（发酵工程专业论文）人血清白蛋白人白介素11在毕赤酵母中的克隆与表达.pdf

摘要 摘要 人白介素1 1 ( i n t e r l e u k i n - 1 1 ，i l “) 在体内由p u 3 4 细胞产生，具丝裂原活性、 能支持i l 6 依赖的浆细胞瘤细胞系t 1 1 6 5 生长。最基本的功能在于造血调控作用，在 体外对不同阶段的巨核细胞和血小板生成都具有特异的促进作用。体内注射h l l 1 1 可显 著刺激巨核细胞集落( c f u m k ) 生长和增加血小板计数，还具有促进消化道上皮损伤 恢复、调节脂肪细胞分化等多种生物活性。但是天然的白介素1 1 在在体内的半衰期较 短，为了达到延长其在体内的半衰期，本研究采用了把白介素1 1 和人血清白蛋白以无 连接肽的方式融合。 取人胎肺成纤维细胞，以d m e m 刺激培养，提取总r n a ，通过反转录得到编码人 白介素1 1 的c d n a ，克隆到t 载体p m d l 9 s i m p l e 上，构建含有i l 1 1 编码基因的重组 质粒p m d l 9 i l 1 1 ，d n a 序列测定结果证明插入序列与i l 1 1 编码序列完全一致。 分别以p m d l 9 i l 1 l 和含有编码h s a 编码基因的重组质粒p b l u e h s a 为模板，利 用重叠p c r 的办法，扩增得到h s a i l 1 1 融合基因，连接到载体上得到重组质粒 p b l u e h i ；对p b l u e h i 和穿梭质粒p p i c 9 k 分别用e c o ri d fi 进行双酶切，将 h s a i l 1 1 融合基因克隆到表达质粒p p i c 9 k 中构建重组表达质粒p p h l l1 ：经测序验证， 所得到的表达载体中目的片段碱基序列和预期一致，读框正确。 将s a li 线性化的p p h l l l 电转化巴斯德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) g s l l 5 ，通过组 氨酸缺陷型标记和g 4 1 8 抗性筛选，得到抗0 7 5m e d r r l l 的g 4 1 8 的毕赤酵母转化子，经 过p c r 验证，转化子中含有h s a i l 1 1 融合基因。 b m g y 种子培养基培养细胞，经离心收集后，于b m m y 诱导表达培养基在3 0 ， 2 0 0r m i n 条件下，以甲醇为唯一碳源诱导3d ，经聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 检测，重组子表达出相应分子量的目标蛋白，h s a 及i l 1 1 抗体的w e s t e m b l o t 免疫杂 交实验检测结果表明，融合蛋白中含有h s a 和i l 1 l ，说明h s a i l 1 1 融合蛋白得以表 达。定量测定结果表明，融合蛋白在诱导上清液中的表达量约为1 2 0m g 九。 对重组菌在摇瓶转速、诱导甲醇浓度、诱导时间、诱导p h 、诱导温度等条件下进 行优化，得到的诱导条件为：诱导温度3 0 ，甲醇浓度5 ，p h 6 ，诱导细胞密度 d d 6 0 0 = 6 0 ，在上述优化条件下h s a i l 1 1 的表达量为1 9 8m g l 。 b 9 1 1 m t t 法检测诱导上清液生物学活性的结果表明，融合蛋白h s a - i l 1 1 可以有 效刺激b 9 1 1 细胞增殖，其i l 1 1 生物学活性约为6 2 1 0 4u r a g 。 关键词：白介素一1 l ；人血清白蛋白；重叠p c r ；融合蛋白；培养表达 a b s t r a c t a b s t r a c t h u m a ni n t e r l e u l d n 11 ( i l 11 ) i sp r o d u c e db yp u 3 4c e l l s i tw a si n i t i a l l yd e s c r i b e da sa g r o w t hf a c t o rs y n e r g i s i n gw i t l l o t h e rf a c t o r si nt h er e g u l a t i o no fh e m a t o p o i e s i s t h eh a l f - l i f e o fn a t i v ei l 1 1i ss h o r t i no r d e rt op r o l o n gt h eh a l f - l i f e t h ef u s i o np r o t e i nh s a i l 1 1w a s c o n s t r u c t e db ys p l i c i n gt h ei l 11t oh u m a ns e m ma l b u m ( h s a ) w i t h o u tp e p t i d el i n k e r t h ec d n ae n c o d i n gi l 1 1w