f - s h e l l so fp a l l a d i u m 国 a s p h - i nm o l e c u l e 纳米材料大部分是人工制备的，属于人工材料，其分类方法很多，如表1 1 。所有 的纳米材料具有三个共同的结构特点：( 1 ) 纳米尺度的结构单元或特征维度尺寸在纳米 第2 页 第一章绪论 数量级( 1 1 0 0 n m ) ：( 2 ) 存在大量的界面或自由表面；( 3 ) 各纳米单元之间存在或强或 弱的相互作用。由于这种结构上的特殊性，使纳米材料具有一些独特的效应，即小尺寸 效应( 体积效应) 、量子尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道效应、介电限域效应，并 由此派生出传统固体不具有的许多特殊性质【7 】。 表1 1 纳米材料的分类 t a b l el - ic 砒e g o wo fn a n om a t e r i a l s 分类方式类别 纳米金属、纳米晶体、纳米陶瓷、纳米玻璃、纳米高 按化学组成分类 分子、纳米复合材料等 纳米结构晶体或三维纳米结构：二维纳米结构或纤维 按晶体结构形态状纳米结构；一维纳米结构或层状结构；零维原子簇 或簇组装 纳米半导体、纳米磁性材料、纳米非线性材料、纳米 按材料物性分类 铁电体、纳米超导材料、纳米热电材料等 纳米电子材料、纳米生物医用材料、纳米敏感材料、 按用途分类 纳米光电子材料、纳米储能材料等 1 1 1 2 小尺寸效应 小尺寸效应，又称体积效应，随着颗粒尺寸的量变，在一定条件下会引起颗粒性质 的质变。当纳米颗粒尺寸与传导电子的德布罗意波波长相当或更小时，周期性的边界条 件会遭到破坏，其光吸收、磁性、熔点、热阻等与普通粒子比较有很大的变化，这就是 纳米颗粒的小尺寸效应。对超微颗粒而言，尺寸变小，同时其比表面积亦显著增加，从 而产生如下一系列新奇的性质： l 、特殊的光学性质 大量的实验证明，当金属材料被做成纳米级的材料时，颜色会由原先的颜色转化成 黑色，而且材料尺寸越小，颜色越黑。金属纳米颗粒对光的反射率很低，通常可低于1 ， 大约几千纳米的厚度就能完全消光。利用这个特性纳米材料可以作为高效率的光热、光 电等转换材料，可以高效率地将太阳能转变为热能、电能。 2 、特殊的热学性质 固态物质在其形态为大尺寸时，其熔点是固定的，超细微化后却发现其熔点将显著 第3 页 第一章绪论 降低，当颗粒小于l o 纳米量级时尤为显著。例如，金的常规熔点为1 0 6 3 1 2 ，而当颗粒 尺寸减小到2n m 时，熔点仅为3 2 左右：到ln l n 时，则熔点只有2 7 3 、特殊的磁学性质 小尺寸的超微颗粒磁性与大块材料显著的不同，大块的纯铁矫顽力约为8 0 安米， 而当颗粒尺寸减小到2 0n l n 以下时，其矫顽力可增加1 0 0 0 倍，若进一步减小其尺寸至 大约6n m 时，其矫顽力反而降低到零，呈现出超顺磁性。利用超顺磁性，人们已将磁 性纳米颗粒制成用途广泛的磁性液体。在医学上可用作药剂的载体，在外磁场的引导下t 集中于病患部位，有利于提高药效【8 】。 4 、特殊的力学性质 陶瓷材料在通常情况下呈脆性，然而由纳米超微颗粒压制成的陶瓷材料却具有良好 的韧性和特殊的力学性质。纳米材料具有大界面、表面原子排列混乱、原子在外力下易 迁移等特点，因此表现出良好的韧性与一定的延展性。研究表明，人的牙齿具有很高的 强度，与其组成为纳米磷酸钙等相关【9 】。据报道，呈纳米晶粒的金属要比传统的大晶粒 金属硬3 5 倍。至于金属陶瓷复合材料则可在更大的范围内改变材料的力学性质，其 应用前景十分广阔。在临床上主要用于人工器官制造等方面。 纳米颗粒的小尺寸效应还表现在超导电性、介电性能、声学特性以及化学性能等方 面。 1 1 1 3 量子尺寸效应 微粒尺寸下降到一定值时，费米能级附近的电子能级由准连续能级变为分立能级， 吸收光谱由连续光谱带变为向短波方向移动，称为“蓝移 ，且具有分立结构的线状光 谱，此即为量子尺寸效应，此效应使得纳米材料的声、光、电、磁、热力学等特性出现 异常。如光吸收显著增加，超导相向正常相转变，金属熔点降低，增强微波吸收等。利 用等离子共振频移随颗粒尺寸变化的性质，可以改变颗粒尺寸，控制吸收边的位移，制 造具有一定频宽的微波吸收纳米材料，用于电磁波屏蔽、隐型飞机等。 