肿瘤分子到诊断学.ppt

,肿瘤的分子诊断,本章主要内容,一、分子诊断概述二、肿瘤的分子诊断三、分子诊断在肿瘤研究中的应用四、分子诊断发展前景及存在的问题,分子诊断（moleculardiagnosis),概念：一种疾病的发生常伴有相关基因变化，分子诊断是在分子水平上研究和探索疾病发生的分子基础的方法。,分子诊断的特点：,灵敏度高特异性强适用范围广取材一般不受组织或时相限制,分子诊断目前主要应用于,人类遗传病的基因诊断和产前诊断肿瘤感染性疾病病原体（细菌、病毒）多基因病组织器官移植配型性别鉴定法医学医学分子生物学基础研究应用,肿瘤的分子诊断,与肿瘤相关的基因,癌基因抑癌基因DNA错配修复基因,癌基因：是存在于致瘤病毒、人和动物细胞中能导致细胞恶性转化，促进细胞生长和增殖的一类基因。,RasC-MetMycMdm2NeuBcl-2,抑癌基因：是正常细胞内存在的能够抑制细胞恶性转化，对正常细胞的增殖起负性调节作用的基因，抑癌基因失活后正常细胞增殖失控，转化形成肿瘤细胞。,RbPTENAPCMCCVHLP53FHITWTIDPC4P16BRCANF1NF2nm23P15DCCHNPCC,肿瘤分子诊断的基础基因改变,点突变基因扩增基因缺失、易位或重排DNA甲基化DNA多态,原癌基因恶性肿瘤激活方式abl慢性粒细胞白血病易位bcl2B细胞淋巴瘤易位bcl3慢性粒细胞白血病易位cerbB鳞状细胞癌、星形细胞瘤扩增cerbB2乳腺癌、卵巢癌、胃癌扩增lym1B细胞淋巴瘤易位pml急性前髓白血病易位mycBurkitt淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、子宫癌易位Lmyc肺癌扩增Nmyc神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤扩增Hras膀胱癌、胃癌、鼻咽癌、宫颈癌、黑素瘤、点突变Kras肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、胆囊癌、甲状腺癌、黑素瘤点突变Nras急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、点突变生殖泌尿道癌、甲状腺癌、肝癌、黑素瘤ret甲状腺癌重排Ksam胃癌扩增sis星形细胞瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤？src、fes肠癌、急性早幼粒细胞白血病？tal1急性淋巴细胞白血病易位trk甲状腺癌重排ros急性粒细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病？fms绒癌、外阴癌、畸胎瘤扩增,常见原癌基因的激活方式和人类肿瘤,点突变,指基因在特定位置发生一个核苷酸的改变，使相应蛋白质的一个氨基酸改变，继而改变了蛋白质的空间构型和生物学功能。,点突变,1234567891011121314蛋苏谷酪赖亮缬缬缬甘丙甘甘缬,ATGACGGAATATAAGCTGGTGGTGGTGGGCGCCGGCGGTGTG,GTC,缬,H-ras基因的点突变,正常P21蛋白,细胞H-ras基因,EJ/24膀胱癌H-ras基因,肿瘤H-ras编码的P21蛋白,Ras基因点突变及导致的肿瘤基因密码子点突变氨基酸改变肿瘤Hras12GGCGTC甘氨酸缬氨酸膀胱癌、胃癌、鼻咽癌、宫颈癌GGCGAC甘氨酸门冬氨酸乳腺癌、肠癌61CAGCTG谷氨酰胺亮氨酸膀胱癌、肺癌、黑素瘤CAGCGG甘氨酸精氨酸肾癌Kras12GGTCGT甘氨酸精氨酸膀胱癌GGTAGT甘氨酸丝氨酸胃腺癌、胆囊癌GGTTGT甘氨酸半胱氨酸肺癌、肠癌、慢性粒细胞白血病GGTGAT甘氨酸门冬氨酸胰腺癌GGTGTT甘氨酸缬氨酸结肠癌、卵巢癌13GGCGAC甘氨酸门冬氨酸乳腺癌61CAACAT谷氨酰胺组氨酸肺癌CAACTA谷氨酰胺亮氨酸肺癌Nras12GGTAGT甘氨酸丝氨酸髓样增生综合征GGTGTT甘氨酸缬氨酸急性粒细胞白血病GGTGAT甘氨酸门冬氨酸急性粒细胞白血病、畸胎瘤13GGTCGT甘氨酸精氨酸肺腺癌GGTGTT甘氨酸缬氨酸急性粒细胞白血病GGTGAT甘氨酸门冬氨酸急性粒细胞白血病61CAAAAA谷氨酰胺赖氨酸神经母细胞瘤、纤维肉瘤、黑素瘤CAACAT谷氨酰胺组氨酸横纹肌肉瘤CAACTA谷氨酰胺亮氨酸早幼粒细胞白血病,基因扩增,是细胞原癌基因在细胞基因组内拷贝数的增加及其表达水平的增高。基因扩增是由于基因DNA的过度复制所致，常引起细胞核型改变，表现为出现无着丝点的双微粒体(DMs)和缺乏正常明暗交替染色带的均匀染色区（HSRs)。