a so b t a i n e db yi m p c rw i t ht h et e m p l a t eo ft o t a lr n a p u r i f i e df r o mh u m a nf e t a ll u n gf i b r o b l a s t , w h i c hw a sp r e p a r e df r o mf l e s ht i s s u e t h e s ec e l l s w e r es t i m u l a t e d 、析也d m e m t h e nc l o n e di n t op m d 19 s i m p l et oc o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n t p l a s m i dp 加1 9 i l 1 1 t h ef u s i o ng e n ee n c o d i n gh s a - i l - 1 1w a sa m p l i f i e db yo v e r l a pp c re x t e n s i o nu s i n g p m d 19 i l - 1 1a n dp b l u e h s a ( c o n t a i n i n gt h eg e n ee n c o d i n gh s a ) a st h et e m p l a t e ，a n dt h e n c l o n e di n t op b l u e s c r i p ti ik s ( + ) t oc o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp b l u e h i 。m p b l u e h iw a sd i g e s t e d 、析t 1 1 o 砒a n d 0 ，a n dl i g a t e db e t w e e nt h ec o r r e s p o n d i n gs i t e so f p p i c 9 k ，y i e l d i n gt h er e c o m b i n a n te x p r e s s i n gp l a s m i dp p h i 11 f i d e l i t yo ft h ec l o n e dd n a f r a g m e n tw a sc o n f i r m e db vd n as e q u e n c i n g t h el i n e a r i z e dp l a s m i dp p h i1 1d i g e s t e db y 勋w a st r a n s f o r m e di n t op i c h i ap a s t o r i s g s1 15b ve l e c t r o p o r a t i o n 耶1 et r a n s f o r m a n t sr e s i s t i n g0 7 5m g m lo fg 418w e r eo b t a i n e d 。i t w a sc o n f i r m e db yp c ra m p l i f i c a t i o nt h a tt h e r ew a sf u s i o ng e n ee n c o d i n gh s a i l 1 1i nt h e t r a n s f o r m a n to f pp a s t o r i sg s l l 5 ( p p h l l l ) t h er e c o m b i n a n ty e a s to f 只p a s t o r i sg s1 15 ( p p h i11 ) c u l t i v a t e di nb m g ym e d i u ma n d c o l l e c t e db yc e n t r i f u g a t i o nw a sr e s u s p e n d e di ne x p r e s s i o nm e d i u mo fb m m yi n d u c e dw i t h m e t h a n o la st h es o l ec a r b o ns o u r c ef o r3d a y sa t3 0 s d s p a g ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e r e c o m b i n a n ty e a s te x p r e s s e dt h ep r o t e i nw i t ht h es i m i l a rm o l e c u l a rw e i g h tt ot h et a r g e tf u s i o n p r o t e i n w b s t e m - b l o tr e s u l tw a si