（环境工程专业论文）大豆多肽抗氧化性的初步研究.pdf

硕士学位论文 摘要 人类许多慢性疾病及衰老现象均和人体内的自由基水平失衡有关， 过量的自由基对机体产生氧化性损害，当这种损害不能及时修复并且积 累到一定程度时，往往导致疾病的出现。外源性抗氧化剂可以帮助人们 维持体内自由基的平衡通过对具有抗氧化性的天然食物进行研究、筛 选和改性有可能开发出非常有效的抗氧化药物和保健食品。近年来的研 究发现大豆蛋白水解物具有很高的抗氧化活性。由于大豆产量大，自古 以来就是人类的重要食物，因此研究开发抗氧化大豆肽具有很重要的社 会意义和经济价值本研究针对大豆蛋白的酶水解各重要参数和大豆肽 的抗氧化性进行了一系列的分析研究，以期能发现影响大豆肽抗氧化性 的重要因素，为生产抗氧化大豆肽产品提供理论指导和工艺参数 本课题选用木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白制备抗氧化多肽。选用加 热法对大豆分离蛋白进行预处理，研究了预处理温度和处理时间对大豆 蛋白水解度的影响，得出最佳的预处理条件是：在8 5 下加热2 0 r a i n 。 研究了水解度与大豆多肽抗氧化活性随水解时间变化的规律，并对各自 的规律进行了理论分析，得出制备大豆抗氧化多肽的最佳条件是：温度 5 0 ，p h 值7 0 ，底物浓度w ( s ) 为5 ，加酶量西( e ) 为4 ，水解时间4 小时同时讨论了抗氧化活性与水解度之问的内在联系，发现并不是水 解度越高水解产物的抗氧化性就越强，由此对下阶段的研究提出了构想。 研究了大豆肽苦味值得随水解时间的变化趋势，分析了苦味值的产生和 原因，探讨了苦味和抗氧化活性间的联系，发现，苦味肽同时是具有较 强抗氧化活性的肽。对酶水解大豆多肽的动力学进行了初步的研究，求 出了木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白的置。值。 最后对酶水解大豆多肽制备抗氧化多肽进行了一般性的总结，即努 力提高水解产物中小肽的含量，同时尽可能选用作用位点是疏水性氨基 酸残基的蛋白酶来水解，提高氨基酸侧链的疏水性对制备的抗氧化肽 无需进行脱苦处理。 关键词：大豆蛋白；大豆多肽；木瓜蛋白酶；抗氧化；酶解 奎星茎坠垫墨些至耋 a b s t r a c t m a n yc h r o n i cd i s e a s e sa n ds e n i l ep h e n o m e n o no fh u m a nb e i n ga r ea l l r e l e v a n tt or a d i c a ll e v e lu n b a l a n c ei nt h eb o d y e x c e s s i v er a d i c a l sm a y c a u s eo x i d a t i o nd a m a g ei nt h eb o d y i tw o u l dl e a dt os o m ed i s e a s e si ft h e d a m a g ec o u l dn o tb er e p a i r e dt i m e l ya n db ea c c u m u l a t e dt os o m ed e g r e e b i o a n t i o x i d a n tc a nh e l pp e o p l eh o l dr a d i c a lb a l a n c ei nt h eb o d y i ti s p o s s i b l et od e v e l o pp o t e n ta n t i o x i d a n td r u g sa n df u n c t i o n a lf o o d st h r o u g h s t u d y i n ga n dm o d i f y i n gs o m en a t u r a lf o o d sh a v i n ga n t i o x i d a t i v e d u e t o h i g ho u t p u ta n dl o wc o s to fs o y ，i th a sb e e no n eo ft h ei m p o r t a n tf o o d s h e n c e ，t h e r ei si m p o r t a n ts o c i a ls i g n i f i c a n c ea n de c o n o m i cv a l u et os t u d y a n dd e v e l o ps o yp e p t i d e s 捌v i t ha n t i o x i d a t i v ea c t i v i t y i nt h i sr e s e a r c h ，m a n y i m p o r t a n tp a r a m e t e r s o f e n z y m eh y d r o l y s i so f s o yp r o t e i n a n d a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo fs o yp e p t i d e sw e r ea n a l y z e d t h ea i mo ft h e s u b j e c ti st of i n di m p o r t a n tf a c t o r sw h i c ha f f e c ta n t i - o x i d a t i v ea c t i v i t yo f s o yp e p t i d e sa n dt oo f f e rt h e o r e t i c a lg u i d a n c ea n dt e c h n o l o g i c a lp a r a m e t e r s f o rt h ep r o d u c t i o no fa n t i - o x i d a t i v ea c t i v i t yo fs o yp e p t i d e s p a p a i nw a ss e l e c t e dt op r o d u c ea n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo fs o yp e p t i d e s b yh y d r o l y s i s s o yp r o t e i nw a sp r e t r e a t e db yh o t ，t h ee f f e c to fp r e t r e a t i n g t e m p e r a t u r ea n dt i m eo nd e g r e eo fh y d r o l y s i sw e r er e s e a r c h e d t h eo p t i m u m c o n d i t i o no fp r e t r e a t m e n ti s5 0 2 0 m i n t h er e l a t i o nb e t w e e nh y d r o l y t i c t i m ea n dh y d r o l y t i cd e g r