（工业催化专业论文）重组大肠杆菌生产β葡聚糖酶发酵工艺优化研究.pdf

摘要 本文对利用胞外分泌型重组大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) j m l 0 9 - p l f 3 发酵生 产b 1 ，3 1 ，4 葡聚糖酶的培养基及发酵工艺优化进行了系统的研究。首先对菌种 产酶培养基中的碳、氮源进行了优化，结果表明甘油为最佳碳源，酵母粉和硝酸 钠为最佳混合氮源，且氮源对产酶影响更大。采用p l a c k e t t b u r m a n 设计法筛选 出了培养基中影响产酶的重要因素为酵母粉，确定出最佳培养基组成为：酵母粉 1 2g - l 1 、甘油6g - l - 1 、n a c i1 0g - l 一、n a n 0 3 7 2 1g - l 、k h 2 p 0 4 2 4g - l 1 、k 2 h p 0 4 1 2 5g l _ 1 。对摇瓶中培养条件的优化采用单因子实验法，研究了温度、培养基初 始p h 、转速、装液量、种龄和种量等对工程菌生长和产酶的影响，确定了最佳 培养条件为：温度3 9 、摇床转速1 5 0r m i n 、培养基装量2 0 m l 2 5 0 m l 、培 养基初始p h 自然值、种子培养时间1 6h 、接种量1 。采用优化后的培养基及 培养条件，发酵3 0h 酶活力达最大值4 8 1 4 1u - m l ，为初始条件下的2 3 1 倍， 单位菌体产酶能力达到了3 4 8 1 4u ，约为初始时的8 3 3 倍。摇瓶中对数生长期 流加被证明是非常有效的，以补加高浓度有机、无机混合氮源对产酶影响最大， 且适当提高流加量促进产酶效果更明显，酶活力可达6 2 8 - 3u m l 1 。采用5l 自 动发酵罐，首先对b 葡聚糖酶间歇培养中搅拌速度和通气量进行了研究，发现二 者对菌体生长和产酶都存在一定的影响，且搅拌速度4 0 0r m i n - 1 和通气量2 l r a i n l 的条件对酶的合成最有利。发酵罐中菌体生长情况比较复杂，出现了二 次的现象，针对菌体的生长特点分别采取了对数期流加和稳定期流加两种流加策 略。结果显示，稳定期流加对菌体生长及产酶都有明显的促进作用，酶活力比间 歇培养提高了将近一倍。对p 葡聚糖酶粗酶液性质的研究实验表明，p 葡聚糖酶 粗酶液的最适反应温度为5 0 ，耐热温度也为5 0 。该b - 葡聚稽酶的最适反应 p h 为6 ，在p h 为5 7 的较窄范围内较稳定，而且耐碱性相对较强。金属离子 对b 葡聚糖酶活性的负面影响主要来自f d + 和c u 2 + ，z n 2 + 和m n 2 + 在不同浓度条 件下对b 葡聚糖酶有不同的作用，在低浓度下表现出激活作用，c a 2 + 、m 9 2 + 、 f e 2 + 和c 0 2 + 在1 o 5 0m m 浓度范围内对b 一葡聚糖酶均有激活作用。 关键词：b ，葡聚糖酶大肠杆菌培养基培养条件流加 摘要 a b s t r a c t i nt h ee s s a yt h er e c o m b i n a n te s c h e r i c h i ac e l lj m l 0 9 一p l f 3 ，w h i c hc 锄s e c r e t e h e t e r o l o g o u se n z y m ei n t ot h ec u l t u r em e d i u m ，w a se m p l o y e dt op r o d u c eb l ，3 l ，4 - g l u c a n a s e t h ec o m p o s i t i o no fe n z y m ep r o d u c d o nm e d i u mw a so p t i m i z e d ，a n dt h e f e r m e n t a t i o ns t r a t e g yw a ss y s t e m a t i c a l l ys t u d i e dt oi m p r o v et h ep 1 ，3 1 ，4 - g l u c a n a s e p r o d u c t i o n g l y c e r o l ，y e a s te x t r a c ta n dn a n 0 3t h a tw e r ef o u n di n f l u e n c i n ge n z y m e p r o d u c t i o ns i g n i f i c a n t l yw e r ed e f i n e d 船t h eo p t i m u mc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e s t h eo p t i m i z e dm e d i u mw a so b t a i n e d ：y e a s te x t r a c t1 2g - l ，g l y c e r o l6g l 1 ，n a c i1 0 g l ，n a n 0 3 7 2 5g - l ，k h 2 p 0 42 4g - l 1 ，k 2 h