n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s e df u s i o np r o t e i nh s a i l 1 1 c o n t a i n e da n t i g e nb o t hi l 1 1a n dh s a q u a n t i t a t i v ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e l o fh s a i l 1 1w a sa b o u t12 0m g li ne x p r e s s i o ns u s p e n s i o n 皿1 er e s u l to fo r t h o g o n a lt e s tf o rr o t a t i o ns p e e d ，t e m p e r a t u r e ，p h ，m e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n , a n dt i m es h o w e dt h eo p t i m u r ne x p r e s s i o nc o n d i t i o nf o rt h er e c o m b i n a n ty e a s tw a sa sf o l l o w s ： i n d u c i n gt e m p e r a t u r eo f3 0 0 ，m e t h a n o lc o n c e n 仃a t i o no f5 ；p h 6 t h ee x p r e s s i n gl e v e lw a s i n c r e a s e dt o19 8m e g l 1 1 舱b i o a c t i v i t yo ft h ee x p r e s s i o ns u p e m a t a n tw a sc h e c k e db yb 9 1 1 m t tm e t h o da n d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ef u s i o np r o t e i nh s a i l 1lc a l ls t i m u l a t et h ed i v i s i o no fb 9 。11c e l l s 啊1 ei l 一1 1a c t i v i t yw a sa b o u t6 2 x1 0 4u m go f t h es u p e r n a t a n t k e yw o r d s ：h u m a ni n t e r l e u k i n 1 1 ；h u m a ns e r u ma l b u m ；s o e p c r ；f u s i o np r o t e i n ； e x p r e s s i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名： 硷耋望：日 期： 鲨塑二么 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅扣借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 殓建攫 导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 1 1 1 人白介素u 的发现 造血微环境( h e m a t o p o i e t i cm i c r o e n v i r o n m e n t ，h m ) 是由造血干细胞所在环境中的 微血管系统( 主要为血窦) 、神经系统和造血间质等部分所组成。造血干细胞及祖细胞 与造血微环境紧密相关。由于造血微环境内细胞小室( c e l l u l a rc o m p a r t m e n t s ) 的异质 性，造血细胞与h m 之间的联系一直了解甚少，但是普遍认为是由于基质细胞、造血细 胞与由基质细胞产生的造血生长因子的相互作用，调节了血细胞的产生【l 】。人们又进一 步用反转录病毒载体转染细胞建立了永久基质细胞系。这些细胞系既可以用来研究造血 细胞与基质细胞之间的直接联系，也可以用来研究基质细胞造血生长因子的产生。p u 3 4 是长期培养的灵长类骨髓细胞经反转录病毒载体u 1 9 b l 转染而获得的一株基质细胞 系，它的培养上清能够长期支持体外培养的正常人或灵长类造血祖细胞的造血功能；而 且发现，p u 3 4 细胞除产生一些已知的造血集落刺激因子和白细胞介素( i n t e r l e u k i n ，i l ) 外，还产生一种具丝裂原活性、能支持白细胞介素6 ( i l 6 ) 依赖的浆细胞瘤细胞系t 1 1 6 5 生长的细胞因子。经分析证实：此细胞因子的核苷酸序列与己知的细胞因子都不同，因 此，p a u l 等提议命名其为白细胞介素1 1 ( i n t e r l e u k i n - 1 1 ，i l 一1 1 ) ，在大肠杆菌中克隆并 表达了它的c d n a 序y o t ：l ，它是一种多功能的细胞因子【3 】。