,基因扩增,8,c-myc,HSR,DMs,扩增,原癌基因的扩增激活与人类肿瘤扩增的原癌基因肿瘤cmyc白血病、乳腺癌、胃癌、肺癌、肠癌、神经母细胞瘤、胶质细胞瘤Nmyc神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、肺癌Lmyc肺癌erbB胶质细胞瘤、鳞状细胞癌erbB2乳腺癌、唾液腺癌、卵巢癌int2乳腺癌、膀胱癌、胃鳞状细胞癌hst乳腺癌、膀胱癌、胃癌abl慢性粒细胞白血病myb肠癌、白血病ets1淋巴瘤Hras膀胱癌Kras肺癌、卵巢癌、膀胱癌Nras乳腺癌,基因缺失,基因片段的缺失是另一种主要的基因变异形式，缺失的范围差别较大，可以是1-2个碱基，也可以是一个片段或一个外显子的缺失。,*杂合型缺失,杂合型缺失(lossofheterozygosity,LOH)同一患者正常细胞DNA存在两个等位基因，而肿瘤组织DNA中仅存在一个等位基因，因为肿瘤细胞单条染色体中一个等位基因缺失，把这种改变称为杂合型缺失。,正常组织杂合状态下等位基因有两条电泳带，当肿瘤组织等位DNA两条带中的一条较正常等位基因带明显减弱(70)则认定为LOH(图1)。,*杂合型缺失,某一基因在肿瘤细胞中从染色体的正常位置转移到其他染色体的某个位置上称为易位或重排。,基因易位、重排,基因易位、重排,在一些肿瘤中可以见到异常的染色体，有的长些，有的短些。通过基因部分定位研究，证明在这些异常的染色体中发生了某些基因的易位和重排。由于基因基因的易位和重排，原来无活性的原癌基因被移到某些强的启动基因或增强子附近而被活化，以致原癌基因表达增强，导致肿瘤的发生。,基因易位、重排,相互易位,c-myc,IgH,8,14,8,14,正常染色体,重排染色体,IgH/c-myc,Burkitt淋巴瘤C-myc基因的易位,人肿瘤中细胞癌基因的易位细胞癌染色体染色体人类肿瘤基因定位易位N-myc2p25t(2;8)Burkitt淋巴瘤raf3p25t(3;8)肺癌和肾癌yes6t(6;14)急性淋巴细胞白血病、卵巢癌myc8q24t(8;14),(8;21)急性淋巴细胞白血病、Burkitt淋巴瘤abl9q34t(9;22),(6;9)慢性粒细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病fes15q25t(15;17)慢性粒细胞白血病sis22q12t(9;22),(8;22)慢性粒细胞白血病、Burkitt淋巴瘤,DNA多态性,群体中的不同个体或同一个体的不同染色体DNA核苷酸序列存在许多差异，尤其是非编码区域，大约每几百个碱基中就有一个存在着碱基取代或碱基替代现象，但表型并未改变，这种现象称为DNA多态性。实际上是染色体DNA中核苷酸排列顺序的改变。,DNA多态性,RFLPVNTR小卫星DNA多态微卫星DNA多态单核苷酸多态,RFLP,数量可变的串联重复序列variablenumberoftandemrepeat,VNTR人类基因组中含有一些重复序列家族，有些序列分散在基因组中，有些是以一系列短的重复序列排列组成高变区，其串联重复序列拷贝数可相差很多，约占单倍体DNA的10%，基本上位于非编码区。重复单位以670bp为多，重复次数约6100次，称为数量可变的串联重复序列。,RFLP,限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism）当DNA序列的差异发生在限制性内切酶识别位点或当DNA片段的插入、缺失或重复可使基因组DNA经限制性内切酶水解后发生片段长度改变。因这些特异基因片段是限制性内切酶产生的，在不同个体间可出现不同长度的限制性片段类型，故称为限制性片段长度多态性。,概念,小卫星DNA,细胞内基因组含有大量的碱基重复序列，一般将670bp的串联重复称为小卫星DNA。,微卫星DNA,将14bp的串联重复序列称为微卫星DNA，又称简单重复序列（simplerepeatsequence,SRS)。,微卫星不稳定性,microsateliteinstability,MI是指简单重复序列的增加或丢失，特别是在DNA错配修复系统（DNAmismatchsystem,DNAMMR)缺损的肿瘤基因组中常显示大量的MI。,微卫星不稳定性与肿瘤,微卫星不稳定性,MI与癌基因或抑癌基因的变化之间无明显关系，即癌基因或抑癌基因的突变并不增加微卫星的不稳定性。MI与肿瘤的发展有关，MI仅在肿瘤细胞中发现，从未在正常组织中检测到。在原发与转移性肿瘤中，MI均匀分布于整个肿瘤。在晚期胃癌的MI频率显著高于早期胃癌。,端粒酶与肿瘤的关系及检测,端粒酶与肿瘤端粒：是位于细胞染色体末端的一种由220kb串联的短片段重复序列（TTAGGG)n及一些结合蛋白组成的特殊结构，在染色体定位、复制、保护和控制细胞生长寿命等方面具有重要作用，并与细胞凋亡、细胞转化和永生化密切相关。端粒酶：为由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白复合物（RNP)，含有端粒重复序列的模板，即以自身RNA组分为模板，复制合成端粒序列。