p 0 45 2 5g l t h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n so fr e c o m b i n a n te s c h e r i c h i ac o bf o rc e l lg r o w t ha n dp - g l u e a n a s e p r o d u c t i o nw e r ei n v e s t i g a t e du s i n gs i n g t ef a c t o rd e s i g n t h eo p t i m i z e do p e r a t i o n a l c o n d i t i o n s 、怵t e m p e r a t u r e3 9 ，s h a k i n gs p e e d1 5 0r + r a i n ，c u l t u r ev o l u m e2 0 m l 2 5 0m l ，i n i t i a lp hn a t u r a lv a l u e ，i n o c u l a t i n ga g e1 6 h ，i n o c u l a t i n gq u a n t i t y1 0 am a x i m u mo f4 8 5 4 5u m l 11 3 - # 砒a n a s ea c t i v i t ya n d3 4 9 4 1u - m 9 1o fe n z y m e p r o d u c t i v i t yo ft h er e c o m b i n a n ts t 衄a l m o s t1 4 3t i m e sa n d8 3 3t i m e sh i g h e rt h a n t h a to ft h ei n i t i a lc o n d i t i o n sr e s p e c t i v e l y , w e r ea t t a i n e da f t e r3 0hf e r m e n t a t i o n f e e d i n gi d i x t eo fo r g a n i ca n di n o r g a n i cn i t r o g e ns m u c e sa te x p o n e m i a lp h a s ei n s h a k ef l a s k sw a sp r o v e de f f i c i e n ta n d6 2 8 _ 3u m l 。11 3 - 四u c a n a s ea c t i v i t yw a so b t a i n e d b a t c hf e r m e n t a t i o no fp - g l u c a n a s ei n5lf e r m e n t e rw a sc a r r i e do u ta td i f f e r e n t s t i r r i n gs p e e d sa n da e r a t i o nr a t e s t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r es t i r r i n gs p e e d4 0 0 r m i l l - 1 ，a e r a t i o nr a t e2l m i n 1 c e l lg r o w t hi nf e r m e n t e rw a sc o m p l i c a t e d ，a n dt h e s e c o n d t i m eg r o w t hw a sf o u n d f e e d i n gs t r a t e g i e sa te x p o n e n t i a la n ds t a t i o n a r y p h a s e sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ec h a r a c t e r i s t i c so fc e l lg r o w t h t h er e s u l t s d i s p l a y e dt h a tf e e d i n ga ts t a t i o n a r yp h a s ec a ns i g n i f i c a n t l yi m p r o v ec e l lg r o w t ha n d e n z y m ep r o d u c t i o nw i t l li b - g l u c a n a s ea c t i v i t yb e i n ga l m o s to n et i m eh i g h e rt h a nt h a t o fb a t c hf e r m e n t a t i o n t h ec r u d ei g l u c a n a s ee x t r a c tw a sr e l a t i v e l ys t a b l ea tb l o w5 0 a n dp h5 - - 7f o r6 0 m i n a n dw a sm o r ea d a p t a b l et oa l k a l e s c e n c e t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r ew a s5 0 ，a n dt h eo p t i m u mp hw a s6 0 t h eb - g l u c a n a s ea c t i v i t yw a s 2 摘要 s i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e db yf e 3 + a n dc u 2 + 。