k a w a s m m a 等从人骨髓来源 的基质传代细胞系k m l 0 2 的c d n a 的文库中克隆到一个新的脂肪形成抑制因子 ( a d i p o g e n e s i s i n h i b i t o r yf a t t e r ，a g i f ) 基因，后经d n a 序列分析证明与i l 1 l 为同一 因子。 1 1 2i l - 1 1 的分子生物学特性 i l 1 1 的前体蛋白由1 9 9 个氨基酸组成，其中前2 1 个氨基酸是信号肽，成熟蛋白由 1 7 8 个氨基酸组成，分子量约2 1k d a ，等电点p i 为1 1 7 ，其核苷酸及氨基酸序列见图 1 1 。它定位于1 9 号染色体长臂1 3 区( 1 9 q 1 3 ，3 - q 1 3 ，4 ) ，隶属于g p l 3 0 细胞因子家族。 基因组系列长约7 0 0 0b p ，有5 个外显子，4 个内含子【4 】。i l 一1 1 蛋白分子中富含脯氨酸 残基( 占1 2 ) ，但没有半胱氨酸残基，无二硫键和n 糖基化位点。i l 1 1 蛋白分子结 构的变化能引起其生物学活性的变化。第5 8 位蛋氨酸的化学修饰( 烷化和定点诱变) 可以导致i l 1 1 在体外的生物活性减少2 5 倍。第4 1 和9 8 位赖氨酸的化学修饰可使i l 1 1 的生物活性降低3 倍。诱导研究显示，影响i l 1 1 分子稳定性的残基都是疏水性的，当 突变成亲水性时，只有不足5 的活性。预测的三级结构为4 个c 【一螺旋和2 个b 一折叠。 i l 1 1 基因表达的信号传导途径在不同细胞类型中不同。比如，在p u 3 4 细胞中i l 1 1 基因的表达受i l 1c c 和佛波醇豆蔻酸乙酸酯的诱导，主要是通过转录后修饰从而增强 i l 1 l m r n a 的稳定性的实现。目前国内外大多采用融合表达重组人i l 1 1 【5 ，6 】，但这种融 合表达方法在生产过程中具有工艺复杂，需酶切处理，成本高等缺点。 体外研究发现，i l 1 1 由纤维细胞、上皮细胞和软骨细胞等基质细胞手刺激而产生 7 1 。 江南大学硕士学位论文 诱导i l 1 1 分泌的刺激因子较多，一般为i l 1 、转移生长因子( t r a n s f e rg r o w i n gf a c t o r ， t g f ) 和甲状旁腺素( p a r a t h y r o i dh o r m o n e ，p t h ) 等。i l - 1 1 多肽结构中无半胱氨酸残 基或潜在糖基化位点，无二硫键结构及高度螺旋化结构，i l l l 受体为i 类细胞因子受 体家族成员，与i l 6 受体属同一家族【8 j 。i l 1 l 与其特异q 受体亚型结合，诱导g p l 3 0 同源二聚体化激活j a n u s 激酶信号转导和转录活化因子( 删s t a t ，主要为s 彤几) 而引起靶基因的表达，经j a k 激酶途径或r a s m a p k 途径启动细胞内d n a 的转录来发 挥其生物学作用，且i l 1 1 对不同的靶细胞及组织表现出不同的生物活性一j 。 0 矗0 0 5 羽哼劓a 翻：c a ：c 口o c 硝c 1 0 cc c c c 蕾簖c c 冒g g g g n 记c c c1 俄* c c c t g c go 翮0 记l ji 瞄n c 掰m 儆c g cc t g 钳cc g t c 啪粥 职c t g 嗽c 强硒u ，l 时“n v a lq a t c j 堪v “l e u ”lh 土l e a 暑fl t ：pp $ o 9t h t ccf g c t 翻一g c cc c t 口c c ac c c c a 誊ct c cc c tc b g c t1 - c cc c q cc c tc t l 了3 ， j 吐v e l 工，og i f ，r 口穸f 曩，f g l y 善r ，l 曩善掌 l 摹fl r o , k l p ，t o g l p r o i v - , 2 i c g c c g a gc 怕翻记a g c c c 弓a kc 1 陀托cc 啦蛳c 钟c i gg a gc c c 0c c 2 2 7 i a l ag l u - 叠j u b ps - t h rv - l 厶譬l ut h r ，5 l ul 蜢g l ua a pt h 霉窖 i 越 c 躺 0 i n 湖 p c c g ，i o m g l 扭 撤 g l y 雠 铀r c c c ，r o c 焰 “q o 矗tg t g j 啊i v l 口l ， c 1 婚 1 c pl e u c cc 档 ? h f 4 1 1 t c o cc 1 瞄 r 曩l o 奠 0 c 霉 c 描 z l eg i n i - c c c c i p t 口l 囊f t 警cc c 坶瞻p r o t o c 础粥 s # j l j s 髓y 积谳稻gw l 争口l ， 一p 砥c 拍泓鼢 