第4 页 | _ 第一章绪论 图1 2 表面原子数与粒径的关系【l l 】 f i g 1 - 2t h er e l a t i o no f t h ea m o u n to fs u r f a c ea t o m sa n dt h ep a r t i c l es i z e 1 1 1 4 表面效应 表面效应是指纳米粒子的表面原子数与总原子数之比随粒径的变小而急剧增大后所 引起的性质上的变化。球形颗粒的表面积与直径的平方成正比，其体积与直径的立方成 正比，故其比表面积( 表面积体积) 与直径成反比。随着颗粒直径变小，比表面积将 会显著增大，说明表面原子所占的百分数将会显著地增加。如图1 2 所示。 由于纳米粒子表面原子数增多，表面原子配位数不足和高的表面能，使这些原子易 与其它原子相结合而稳定下来，故具有很高的化学活性。例如金属纳米粒子在空气中会 燃烧：无机的纳米粒子暴露在空气中会吸附气体，并与气体进行反应。利用表面活性， 金属纳米颗粒可望成为新一代的高效催化剂和贮气材料以及低熔点材料。某些纳米金属 粉末可作为制备动物生长素药物的新型添加剂，还可用于免疫分析 1 0 】 1 1 1 5 宏观量子隧道效应 微观粒子具有贯穿势垒的能力称为隧道效应。近年来，人们发现一些宏观量，如微粒 的磁化强度、量子相干器件的磁通量以及电荷等也具有隧道效应，它们可以穿越宏观系 统的势垒而产生变化，故称之为宏观量子隧道效应。量子尺寸效应、宏观量子隧道效应 将会是未来微电子、光电子器件的基础，当微电子器件进一步微型化时必须要考虑上述 第5 页 墨撼簟上譬蘧啦麓霉羹卜隧凋掌 第一章绪论 的量子效应。例如，在制造半导体集成电路时，当电路的尺寸接近电子波长时，电子就 通过隧道效应而溢出器件，使器件无法正常工作，经典电路的极限尺寸大概在2 5 0n m 。 目前研制的量子共振隧道晶管就是利用量子效应制成的新一代器件。 1 1 1 6 介电限域效应 随着纳米晶粒粒径的不断减小和比表面积不断增加，其表面状态的改变将会引起微 粒性质的显著变化。例如，当在半导体纳米材料表面修饰一层某种介电常数较小的介质 时，相对裸露于半导体纳米材料周围的其它介质而言，被包覆的纳米材料中电荷载体的 电力线更易穿过这层包覆膜，从而导致它比裸露纳米材料的光学性质发生了较大的变 化，这就是介电限域效应。纳米材料与介质的介电常数相差越大，介电限域效应就越明 显，吸收光谱红移也就越大。 1 1 2 纳米材料在生物技术中的应用 自从2 0 世纪9 0 年代初，人们认识到量子尺度效应并提出纳米材料的概念以来，在 过去的十几年里，这一研究领域已经取得了令人瞩目的进展。纳米材料在生物医药领域 的应用研究已经被许多国家列为纳米科技发展的重点。从目前的研究进展看，纳米材料 在生物技术领域中的应用主要集中在以下几个方面： 1 1 2 1 在临床医学诊断和疾病检测中的应用 利用具有特殊光、电、磁性质的纳米粒子作为新型探针在生物检测中的应用已经展 现了巨大的应用潜力。量子点作为生物荧光探针具有传统有机染料无法比拟的优势，除 可以大大提高检测灵敏度外，量子点还具有激发光谱宽、抗光漂白等优势，可以作为单 分子跟踪检测的标记物。g o l d m a n 等1 12 1 利用工程重组蛋白通过静电作用结合到量子点 上，然后再与抗体结合，通过亲和色谱将结合与未结合的分子分离，使用这种荧光探针， 他们成功地对一种蛋白质毒素( 葡萄球菌毒素b ) 和一种小分子( 2 ，4 ，6 三硝基甲苯) 进 行了荧光免疫分析，灵敏度非常高。后来，他们又进一步发展了此技术，把量子点与蛋 白偶联物进一步生物素化，并将其用于免疫层析检测，这种方法的检测限最低可达l o n g m l 。 第6 页 第一章绪论 纳米金粒子具有丰富的光学和电学性质，适用于多种检测方法。磁性纳米粒子可以 同时实现对生物分子的分离提取和检测。2 0 0 5 年，哈佛大学c h a r l e sl i e b e r 研究组成功 使用f e 3 0 4 磁性纳米阵列电极，在几分钟内实现一滴血中多种癌症标志物检测【1 3 】。其 中f e 3 0 4 a u 胶复合纳米微粒( 简称：纳米磁珠) 制备的纳米组合电极( g n e e ) ，兼具外 磁场中分离富集以及生物分子快速固定化等优点 1 3 1 6 。 纳米粒子生物探针的出现也促进了新型生物检测技术的发展，例如以金纳米晶为探 针发展的检测d n a 的光学比色法、利用量子点标记物发展的跟踪成像技术等。由于金 纳米粒子随粒径的变化其等离子共振吸收峰位置也不同，利用纳米粒子的这种尺寸效应 测定不同大小的金纳米粒子的散射光，就可实现寡核苷酸阵列的多色标记和检澳l j 1 7 。 