a n dw a sw e a k e n e di nt h ep r e s e n c eo f z n 2 + a n dm n 2 + a t5 m m h o w e v e r ，c a 2 + 、m 矿、f e 2 + a n dc j + a tt h er a n g eo f1 0m mt o 5 0m mc a l ls t i m u l a t et h e1 3 - g l u c a n a s ea c t i v i t y k e yw o r d s ：1 3 - g l u c a n a s e e s c h e r i c h i ac o l ic u l t u r em e d i u m o p e r a t i o n a lc o n d i t i o n f e d b a t c h 3 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利 和责任。 声明人( 签名) ：玩占帮 泸6 年7 月2 6 曰 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦 门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸 质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允 许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关 数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密 的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 l 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( ) ( 请在以上相应括号内打“”) 作者签名：程盎赦 聊戳干钎 日期：枷l 年7 月6 e t 日期：协年月日 第一章绪论 第一章绪论 引言 b 葡聚糖是类广泛存在于高等植物和真菌细胞壁中的多糖，是自然合成 的多糖中含量最多的，主要为b 1 ，4 葡聚糖即纤维素。由于纤维素广泛而大量 地存在于自然界，许多关于b - 葡聚糖的研究都是针对于纤维素的，以致很长一 段时间有关争葡聚糖酶的研究一直停留在对纤维素酶的研究阶段。六十年代， 首次出现了来源于丝状真菌的可降解非纤维素p 葡聚糖的p - 葡聚糖酶的报道， 从那时起有关非纤维素酶系b - 葡聚糖酶的研究才真正开始【l 】。 b 葡聚糖酶种类繁多，可以由植物和微生物产生。来源不同的酶制备方法 有所差别，酶的性质也不尽相同，因此，应用范围也不同。目前，b 葡聚糖酶 在工业上已得到了广泛应用，在食品、造纸、纺织、r 化等领域发挥着巨大的 作用。现在饲料工业中发现，b 葡聚糖是谷物的重要抗营养因子，在饲料中添 加p 葡聚糖酶，特别是内切 葡聚糖酶，可迅速降低谷物中p 葡聚糖的粘度， 大大提高饲料的生物转化率 2 1 。1 9 6 1 年，m o s c a t e l l i 等人首次发现了b 1 ，3 1 ，4 - 葡聚糖酶( e c 3 2 1 7 3 ) ，此酶只能水解肛l ，3 和p 1 ，4 混合键连接的葡聚糖， 对单一含有b 1 ，3 或b 1 ，4 糖苷键的葡聚糖不起作用。由于大麦等谷类作物中都 含有大量混合的3 - l ，3 和p - i ，4 糖苷键，因此该酶在作为饲料添加剂改善谷类营 养价值和改善啤酒风味方藤发挥着重要的作用。1 9 7 5 年，美国首先正式使用8 葡聚糖酶加入饲料大麦来消除抗营养因子，取得良好效果，随后酶作为饲料添 加剂的研究和应用得以推广。随着畜禽业的不断发展，以应用葡聚糖酶作为 一种新型饲料添加剂已日益为人们所重视，而如何找到一种生产b 一葡聚糖酶的 高产菌株也已成为科学工作者关注的焦点。 1 1p - 葡聚糖和p 葡聚糖酶 1 1 1p - 葡聚糖 p 葡聚糖是由葡萄糖单元通过p - 0 ，3 ) 、p 一( 1 ，4 ) 等糖萤键连接而成的d 型葡 第一章绪论 萄糖聚合物，按照其糖苷键的不同类型主要可分为：b 1 ，4 一葡聚糖( 纤维素) ， p i ，3 葡聚糖( 昆布多糖) ，p ，l ，3 i ，4 葡聚糖( 谷物葡聚糖) 和p 1 ，6 葡聚糖( 石 耳素) 等 3 1 。