l l - g l y l t 锄 c 弼册c 强础雠慨c f c ct a c 粥 1 , 4 ut h ra c g 五_ f 嘻a l a - pl 碡1 酶s e e tl u c譬 c 钳c g c g g c 研 , c ga c g l 一墨tg l yi r i g 2 y ) 口 伽 c cc c t g 粼c g i n 窭f 霉o 链j u m p z 摹 t j 哇l c a 雠c 咖c c c 馓c 镐c 钟 工l 蛩，f og l 矗删p o i ，r o i 6 c c c c c ： a c ct 0 c 日苷口g g c 斛c ，$ e r “r 碧：i t ；p 辱g l y x z e t i ， c kc 筠 c ma 鑫c 蓐cg 耳l “q f 舢“pf 砖n h i t c cc 钧瑚l c cc g a g s e ：州研慷“臀g i 口 c c 埘 l e 矗 c t c g 0 工n c 口 鼍一t - c c c tg 舶 ，og 1 u c 1 峙t 3 - l l “诅 僦1 3 3 s ) i , e 蕾 铡l3 4 9 ， 可l c f gt4 4 5 ) q c 拍c 镐c 伤6a 懵c 蚺嚣cc 拍射嗡1 4 9 7 厶碡鼍譬 f ，a z gl _ ng i nl 4 u l e un i t l a c c q kc c gc c gg c oc c cc c 4c 譬瞄辱c ot 摹搴l i p r oa l , , i t ) p r op r o - i 工p r op r oi ；e ul 矗 j 嵋bg c c 袱c c 锹 c g 蛳l s o s ) a r g i i a l e 工l i e qg l y 辱i ， 口 嵫泓讯c 鹦锄c 能舶棚髓g1 4 5 s ) f - g i l t 簟l e ml q l ql y t h f f 摹 c ，口t c c c 口oc c a 嵋 翻：口lc c c a 摊c c t c o 簖c c 奢0 代 f ，a t i t & t t t a t l7 2 2 ) “口 图1 - 1i l 11 e d n a 及其氨基酸序列 f i g u r el 1e d n as e q u e n c ea n da l n j l l oa c i da b o u ti l - i i i i 3i l i i 的生物学作用 ( 1 ) 对于造血系统的作用。见1 1 为重要的造血调节因子，对造血系统具有以下作 用。第一，促进造血干细胞的生长和分化：与i l 3 ，m 4 ，i l 7 及粒细胞刺激因子 ( g r a n u l a r - c e l ls t i m u l a t i n gf a c t o r ，g s f ) 等协同作用于干细胞，缩短细胞周期，促进干 细胞的扩增，并与造血微环境中其他细胞因子一起促进干细胞分化。第二，促进巨核细 胞及血小板生成：i l 1 1 与i l 3 等干细胞生长因子( s t e mc e l lf a c t o r ，s c f ) 协同作用对 2 c p 口t髫嚣 b 孽 c t 辱枷h二： 钾n 帆 以 鬻 盘 r 6 u g 躲仆“ 滞“ 嚣 篆 第一苹绪论 巨核细胞系、红细胞系、粒细胞系和血小板生成的不同阶段都有刺激作用。i l 1 1 对巨 核祖细胞增殖、成熟和分化均有作用，与i l 3 等细胞因子协同作用可缩短早期造血祖细 胞g o 期，使骨髓巨核系集落体积增大、数量增多，同时巨核细胞高倍体也增多 1 0 】。第 三，促进淋巴细胞生成：s c f ，1 1 , 4 共同作用可促进b 淋巴细胞生成，该过程可能手t 细胞的调节，且几1 1 ，几4 在体外可以逆转i l 3 对早期b 淋巴细胞产生过程中的抑制 作用，故可诱导体液免疫。第四，i l 11 对骨髓纤维母细胞的生长等亦有调节作用，已 被用于减轻肿瘤化疗药物的骨髓抑制副反应，临床显示i l 1 1 能显著减少造血功能受抑 制肿瘤患者的血小板输注率，缩短血小板的恢复时间【l 。 ( 2 ) 对于上皮细胞的作用。上皮细胞对辐射较敏感，其存活和再生最终影响机体 的存亡，故保护上皮细胞是抗辐射损伤的重要方面，在呼吸道合胞病毒感染时肺泡及支 气管上皮细胞合成大量的i l 1 1 ，说明其参与了肺部炎症 1 2 1 。有人认为i l 1 1 对干细胞 的保护作用可能与其抑制巨噬细胞肿瘤坏死因子，i l 1 ，i l 1 2 防止上皮细胞凋亡有关。 在体外，i l 1 1 可延迟肠上皮细胞进入s 期，同时抑制r b 蛋白磷酸化，诱导肠上皮细胞 缩短生长停滞，从而起到保护上皮细胞的作用【l3 1 。 ( 3 ) 对于免疫系统的作用。i l 1 1 可诱导体液免疫，刺激浆细胞增殖和分化，对骨 髓纤维母细胞的生长等亦有调节作用。同时，i l 1 1 具有多种活性，它可诱导急性期反 应物的产生，能抑制脂肪形成及调节细胞外基质的代谢等。 i l 1 1 的生物学作用广泛，除对细胞和组织有保护作用外，尚能抑制肥胖、调节神 经元分化，刺激金属蛋白酶抑制因子的产生和激活，可抑制细胞组织产生巨噬细胞肿瘤 坏死因子，还具有一定的抗炎作用。 