d a h a n 等【1 8 】利用量子点标记物对甘氨酸受体在细胞表面的扩散动力学进行了研究，他 们将量子点与甘氨酸受体偶联起来，通过不同时间与荧光显微照片对比，可以清楚地观 察到受体在神经突触表面结合、移动的过程。 1 1 2 2 纳米生物传感器和生物芯片实验室 利用纳米加工技术将具有不同性质、不同功能的纳米材料加工为纳米尺度的结构， 并集成为纳米尺度的器件，构建纳米生物传感器。这些纳米传感器可用于微观生物过程 的监测。例如z a y t s e v a 等【1 9 】发展了一种快速测定登革热( 一种热带传染病，骨关节及肌 肉奇痛) 病毒的血清型r n a 生物传感器，仅需1 5 分钟就可测定出血样中的病毒r n a 。 同时，纳米颗粒、纳米晶体、纳米线等作为生物传感器的标记物可以对癌症进行快速高 效地检澳d 2 0 - 2 2 。 由于人类基因序列图谱的绘制工作已经完成，对人体本身的认识将可望达到分子水 平，并在细胞的分子结构和分子的基因水平上真正认识和理解病变的机理，从而为疾病 的防治提供理论基础。通过纳米加工可以大幅度提高生物芯片的密度，降低制造成本， 并可以进一步实行多功能复合，将整个的分析过程集成在微小的芯片上，构建所谓的芯 片实验室( 1 a b - o n - c h i p ) 。 近年来，通过在电极表面固定纳米粒子制备纳米组合电极( n e e ) 并进一步在其表面 组装固定抗体的生物敏感膜，可以构建灵敏度极高、微型化的安培免疫传感芯片，并兼 第7 页 第一章绪论 具良好的生物相容性和信号放大效果 2 3 ，2 4 。 1 1 2 3 实现可定向输送和释放的靶向性药物 分子生物学的研究使得人们对疾病的发生机理有了更清晰的认识，并在此基础上研 制出各种特效药物。但如何将这些特性药物定向地输送到病变部位，控制其释放方式达 到药物作用的最大化，减少药物的副作用，仍是一个难题。纳米材料的出现为药物输送 提供了一个理想的载体，利用高分子材料制造的纳米囊泡可以携带药物在人体组织内外 自由出入，通过与磁性纳米粒子的偶联可以更好地控制其在人体内的运输，进一步与生 物免疫识别技术结合就可以实现药物的定向输送。 t a t s u y a 2 5 等人合成了第6 代赖氨酸树枝状聚合物k g 6 ( 粒径5 8 5r i m ) 和p e g 化 的k g 6 ( p e g k g 6 ) 及其衍生物，并对其在小鼠体内正常细胞和肿瘤细胞中的分布进行 了对比。结果发现，k g 6 在血液循环中浓度数分钟内即迅速降低；低p e g 化的k g 6 则 能在血液中的滞留较长时间，组织蓄积量低；而高p e g 化的k g 6 ( 连接7 6 个p e g 分 子，粒径仅6 9 2r i m ) 在肿瘤组织中的分布显著提高。 q u i n t a n a 2 6 等人将叶酸与p a m a m 树枝状聚合物偶联后作为肿瘤细胞的靶向配 体，再与抗肿瘤药甲氨蝶呤( m e t h o t r e x a t e ) 偶联，大大提高了药物对肿瘤的靶向性，而 该复合物对肿瘤细胞的细胞毒性比单体药物甲氨蝶呤提高了1 0 0 倍。 1 1 2 4 纳米材料生物安全性研究 纳米材料的生物安全性问题是随着纳米技术的发展逐渐被人们认识到的。一是纳米 颗粒由于尺寸微小，可以自由进出人体，从而可能对人体产生潜在的危害：二是很多在 宏观尺度上对生物无害的材料成为纳米颗粒后可能对生物体产生危害，例如h o s h i n o 等 人【2 7 】将量子点标记的细胞静脉注入小鼠体内，通过流式细胞仪和荧光检测技术发现， 第五天的小鼠血液中量子点标记的细胞浓度达到l o 。同时，注射第七天后在肾脏， 肝脏、肺部和脾脏中滞留有约2 0 的量子点。k r e u t e r 等【2 8 】的研究表明表面经过蛋白 修饰的纳米粒子可以有效的通过细胞内吞作用而穿越血脑屏障进入大脑。此外，c h e n 等 2 9 1 研究发现纳米级c u 颗粒对小鼠的脾、肾、胃等器官均会造成严重的损害，而相 同剂量下的微米级c u 粉却不会。系统研究纳米材料的生物毒理学机制，建立纳米材料 第8 页 第一章绪论 生物安全性评估体系，是纳米材料应用中需要解决的关键问题。 1 2 聚合酶链式反应概述 核酸研究已有1 0 0 多年的历史，2 0 世纪6 0 年代末、7 0 年代初人们致力于研究基因 的体外分离技术，k o m b e r g 于1 9 5 6 年最早提出核酸体外扩增的设想【3 0 】。1 9 8 5 年美国 p e c e t u s 公司人类遗传研究室的m u l l i s 等 32 。3 z 发明了具有划时代意义的聚合酶链反 应( p o l y m e