b 1 ，3 葡聚糖是绝大多数真菌细胞壁的主要成分，在许多真菌细胞 壁中还可以发现b 1 ，3 - 1 ，6 - 葡聚糖。 p 1 ，3 i ，4 葡聚糖属于植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖( n o n s t a r c h y p o l y s a c c h a r i d c s ，n s p ) ，一般分为水溶性和水不溶性两种，与蛋白质结合的大都 不溶于水，而水溶性b 葡聚糖所占比例较大。b 葡聚糖分子结构中p - i ，3 糖苷键 的含量和糖的聚合度是影响其水溶性的主要因素。水溶性8 葡聚糖中约9 0 是 由p 1 ，3 糖苷键随机连接起来的纤维三糖和纤维四糖构成，1 0 由争l ，3 糖苷键 连接的1 0 个或1 0 个以上b i 4 糖苷键组成的部分构成 4 j 。 1 1 2p 葡聚糖酶的分类及作用方式 p 葡聚糖酶是指可以使p 葡聚糖降解为小分子糖的酶，系酶系家族中的水解 酶类，按照其作用方式可分为内切、外切和葡萄糖苷酶，主要包括内阻1 ，3 葡聚 糖酶( e c 3 2 1 3 9 ) ，内一p 1 ，4 葡聚糖酶( e c 3 2 1 4 ) ，内争1 ，3 1 ，4 葡聚糖酶( e c 3 2 1 7 3 ) ，外p 1 ，3 葡聚糖酶( e c 3 2 1 5 9 ) ，外b 1 ，4 葡聚糖酶( e c 3 2 1 7 4 ) 以 及少数内一b 一1 ，6 - 葡聚糖酶( e c 3 2 1 7 5 ) 和内b 1 ，2 葡聚糖酶( e c 3 2 1 7 1 ) 。内 切型p 一葡聚糖酶主要以随机的方式将b 葡聚糖降解成数段短链，外切酶则是从非 还原末端开始作用，将b 葡聚糖切成一个个的葡萄糖，b 葡聚糖的完全降解一般 都是两类酶协同作用的结果【1 1 。p 葡萄糖苷酶( e c 3 2 1 2 1 ) 又称d d 葡萄糖苷 葡萄糖水解酶，是纤维素酶系中的一个组成部分，该酶主要作用于b ( 1 ，4 ) 糖苷键， 还能作用一t - ( 1 ，1 ) 、( 1 ，2 ) 、( 1 ，3 ) 、( 1 , 6 ) 键，将内切、外切葡聚糖酶水解下来的纤 维二糖再次降解成葡萄糖，能够水解结合于末端、非还原性的b d 糖苷键，同时 释放出b d 一葡萄糖和相应的配基【”。 降解谷物中d 1 ，3 1 ，4 一葡聚糖的内切葡聚糖酶主要分三类1 6 1 ：( i ) 1 , 3 1 ，4 一p d 葡聚糖酶或地衣多糖酶，严格水解与p 一1 ，3 糖苷键相邻的b 1 ，4 糖苷键；( i i ) 内切1 ，4 d d 一葡聚糖酶( 内切纤维素酶) 或羧甲基纤维素酶( c m c a s e ，一般认 为c m c a s e 与内切1 , 4 一b d 葡聚糖酶是同义的【7 】) ，对( i ) 所水解的键以外的 p 1 ，4 糖苷键起作用；( i i i ) 内切1 ，3 d d 葡聚糖酶或昆布多糖酶。 2 第一章绪论 事实上，内切和外切酶的划分只是人为的，并不存在完全意义上的内切或 外切葡聚糖酶，不同来源不同种类的酶都可能同时具有内切和外切两种作用方 式，只是哪一种方式占主要地位的问题。v l a s e n k o 等人( 1 9 9 8 ) 【8 l 根据粘度法 与还原糖法测得的初始酶活力比值将内切b 葡聚糖酶分为四组( 表1 1 ) ，i 组 对于多聚糖链末端键具有较高的水解活性，而组则更接近于真正的内切b 葡 聚糖酶。 表1 1 【8 】采用毛细管粘度法和b c a 法4 测得的内切葡聚糖酶 比活力及二者的比值 t a b l e l - ls p e c i f i ca c t i v i t i e so f e n d o g l u c a n a s ed e t e r m i n e db yc a p i l l a r yv i s c o m e t r y a n db yb c a a n a l y s i sa n dr a t i o sb e t w e e nv i s e o m e t r i ea n dr e d u c t o m e t r i ca c t i v i t i e s 1 水解条件：底物c m c 浓度为5 m gm l - p h 5 0 ，4 0 c 1 1 3 葡聚糖酶的来源 b 葡聚糖酶来源广泛，在细菌、真菌、放线菌、藻类、高等植物1 9 1 1 1 0 j 【1 1 1 、软 体动物【1 2 1 f 1 3 】1 1 4 1 和昆虫口】【1 5 1 中普遍存在，其中真菌为b 1 ，3 葡聚糖酶的主要来源， 同时b 1 ，3 葡聚糖酶在高等植物内分布也很广，它们在植物正常发育中发挥重 要作用。绝大多数菌株的酶系对大麦b 葡聚糖无特异性，而能特异分解大麦p 葡聚糖的b 1 ，3 1 ，4 葡聚糖酶主要来源于芽孢杆菌f 16 】【1 7 1 s l 、瘤胃微生物和少 第一章绪论 数真菌【6 】【2 0 】【2 l 】。b 。1 ，6 葡聚糖酶产生菌的报道相对较少，一般都为真菌 2 2 1 或细 菌】以及放线菌【2 4 】。而关于b 1 ，2 葡聚糖酶的制备至今少有报道，但已知许多 真菌口5 1 和少数细菌1 2 6 可生产此酶。 