1 1 4i l 一1 1 的临床作用 ( 1 ) 肿瘤化疗后血小板减少症。化疗常会引起骨髓抑制，使白细胞和血小板下降， 尤其是后者，严重时会引起出血而被迫终止化疗，影响系统化疗的连续性和完整性。i l 11 具有升高血小板的功能。s a i t o h 等【1 4 】观察了单用i l 1 1 及其联用3 种抗癌药物时对肺癌 细胞增殖的影响，结果发现1 1 可成功防止血小板减少而不改变化疗药物的抗癌活性。 r e y n o l d s 1 5 1 的一个多中心、随机期临床实验也证实，i l 1 1 可有效防止化疗后血小板 减少，有效减少血小板输注量，并保证化疗可连续进行不需调整剂量。i l 1 1 对肝硬化 导致的血小板减少症同样有效【1 6 1 。 ( 2 ) 前期再生障碍性贫血的血小板减少。随着免疫再生障碍性贫血的治疗取得了 较满意的疗效。而前期再生障碍性贫血仅表现为一系或两系血细胞减少，伴均一性巨核 细胞减少，因而血小板减少，增加了出血的危险。商安芳等【l ”选用i l 1 1 治疗再生障碍 性贫血并发血小板减少患者6 例，结果显效3 例，良好1 例，进步1 例，无效1 例，有 效率为为8 3 3 ，效果良好。 ( 3 ) 与肾上腺皮质激素合用于特发性血小板减少性紫癜( t h r o m b o c y t o p e n i c i d i o p a t h i cp u r p u r a ，t i p ) 。t p 是因免疫机制使血小板破坏增多的临床综合症，发病机理 尚未完全阐明，目前肾上腺皮质激素仍是首选治疗药物，但起效较慢。张华等【l 引用重组 人i l 1 1 联合肾上腺皮质激素治疗t i p 2 0 例，结果显示总有效率为9 5 ，疗效较满意。 3 江南大学硕士学位论文 另外，对于慢性肝病，i l 1 1 可以提高早期肝病患者的血小板计数，有利于治疗肝 病时引起的血小板减少；i l 1 1 对肠黏膜损伤也具有保护作用，能有效地促进肠上皮细 胞增殖，降低肠源性感染，对放化疗引起的肠上皮细胞凋亡具有明显的抑制作用，从而 加速肠黏膜损伤再生修复的进程；对于乳腺癌及其他肿瘤患者，i l 1 1 可以安全地减轻 放化疗引起的血小板减少症，保证放化疗顺利进行。它是目前全世界唯一己用于临床的 促进血小板生成药。其它适应症如肿瘤化疗引起的口腔粘膜炎、节段性回肠炎的治疗也 正处于临床阶段，具有较好的临床应用价值。 1 2 人血清白蛋白的研究 1 2 1 人血清白蛋白的分子生物学特性 人血清白蛋白( h u m a ns e r u ma l b u m i n ，h s a ) 是由5 8 5 个氨基酸组成的单链无糖基 化的蛋白质，分子质量为6 6 5k d a ，等电点在4 7 4 9 之间。它是人血浆中最丰富的蛋 白质，占血浆总蛋白的6 0 左右。每升人血含h s a 约4 0g ，一个正常成年男性( 体重 以7 0k g 计) 约有3 5 4l 血液，即血浆中约有1 6 0gh s a 。h s a 除存在于血浆中外， 还存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中，构成血管外池，血液里和血管外池总 的h s a 达3 5 0 一例。 在体液中，h s a 可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多 治疗分子；同时，它可以维持血液正常的渗透压。在临床上h s a 可以用于治疗休克与 烧伤，用于补充因手术、以外事故或大出血所致的血液流失 2 0 1 。 重组人血清白蛋白( r e c o m b i n a n th u m a ns e r t l ma l b u m i n ，r h s a ) 还广泛用于血浆容 量扩充剂。因其具有无酶活性且无免疫原性等特点，还可作为赋形剂和稳定剂，用于各 种药物制剂及无血清细胞培养基的组分等。另外，由于具有抗氧化性，r h s a 也被用作 药物载体，从而赋予药物更好的理化特性阱j 。 1 2 2 重纽人血清白蛋白在药学中的应用： ( 1 ) 人造血液的替代品【2 2 1 。大出血情况下输血是唯一有效的治疗手段，在众多血 浆量显著减少的例子中，白蛋白都能快速地弥补损耗。 ( 2 ) 通过微球体化和化学修饰促进药物的靶向作用【2 3 1 。静脉注射白蛋白微球具有 良好的组织定位作用，其主要是依赖微球体大小分布到肺组织、肝组织或其他组织。 ( 3 ) 与治疗剂直接结合。以自蛋白为基础的药物传输系统己取得很大发展，将化 疗药物与大分子载体系统相连可以增强肿瘤定位作用，降低药物毒性并克服抗药性【2 4 】。 增殖的肿瘤细胞利用白蛋白和其他血浆蛋白作为氮源，它们通过液相内吞作用以比正常 组织快得多的速率吸收白蛋白。这个特性促使人们选择白蛋白作为药物载体，连接后的 结合物具有与白蛋白相同的肿瘤定位性质，如肿瘤吸收率高，肝脏吸收率低，生物半衰 期长。 ( 4 ) 白蛋白融合蛋白。为避免在消化道内快速降解，大多数生物制品都采用注射 给药。尽管如此，注射的蛋白仍然被快速从血液清除。