目前有关端粒酶活性表达的研究已覆盖了人类大部分的实体瘤。,基因变异及其检测,一、点突变,指基因在特定位置发生一个核苷酸的改变，使相应蛋白质的一个氨基酸改变，继而改变了蛋白质的空间构型和生物学功能。,点突变的检测,等位基因特异性寡核苷酸分析法（allele-specificoligonucleotide,ASO）；等位基因特异性扩增法（allele-specificamplification,ASA）；限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphisim,RFLP）分析；DNA测序；基因芯片,一、已知点突变的检测,点突变的检测,二、未知点突变的检测,单链构象多态性（single-strandconformationalpolymorphisim,SSCP）分析；杂合双链分析法（HA)；变性梯度凝胶电泳法（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE）；突变体富集PCR法；DNA测序；基因芯片,二、基因扩增,是细胞原癌基因在细胞基因组内拷贝数的增加及其表达水平的增高。,基因扩增的检测核酸分子杂交,原位杂交(insituhybridization)和荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization)DNA杂交(Southernblot)原位PCR(insituPCR),DNA的检测,原位杂交分类,基因探针和靶核苷酸不同DNA-DNA杂交DNA-RNA杂交RNA-RNA杂交,探针的标记物是否能被直接检测直接法间接法,原位分子杂交技术优点,特异性强、灵敏度高，具有组织细胞化学染色的可见性既可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究所需样本量少，可用活组织细针穿刺和细胞涂片应用范围广，可对特定的基因（如癌基因、病毒基因）DNA、mRNA的表达进行定位、定性、定量、组织细胞分布和杂交电镜的亚细胞定位研究,基因扩增的检测核酸分子杂交,Northernblot；RT-PCR；基因芯片等。,mRNA的检测：,基因扩增的检测,免疫组织化学法（immunohistochemistry）；联免疫吸附实验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）；蛋白印迹（Westernblot）；流式细胞仪测定法（flowcytometry）；影像细胞测试法（imagecytometry）,蛋白质表达产物的检测：,三、基因缺失、易位与重排,杂合型缺失的检测,PCR-RFLP法;MI标记；,基因缺失、易位、重排的检测,荧光原位杂交（fluorescentinsituhybridization,FISH）比较基因组杂交（comparativegenomichybridization,CGH）,四、基因甲基化改变的检测,限制性酶切结合电泳方法；UvrABC切割试验,五、DNA多态性及其检测,DNA多态性,RFLPMITelomere,RFLP,Southernblot；PCR-RFLP,检测,微卫星不稳定性的检测,基本方法：首先用PCR技术扩增所需的双核苷酸重复序列，然后用凝胶电泳分析DNA序列。优点：比RFLP及其他Southern杂交方法简易快速；可对单个细胞进行检测；可对石蜡包埋的组织进行回顾性研究，使检测目的更明确。,端粒酶活性的检测,基本方法TRAP法接近闪烁分析法TRAP-ELISA法原位杂交法,分子诊断在肿瘤研究中的应用,肿瘤的早期诊断肿瘤的分类肿瘤的个体化和预见性治疗肿瘤的预后判断及检测,肿瘤的早期诊断,胰腺癌：K-Ras基因的第12位编码子突变检出率达100%结肠癌：PCR-RFLP方法检测结肠癌患者粪便中Ras基因突变率达33.3%高危人群的筛选和临床检测：结肠癌,肿瘤易感基因的检测,已明确的肿瘤易感基因及其相关肿瘤Rb1（视网膜母细胞瘤）WT1（肾母细胞瘤）P53（Li-Fraumeni综合征）APC（家族性腺瘤性息肉病）HNPCC（遗传性非息肉病性结肠癌）NF1（神经纤维瘤病）VHL（VonHippel-Lindau综合征）PTEN（Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征和Cowden综合征）BRCA1（乳腺癌）,肿瘤的分类,限制性酶切片段多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)：用于判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤及其克隆起源Bcr区基因重排：可对慢性粒细胞白血病作出诊断并可与急性粒细胞白血病进行鉴别诊断Myc基因检测：通过对N-Myc和C-Myc的扩增和表达检测，对