1 2b 葡聚糖酶的现状及应用 1 2 1 现状 国外b 葡聚糖酶的大量研究工作始于二十世纪六十年代，由于其对大麦、 黑麦中的b 葡聚糖具有重要作用，故早期在国外主要应用于啤酒工业，并于七、 八十年代在此领域广泛应用。据9 0 年代初统计，世界上酶制剂生产厂商大约有 7 0 多家，其中较大的有2 5 家，如丹麦n o v o 公司、荷兰g i s t 公司( g i s tb r o c a d e s 公司已于1 9 9 5 年6 月被美国g e n e n c o r 公司收购) 和芬兰c u l t o r 公司等。这些 酶制剂公司的产品有的是单纯含b 葡聚糖酶制剂，有的则是混合酶性质，一些 有代表性的产品见表l - 2 。饲用酶制剂的商业化应用于1 9 7 5 年开始。英国九十 年代初酶制剂在鸡饲料中的添加率几乎等于零，而现在9 5 以上的鸡饲料都添 加酶制剂。1 9 9 6 年，酒精发酵和饲料工业占世界工业用酶涉及行业比重分别为 7 2 和1 0 1 ，酶制剂公司所生产的b 葡聚糖酶制剂在这两个行业中的销售额 分别达到o 1 和0 5 亿美元，占工业用酶总销售额的4 3 l 1 2 7 】。 表i - 2 口刀国外常用b 葡聚糖酶制剂类型 t a b l e l 2o v e r s e a1 3 - g l u c a n a s ep r e p a r a t i o n s 八十年代初，国外p 葡聚糖酶制剂产品逐渐进入国内市场，外加p 一葡聚糖 4 第一章绪论 酶的工艺也逐渐为国内一些名牌或大型厂家所采用。我国于八十年代将该酶的 生产及研究列入“六五”和“七五”攻关项目的子专题，在获得工业化生产菌后， 又列入国家“火炬计划”，并于9 0 年代建厂生产和推广应用。二十世纪末8 葡聚 糖酶大规模应用于啤酒工业，效益显著。然而多年来，由于国内所需b 葡聚糖 酶多以纤维素酶制剂代用，但纤维素酶作用的局限性( 仅能催化8 - 葡聚糖分子 中连续的l ，4 _ b d 糖苷键水解而对其它键不起作用) 使应用效果不甚理想。近 年来国内已有生产的b 葡聚糖酶无论从酶活还是性能方面，部分已达到国外同 类产品的水平。“九五”国家科技攻关专题“饲用酶制剂和诱食剂新品种的研究与 开发”，日前已在北京通过国家科技部组织的专家验收，其中就包括b _ 葡聚糖酶 新菌株、新品种的开发，而且成本低于进口产品。 随着我国工业的不断发展，阻葡聚糖酶在食品、酿造、纺织等行业中的需求 量不断增长。大麦是我国主要谷物之一，产量仅次于小麦、稻谷和玉米，位居第 四。近年来，随着畜禽饲料生产的规模化、现代化，谷物饲料尤其是大麦饲料的 用量不断增长，这一趋势使得b 葡聚糖酶的需求量也持续增加。我国饲用酶制剂 的应用从开始的怀疑、观望到现在的完全接受并开始大面积使用，经历了大约l o 年的时间，目前已经形成了具有相当规模的酶制剂市场，据不完全统计，国外约 有1 7 家企业的饲用酶制剂产品出现，国内大约有1 0 0 多家具有一定生产能力酶制 剂的企业，随着大批生产工业酶制剂厂家向饲料行业的转型，这个数字还会增加。 但目前由于我国酶制剂生产厂工艺、设备落后，研究开发的经费投入不足，全部 经费不到产品销售额的1 ，因此科技人员数量很少，新产品的开发受到很大制 约，新酶种和新用途的研制、开发速度非常缓慢，再加上产品结构不合理，迄今 为止，真正形成生产规模的只有洳淀粉酶、糖化酶和碱性蛋白酶等3 4 个产品， 对b 葡聚糖酶的研究大多处于实验室研制阶段，酶合成能力较低，所需很多酶制 剂仍然依赖进口。 1 2 2 应用 1 2 2 1 应用于啤酒工业 大麦是啤酒制造的主要原料，b 葡聚糖占大麦胚乳细胞壁内物质的7 5 ， 水溶性b 葡聚糖是造成啤酒酒体混浊，泡沫持久力减少和挂杯力不强的主要原 第一章绪论 因之一。b 1 ，3 1 ，4 葡聚糖酶主要应用于啤酒工业，专一地分解粘度很高的各种 大麦b - 葡聚糖，降低麦汁粘度，提高麦汁滤速及得率，有利于改善啤酒风味， 保持成品酒非生物稳定性。优质大麦发芽时此酶含量丰富，使大麦胚乳中的8 葡聚糖得以分解，而劣质大麦有赖于添加此酶以弥补含酶量的不足【勰】。 1 2 2 2 在畜禽生产中的应用 玉米一直是我国主要的能量饲料，但玉米的供应同趋紧张，应用丰富的麦类 饲料作能量饲料越来越受到重视。在国外，7 0 年代末期就开始利用大麦饲料进行 试验，8 0 年代后，进入大规模的实用阶段。但是，麦类饲料中含有丰富的8 葡聚 糖，单胃动物由于自身不具备合成p 葡聚糖酶的微生物及分解 葡聚糖的酶系， 使食糜在肠道中具有较高的粘度，阻止营养物质特别是蛋白质和脂肪的吸收，降 低了饲料的转化率，成为一种抗营养因子，同时为微生物特别是致病菌的寄居繁 殖提供了丰富的营养，限制了麦类作物在饲料中的应用【捌【3 0 1 。在饲料中添加b 葡聚糖酶( 属于外源酶) 包括p 1 ，3 1 ，4 葡聚糖酶、p l ，4 葡聚糖酶和昆布多糖酶 等，不仅可以降低b 葡聚糖的粘度，而且能改善麦类的营养价值，同时减少了排 泄物对环境的污染。尤其是内切形式的p 葡聚糖酶，由于其随机作用于b 葡萄糖 苷键，因此，较外切酶对降低b 葡聚糖产生的粘性的效果更显著，是饲料中主要 应用的p 葡聚糖酶。 