因此往往必须注射很大剂量或增 4 第一章绪论 加注射频次，但这样又必然导致副作用增大。治疗费用增加，给病人带来极大不便。通 过白蛋白融合，能对现有治疗用重组蛋白进行再改造，从而克服上述缺点，显著延长半 衰期，增强治疗效果。蛋白融合就是将白蛋白基因与治疗用蛋白或肽的基因融合【2 5 1 。融 合后的基因在合适的表达系统中表达二者的融合蛋白。 ( 5 ) 血脑屏障运输和非入侵性基因的转运载体。肽类和蛋白质类药物在体内很难 渗透进入血脑屏障，但通过嵌合肽可实现肽或蛋白质药物向脑的转运。不可转运的肽治 疗剂可与血脑药物转运载体形成嵌合肽。阳离子化的r h s a 的氨基酸基团可与不同化合 物结合。通过与血脑屏障内皮上的多糖蛋白复合物之间的静电作用，阳离子化的白蛋 白b 内啡肽嵌合肽通过吸附介导的细胞转运进入大脑。2 0 0 0 年，s h i n 和p e n i c h e t 等的 实验证明，阳离子化的重组h s a 突变体均可与不能转运的多肽药物之间进行药物融合 【2 4 】 o ( 6 ) 具有解毒活性的r h s a 突变体。新生儿黄疸和i 型c r i g e r - n a j j a r 综合症的主 要治疗途径是光线疗法。光线疗法与重组白蛋白相结合可以迅速减少血清未结合的胆红 素( 一种潜在的神经毒性成分) 水平。在治疗c r i g l e r - n a j j a t 综合症时，重要的是将未结 合胆红素浓度维持在2 0n m o l l ，同时将整体胆红素浓度维持在低于血清白蛋白结合能 力的水平。光线疗法可以将与r h s a 结合的胆红素转变为溶解度更好的、无毒性的异构 体。 1 2 3 重纽人血清白蛋白的表达系统 到目前为止，大肠杆菌 2 6 1 、枯草杆菌、酵母菌 2 7 1 、植物和转基因动物等系统中已经 成功进行了r h s a 的表达研究。日本绿十字公司生产的重组人血清白蛋白也以于2 0 0 1 年批准上市。毕赤酵母是应用最广泛的r h s a 表达系统，它是r h s a 以及其他血浆白蛋 白的一个非常重要的表达宿主。 1 3 长效药物研究 1 3 1 我国生物技术药物研究概况 2 0 0 5 年我国生物技术药物的研究、开发和生产取得了令人瞩目的成绩。其工业总 产值达3 3 7 亿元，s f d a 批准新生物技术药物品种( 指新化合物和药物新剂型) 1 1 个， 占我国从1 9 8 9 年到2 0 0 5 年以来共3 7 个品种的3 0 ；批准进行临床研究的新生物技术 药物2 7 个；受理新生物技术药物的申请4 5 个；此外，生物技术产品的创新、发现及其 药物基础性研究、国家的投入和科技人才的培养以及新的市场机制都为我国生物技术药 物的持续发展提供了可靠的保障【2 8 】。 1 3 2 国际生物技术药物概况 随着生物技术的飞速发展，蛋白质和多肽类药物已成为生物技术新药的主要品种。 2 0 0 6 年，美国药品研究与生产商协会的报告统计【2 9 】，有4 1 8 种生物技术新药处于临床 研究阶段或f d a 审批进程中，这些药物能够治疗癌症、传染性疾病、艾滋病在内的1 0 0 多种疾病。同传统的化学合成药物相比，该类药物与体内正常生理物质十分接近，药理 5 江南大学硕士学位论文 活性高，但是半衰期短。药代动力学研究表明多肽蛋白类药物主要通过降解、排泄、以 及受体介导的内吞等作用在体内被清除 3 0 , 3 1 ，尤其是对于分子量小于2 0k d a 的多肽因 子，其在代谢过程中非常容易被肾小球滤过；通过肾小管时，多肽因子又被其中的蛋白 酶部分降解后再从尿液中排出，因而半衰期就非常短【3 引。而且蛋白多肽作为一种异源蛋 白具有很强的免疫原性，容易被机体免疫系统识别并清除，导致药物在血浆中的半衰期 缩短。为了维持一定的疗效需要大剂量反复用药，长期的频繁注射不仅增加了病人的痛 苦而且易引发一系列副反应。因此临床上需要研制长效的蛋白药物。近几年各国学者主 要从蛋白药物的化学修饰、与白蛋白融合、纳米颗粒包埋等技术以及制剂改造等方面进 行研究，长效药物的新品种不断涌现。 1 3 3 长效药物研究途径 ( 1 ) 化学修饰：化学修饰是延长蛋白药物半衰期的一个有效途径，其中引用最为 广泛的修饰剂是聚乙二醇( p o l y e t h y l e n e g l y c o l ，p e g ) 。p e g 是由乙二醇单体 h o 一 ( c h 2 c h 2 0 ) n c h 2 一c h 2 一o h 聚合而成的一种无毒、高亲水性的大分子聚合物。p e g 及其衍生物由于具有下述的优良性能而在化学修饰中应用最多：第一：具有两亲性，既 可以溶解于水，又可以溶解于大多数的有机溶剂：第二：无毒、免疫原性低，其生物相 容性己通过美国f d a 认证；第三：相对分子质量范围宽，选择余地大；第四：p e g 可 以将它的许多优良性质赋予修饰后的生物分子。 p e g 修饰后的蛋白药物由于增加了蛋白质的相对分子质量，减少了药物的排泄，可 以作为屏障减少免疫清除作用，保护蛋白质使其不易被蛋白酶水解【3 引，p e g 化的这些特 点均有利于延长蛋白质药物的半衰期。 ( 2 ) 与自蛋白融合。