1 2 2 3 在植物有害真菌防治中的应用 b 1 ，3 葡聚糖是绝大多数真菌细胞壁的主要成分，而仅在植物体部分细胞中 少量存在。许多植物中都含有一种以上的p 1 ，3 葡聚糖酶，以随机作用方式将b 葡聚糖分解成为糊精或寡聚糖，从而使植物具有抵抗真菌侵染的能力。根据酶 的氨基酸顺序可将植物p - 1 ，3 葡聚糖酶分成3 类：i 类是碱性酶，体外具强抑 真菌活性，位于液泡内；另外两类是酸性酶，体外无抑菌活性，主要分布于细 胞间隙内。在正常情况下，高等植物中b 1 ，3 葡聚糖酶只有低水平的组成型表 达，而当植物被真菌、细菌、病毒、机械损伤以及乙烯等诱导，其含量和活性 可提高几十倍至几百倍，特别是在几丁质酶的协同作用下，可明显抑制真菌的 生长。b 一1 ，3 葡聚糖酶抑制病原真菌生长的同时降解植物细胞壁而释放内源性寡 糖激发子进而诱导植物其它的防御反应。目前，b 1 ，3 葡聚糖酶基因在植物抗 病基因工程研究中已被认为是最具吸引力的基因之一。 6 第一牵绪论 1 2 2 4 在水解酵母细胞壁方面的应用 酵母细胞壁的骨架成分耻葡聚糖是维系细胞壁刚性的主要物质，其中8 5 左右为b 1 ，3 葡聚糖。在1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶的作用下，多聚糖链断裂葡聚糖水解 为寡糖或还原糖，因此，酶能够疏松细胞壁，促使细胞内容物外溢。使用酶法 水解酵母细胞壁可以提高酵母自溶产率，保持抽提物( 如蛋白质等) 的活性和 细胞器的完整，无毒安全，避免了使用酸碱、机械等方法破壁带来的污染以及 抽提物失活等问题。 t 云) 1 1 和殷蔚申( 1 9 9 8 ) 3 2 研究了来源于冻土毛霉( m u c o rh i e m a l i s ) 的b 1 ，3 葡聚糖酶在促进酵母细胞自溶方面的应用。酵母细胞自溶结果如表1 - 3 所示， 添加肛l ，3 葡聚糖酶后，酶作用于酵母细胞壁释放还原糖，一方面使自溶液含 糖量提高；另一方面协助酵母自溶，随着胞内物质外渗，自溶液中游离氨基氮 含量增加。加酶后促自溶效果明显。自溶液干物质得率和蛋白质得率得以提高， 而且自溶液中含盐量基本保持稳定，不会造成产物中盐浓度过高的现象。 表1 _ 3e 3 2 酵母自溶上清液产物分析 游离氨基氮干物质蛋白质 液渣比还原糖含最含盐量 样品含量得率得率 ( w w )( p g m l l )( g l o o m l 1 ) ( g l o o m l )( ) ( ) 啤酒酵母 对照 啤酒酵母 加酶 面包酵母 对照 面包酵母 加酶 0 4 1 08 9 90 9 54 9 _ 3 34 8 9 6 2 1 3 10 4 6 01 0 6 00 9 45 2 ，2 25 3 7 l 3 6 4 10 1 8 12 l | 32 7 9 0 3 8 1 10 2 0 55 6 6 2 4 0 03 2 5 0 1 。2 2 。5 其它方面的应用 第一章绪论 p 1 ，3 葡聚糖酶除有上述应用外还可用于分析真菌细胞壁的结构、啤酒和葡 萄酒的澄清，饲料中以增加畜禽采食量，多糖改性增溶等方面。 肛l ，4 葡聚糖酶除可用于饲料添加剂外，还可用于牙膏中起到明显的洁齿作 用，应用于洗涤剂中增强洗涤产品的去污能力【3 3 1 ，同时在食品、造纸、油井压 裂等许多方面也被广泛应用【3 4 j 。 b 1 ，6 葡聚糖酶目前主要应用于分析真菌细胞壁的结构。 b 葡萄糖苷酶可将水果中以键合态存在的香气组分释放出来，增加水果的香 气，从而提高果蔬制品的品质，通过b 葡萄糖苷酶的作用还可加工天然色素。应 用于饮料工业中，能够水解释放茶叶饮料中糖苷类香气成分( 芳樟醇、香叶醇等) 。 1 3 弘葡聚糖酶的生产 1 3 1 酶的生产方法 酶的生产方法可以分为提取分离法、化学合成法和生物合成法( 即发酵法) 等三种。 1 3 1 1 提取分离法 提取分离法是采用各种提取、分离、纯化技术从动物、植物的组织器官中 将酶提取出来，再进行分离纯化的技术过程。提取分离法是最早采用的酶生产 方法，现在仍然继续使用。此法中采用的各种提取、分离、纯化技术在其它的 酶生产方法中也是重要的技术环节。该法设备较简单，操作较方便，但必须首 先获得含酶的动物、植物的组织或细胞，这就使该法受到生物资源、地理环境、 气候条件等的影响。近年来，从动、植物组织或细胞中提取b 葡聚糖酶的研究 已有相当大的进展。 2 0 0 4 年，x u 和d i s t e l 1 2 1 从海洋软体动物( l y r o d u sp e d i c e l l a t u s ) 体内提取 出了一种内切一b 1 ，4 葡聚糖酶。具体做法为：将从海水中得到的动物样本分别 用经过不同处理的海水清洗三次，去壳，将留下的完整细胞组织立即放入装有 缓冲液的研磨机中研磨均匀，再于相同条件下离心两次，除去不溶的死细胞， 上清液浓缩1 0 倍后用于提取p 一葡聚糖酶。p 葡聚糖酶的提纯步骤如表1 - 4 所示， 最后得到纯化倍数为3 7 8 ，比活力为5 3 u m g “的内切一b 一1 ，4 葡聚糖酶。 第一章绪论 表1 - 4 l y r o d u s p e d i c e u a t u s 细胞提取液中内切一1 3 1 ，4 啊葡聚糖酶纯化结果 t a b l e l - 4p u r i f i c a t i o no f e n d o - 1 3 1 , 4 g l u e a n a s ef r o ml y r o d u s p e d i c e l l a t u s 。3 7 下，底物c m c 每分钟水解出相当于i p m o l 葡萄糖为一个酶活单位。 这方面的研究还包括，王骥等( 2 0 0 1 ) f 3 5 1 从福寿螺( a m p u l l a r i ac r o s s e a n ) 中提取出内切p l ，4 - 葡聚糖酶：c l a u d i a 等( 2 0 0 1 ) h 1 将酸性b 1 ，3 葡聚糖酶从 马铃薯块茎中提取；x u 等( 2 0 0 0 年) 1 1 3 1 和s u z u k i 等( 2 0 0 3 ) 【1 4 】分别从鲍鱼和 篮蚌中提取出内切1 3 1 4 葡聚糖酶；f e m a n d o 等人( 2 0 0 3 ) 【3 1 从p e r p l a n e t a a m e r i c a n a 的唾液腺和肠中提取出三种昆布多糖酶和两种内切纤维素酶，等等。 1 3 1 2 化学合成法 化学合成法是2 0 世纪6 0 年代中期出现的新技术，现在已可以采用合成仪 进行酶的化学合成。然而由于酶的化学合成要求单体达到很高的纯度，而且只 能合成那些已经搞清楚其化学结构的酶，这就使化学合成法受到限制，难以工 业化生产。由此可见，利用化学合成法来进行酶的大规模生产是没有必要也是 难于实现的。然而，利用化学合成法进行酶的人工模拟和化学修饰，设计和合 成具有酶的催化特点又克服酶的弱点的高效非蛋白质分子一模拟酶，却己成为 人们关注的课题。模拟酶比天然酶简单，也不同于蛋白质或多肽类的非天然催 化剂一人工酶。 对酶功能模拟一般分为三个层次【3 6 】：( 1 ) 合成有催化活性的简单络合物。 催化效率和专一性都很低，与酶催化机理不同；( 2 ) 对酶活性中心的模拟。络 合物具有一定的催化效率和专一性，催化枧理开始接近于酶；( 3 ) 整体模拟， 第一章绪论 包括微环境在内的整个活性部位、作用机理的模拟。近年来酶功能的模拟多集 中于第二个层次上。 1 3 1 3 生物合成法 生物合成法，即发酵法，是2 0 世纪5 0 年代以来酶的主要生产方法。该法 利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的生命活动获得人们所需的酶。根据细 胞培养方式的不同，发酵法可以分为液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细 胞发酵和固定化原生质体发酵等，现在普遍使用的是液体深层发酵技术。2 0 世 纪7 0 年代兴起并发展了植物细胞培养和动物细胞培养技术，使酶的生产方法进 一步发展。 目前，国内外主要采用发酵法生产b 葡聚糖酶，且主要利用微生物生产。 利用微生物生产p 葡聚糖酶具有以下特点 3 7 1 ：( 1 ) 种类繁多，易变异，可根据 酶作用的p h 、作用温度及底物特异性的不同而定向选育优良产酶菌株；( 2 ) 微 生物生长繁殖快，易获纯培养，便于进行连续的工业化生产；( 3 ) 产酶周期短、 原料来源广、发酵产物单纯，易获高纯度的酶制剂。 1 3 2 生物合成法生产肛葡聚糖酶 产p 葡聚糖酶菌株的培养方法大部分采用液体深层发酵法，也有部分采用 固体发酵培养或固定化细胞发酵等方法。 1 3 2 1 液体深层发酵 液体深层发酵是微生物细胞在发酵液中进行厌氧或需氧的纯种培养过程， 是目前p - 葡聚糖酶发酵生产的主要方式。该法不仅适用于微生物细胞，也可用 于各种植物细胞和动物细胞的悬浮培养和发酵。发酵方式包括摇瓶发酵培养和 发酵罐培养，也可分为间歇发酵、流加发酵和连续发酵。 1 3 2 1 1 间歇发酵 间歇发酵过程由于其操作比较简单，发酵周期短，应用相当广泛。在b 葡 聚糖酶的生产中，国内大多数研究者都采用此种方法。然而间歇发酵过程有明 显的局限性：一方面，要达到比较高的培养密度或较高产物量，就必须加入较 高浓度的营养物质，但培养基中营养物质( 包括碳源和氮源) 的浓度高于一定 值之后，便会对微生物的生长产生抑制作用；另方面，由于底物浓度始终较 高，会导致一些抑制性副产物的积累，对细胞生长和蛋白质表达均有抑制作用。 0 第一章绪论 郑毅等( 2 0 0 1 ) 1 3 s ! 在研究黑曲霉f s 2 5 摇瓶发酵生产b 1 ，3 1 ，4 葡聚糖酶时， 初步设计了f s 2 5 的初始产酶培养基为：大麦粉5g 、黄豆饼粉2g 、n a n 0 30 3g 、 k 2 h p 0 4 。3 h 2 00 1g 、m g s 0 4 7 1 4 2 0o 0 5g 、f e s 0 t 7 h 2 00 0 0 1g 、c a c 0 30 5g 、 麸皮o 8g ：定容1 0 0 m l ，p n 为6 4 ；2 5 0 m l 三角瓶分装5 0 m l 。初始产酶条 件为：将斜面菌种接种于5 0 m l 2 5 0 m l 产酶培养基中，3 0 、2 0 0r i r a i n “摇瓶 培养发酵5 0h 。在初始条件下产肛葡聚糖酶活力为4 3 5u m l 。