h s a 是血浆的重要成分，其相对分子质量约为6 6k d a ，分子 呈心型，正常情况下不易透过肾小球，体内分布极广而且没有酶学和免疫活性，是理想 的药物载体。h s a 自身在血浆中的半衰期长达1 9d ，将小分子蛋白药物与h s a 融合有 望提高在血液中的半衰期。h s a 融合技术具有以下优点：第一：h s a 与目标蛋白在细 胞内经蛋白翻译系统通过肽键连接，不需要额外的体外处理；第二：h s a 的表达水平高， 与其融合后可以提高目的蛋白的表达水平；第三：h s a 是一个稳定的“惰性 蛋白，与 其融合后可以提高目的蛋白的稳定性；第四：h s a 融合蛋白具有比p e g 修饰的蛋白药 物更长的半衰期。目前，多种蛋白与h s a 融合后在实验动物体内半衰期的延长得到了 证实。克鲁维酵母表达的h s a c d 4 融合蛋白在家兔体内的半衰期比c d 4 单体延长1 4 0 倍【3 4 】。同种方法表达的h s a k g n g t 的融合蛋白在猕猴体内的半衰期比其单体延长了大约 1 8 倍 3 5 】。毕赤酵母中表达的h s a h l f n a 2 b 融合蛋白( a l b u f e r o n a ) 已完成i 期临床实 验，结果表明，其平均半衰期1 4 8h ，比p e g a s y s 平均半衰期8 0h ( 5 0 1 4 0h ) 和p e g i n t r o n 平均半衰期4 0h ( 2 2 6 0h ) 更长。 ( 3 ) 改变剂型。对于半衰期短的多肽、蛋白药物也可以采取改变剂型的形式延缓 其在体内的释放来延长药物作用时间。d a m g e 等【3 6 j 最早用界面聚合方法制备了胰岛素 聚氰基丙烯酸异己酯纳米胶囊，血糖水平降低5 0 6 0 ，降血糖作用可维持2 0d 。纳米 作为一种控释、缓释、靶向制剂，越来越广泛地用于多肽、蛋白药物的输送系统。 6 第一章绪论 1 3 4 长效药物应用前景 生物技术药物的发展已进入蛋白质药物新时期，通过蛋白质工程手段可以提高重组 蛋白的活性，改善制品的稳定性，提高生物利用度，延长在体内的半衰期等。水溶性大 分子对蛋白质的化学修饰，不仅能明显延长蛋白质的循环半衰期，还能有效降低或解除 其免疫原性。化学修饰与基因工程、蛋白质工程相结合将会有更好的应用前景。随着各 种技术手段的不断提高，相信未来多肽、蛋白药物具有不可估量的应用前景。 1 4 巴斯德毕赤酵母表达系统 1 4 1 巴斯德毕赤酵母表达系统的特点 巴斯德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 以甲醇作为唯一的能源和碳源，甲醇能够迅速诱 导其合成大量的乙醇氧化酶( a l c o h o lo x i d a s e l ，a o x ) ，a o x 是甲醇代谢途径中的第一 个酶。在巴斯德毕赤酵母中有a o xi 和a o xi i 两个基因编码a o x ，约占全部可溶性蛋 白质的3 0 以上。a o xi 基因严格受甲醇的诱导和调控，a o xi i 基因受甲醇的诱导和 调控较弱，a o x i i 基因与a o xi 基因序列有9 2 的同源性，其编码蛋白质有9 7 的同 源性p7 1 。作为真核表达系统，巴斯德毕赤酵母表达系统正以其独特的优势和潜力得到广 泛使用。其特点如下： ( 1 ) 强有力的乙醇氧化酶a o xi 基因启动子，通过甲醇诱导a o xi 严格调控外源 基因的表达； ( 2 ) 能对表达蛋白进行翻译后的加工和修饰，如二硫键的形成、蛋白磷酸化、蛋 白折叠、信号序列加工等； ( 3 ) 表达量高，外源蛋白表达量可达细胞总蛋白的5 4 0 ； ( 4 ) 自身分泌蛋白少，分泌表达产物较易分离纯化； ( 5 ) 稳定性强，外源基因是和表达载体一起整合到酵母染色体上，随染色体一起 复制和遗传，避免了外源基因的丢失现象； ( 6 ) 对营养要求低、生长快、培养基廉价、可高密度发酵，易于工业化。 1 4 2 表达型巴斯德毕赤酵母宿主菌株 巴斯德毕赤酵母表达株均来源于一种野生型的石油酵母n r r l y 1 1 4 3 0 ，均为组氨 酸营养缺陷突变株( h i s 4 。) 。根据对甲醇利用的情况，将巴斯德毕赤酵母划分为3 种表型， 多数菌株含有a o xi 和a o x i i 基因，在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似，称 为甲醇利用正表型( m u t + ，快生型) ，! z n g s l l 5 ( h i s 4 - m u t + ) ；当a o xi 被其它基因取代， 则需依赖a o x i i ，其甲醇代谢速度慢，称为甲醇利用慢表型( m 酊，慢生型) ，如 k m 7 1 ( h i s 4 m u t s ) ；当a o x 基因全部缺失，则不能利用甲醇，称为甲醇利用负表型( m u 0 ， 如m c l 0 0 2 3 ( h i s 4 m u t 。) 。三型菌株在a o xi 启动子调控下均可诱导外源蛋自的表达，对 这三种菌株的进一步改造，可得到其它衍生的宿主菌，目