为了提高酶的 产量及活性，对碳源、氮源、培养基初始p h 、温度、摇瓶装液量、接种量及培 养时间进行了优化。确定最优产酶培养基及产酶条件为：大麦粉6g 、玉米浆2 g 、( n i - h h s 0 4 0 4g 、初始p h5 0 、温度3 21 2 、2 5 0m l 三角瓶装量5 0m l 、接 种量1 5m l 、培养3 0h ，在此条件下发酵结果如图1 - 1 所示，生物量达到最高 峰，酶活也达到最大值8 0 1u m l ，比初始产酶水平提高了8 4 1 ，随时间延 长，虽然生物量基本维持不变，但残糖逐渐减少，产酶水平也逐渐下降。 尸生物量“1 ) ，+ 相对殁糖( * ) ， 一相对酶活啦) 。o p h 图1 - 1 【3 叼黑曲霉f s 2 5 发酵产融葡聚糖酶生化曲线 f i g 1 - 1b a t c hc u l t i v a t i o no f a s p e r g i l l u sn i g e rp r o d u c i n g6 - g l u c a n a s e b e s h a y 等( 2 0 0 3 ) 分别采用摇瓶和发酵罐培养重组e + c o l i b l 2 1 ，用于生 产来源于芽孢杆菌的杂合b 1 ，3 - 葡聚糖酶，并对其发酵条件进行了研究。初始 产酶培养基( t b g ) 为：酪蛋白，1 2g - l ：酵母粉，2 4g l ：n a c i ，2 0g l 一1 甘 油，4g - l ：k h 2 p 0 4 ，2 3g l 1 和k 2 h p 0 4 ，1 2 5g l ，并加入1 0 0m g m l 1 的 第一章绪论 卡那霉素，初始p h 为7 0 。2 5 0m l 三角瓶装5 0m l 培养基，于1 2 1 灭菌2 0 分钟，然后，接种l o 预先培养2 4 h 的e c o l i 细胞，于3 7 、2 0 0r 1 1 1 i n - 1 旋转 式摇床振荡培养。在此基础上分析了培养基中不同碳源、氮源及n a c i 浓度对产 酶的影响。最后确定最佳碳源为乳糖，浓度7g - l ；最佳氮源为酵母粉，浓度 2 4g - l 一；n a c i 浓度为5g l 一。在以上条件下摇瓶发酵最高酶活为5 1 2u m l 。 改用3 升发酵罐( 工作体积2 5 升) 进行分批培养，通风速率1 0v v i y l ，搅拌速 率8 0 0r m i n - 1 ，接种量1 0 ，p h7 0 ，培养过程中酶活与时间的关系如图1 - 2 所示。发现接种后细胞即开始生长，1 2 小时内溶氧量由1 0 0 下降到4 0 ，培 养4 小时后，b 葡聚糖酶开始分泌到培养基中，并且继续增加直到1 5 小时，之 后基本处于稳定，酶活达到5 2 6u - m e i 。 5 4 0 n 3 0 0 墨 兰 3 s i 甲 图1 2 【3 9 1 重组e c o l i b l 2 1 采用改良：t b g 培养基于标准发酵罐中的分批培养 f i g 1 2b a t c hc u l t i v a t i o no f e c o l ib l 2 1i nas t a n d a r df e r m e n t e ru s i n gt e r r i f i cb r o t h m e d i u m ( m o d i f i e dt b gm e d i u m ) 此外，林宇野( 1 9 9 5 ) f 4 0 1 ，孙玉英等( 2 0 0 3 ) 【4 1 1 ，石家骥和崔福绵( 2 0 0 1 ) 4 2 1 , h o n g 和m e n g ( 2 0 0 3 ) 4 3 1 ，b u r t s e v a 等( 2 0 0 3 ) h 4 】以及w a s e ( 1 9 8 5 ) 4 5 】等 都对摇瓶间歇发酵生产b 葡聚糖酶进行了研究。 1 3 2 2 2 流加发酵 与间歇发酵相比，流加发酵具有以下优点： ( 1 ) 可使发酵体系中维持很低的基质浓度。这样一方面可以降低底物抑制， 如高浓度的各种碳源和氮源常常抑制细胞生长1 4 6 1 。另一方面可除去快速利用碳 一+鼍_|itfl-2霉_冀审if 第一章绪论 源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使供氧矛盾不致于加剧【4 7 1 。此外，还 可避免培养基积累有毒代谢物( 4 8 j ，如乙酸、乙醇的形成。 ( 2 ) 可延长产物合成的时间。 ( 3 ) 可补充发酵过程蒸发掉的水分。 ( 4 ) 可降低发酵液的粘度。 流加发酵技术已经成功的用于维生素、氨基酸以及各种酶的生产，但采用 流加发酵生产b 葡聚糖酶却鲜有报道。到目前为止已经发展出了各种发酵过程 的流加策略【4 9 】，比如为了避免发酵过程中乙酸的积累，把溶氧控制在某一个水 平嗍；为得到较高的细胞浓度，可以把比生长速率控制在预先设定的某个水平； 为了得到较高的比生长速率，可以采用指数流加策略；线性流加f 5 1 】；恒p h 流 加 5 2 1 ：以及通过神经元和模糊理论来控制微生物的流加发酵 5 3 1 。然而，由于不 同微生物的发酵有不同的特点，并非在一种微生物中取得成功的流加控制策略 在另外一种微生物的发酵中也适用，而且同