e ea n da n t i o x i d a n tc a p a c i t yw e r ea n a l y z e d ，t h e b e t t e rc o n d i t i o nw a so b t a i n e dw h i c hi st 5 0 ，p h7 0 ，w ( s ) 5 ，m ( e ) 4 4 h o u r s b ya n a l y z e d t h er e l a t i o nb e t w e e nh y d r o l y t i cd e g r e ea n d a n t i - o x i d a n tc a p a c i t y ，t h er e s u l tt h a ti ti sn o td e e p e rh y d r o l y s i s ，h i g h e r a n t i o x i d a n tc a p a c i t yw a sg o t ，s oan e wa d v i c ew a sg i v e n t h er e a s o n so f b i t t e r n e s sa b o u ts o y b e a np e p t i d e sa n dt h er e l a t i o nb e t w e e nb i t t e r n e s sa n d a n t i o x i d a t i v ew e r el e a r n e do n t h ec o n c l u s i o ni st h a ts o m eb i t t e r n e s s p e p t i d e sa r et h ep a r t o fa n t i o x i d a t i v ep e p t i d e s t h ev a l u eo fk ma b o u t h y d r o l y s i ss o yp r o t e i nw i t hp a p a i nw a sc a l c u l a t e d f i n a l l yt h eg e n e r a lp r i n c i p l e sw e r eg i v e nt op r o d u c ea n t i - o x i d a t i v e p e p t i d e s t h ec o n c l u s i o ni s t h a tt oi n c r e a s et h ec o n c e n t r a t i o no fs m a l l p e p t i d e sa n d t ou s et h ep r o t e a s e sw h o s ec l e a v a g es i t e sa r eh y d r o p h o b i c a m i n or e s i d u e st h e r e b ye n h a n c er e l a t i v eh y d r o p h o b i cd e g r e eo fa m i n oa c i d s i d ec h a i n k e yw o r d s ：s o yp r o t e i n ；s o y b e a np e p t i d e ；p a p a i n ； a n t i o x i d a t i o n ： h y d r o l y s i s 兰州理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名： 日期：歹口萨月d 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权兰州理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 i 、保密口，在一 年解密后适用本授权书。 2 、不保密日。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：留西 导师签名：零六0 、 一 日期：硼年月d 日 日期：矽町年6 月加日 硕士学位论文 第1 章绪论 大量研究结果显示，入体内各器官、系统均会产生不同程度的自由墓。自由 基从化学结构上看是含未配对电子的基团、原子或分子，是一类具有高度化学活 性的反应中间体在人体生命活动过程中，存在多种生物化学反应，不管是酶促 反应还是非酶促反应，都会产生自由基。人体内比较重要的自由墓有超氧自由基 ( 0 2 ) ，羟自由基( h o ) 、氢过氧基c r l 0 2 ) 、过氧化氢分子( h 2 0 2 ) 、烷氧基( p - o ) 、 烷过氧基( g o o ) 等。人体内自由基产生过多或是清除过慢，都会对人体造成严重 伤害。 1 i 自由基对身体的伤害及人体内消除自由基防御系统 自由基具有高度的活泼性和极强的氧化反应能力，能通过氧化作用攻击体内 的生命大分子。如核酸、蛋白质、糖类和脂质等，使这些物质发生过氧化变性、 交联或断裂，从而引起细胞结构和功能的破坏，导致机体组织破坏和器官退化。 自由基是导致人体衰老的重要因素。自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧 化最终产物丙二酸等会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，产生褐色素。 褐色素在皮肤细胞大量堆积，生产老年斑；在脑细胞中堆积，会出现记忆力减退 或智力障碍甚至出现老年痴呆症。胶原蛋白交联聚合会导致皮肤失去张力而皱纹 增多以及老年骨质增生。 自由基对脂质的侵袭，影响了细胞正常生理功能的发挥，加速细胞的衰老过 程。对核酸的攻击引起基因突变和遗传信息传导变化，会造成组织细胞的老化与 死亡微粒体、线粒体和溶酶体受t l 由基破坏，导致酶的排列错位并失去功能， 迸一步加快了衰老过程。 研究表明，自由基的过量存在是癌症发生的原因之一不少致癌物在体内经 过代谢活化形成自由基并攻击d n a 才能致癌。在致癌诱发阶段，自由基作用于 脂质产生的过氧化产物，使d n a 发生交联或断裂，并使姐妹染色单体( s c e ) 升 高，导致突变或致癌。在促癌阶段，自由基导致d n a 损伤，导致癌细胞增殖。 此外，自由基过多可诱发肺气肿、白内障、关节炎、动脉粥样硬化和糖尿病，可 引起缺血后重灌流损害，对身体造成严重伤害 i - 。4 l 。 人体在产生自由基的同时，也存在有消除自由基的防御系统，即由一些酶和 非酶物质组成的抗氧化系统。抗氧化酶有超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶 ( c a t ) 、谷胱甘肽过氧化酶( g s h p ) ( ) 等。s o d 能使超氧自由基歧化为氧气和过 奎星主坠薹墨些至耋 氧化氢；c a t 可使过氧化氢分解成为水和氧气；g s h p x 可使还原型的谷胱甘肽 转变为氧化型谷胱甘肽，从而消除细胞中的有机或无机的过氧化物。非酶抗氧化 剂有维生素e 、维生素c 、b 胡萝h 素和谷胱甘肽等，它们也具有清除自由基的 功能。这些抗氧化剂在体内构成一个完整的系统，分别对从氧化过程的开始到最 后生产过氧化氢这一自由基连锁反应的不同环节起作用，使体内自由基形成和消 除处于一种动态的平衡中。但是当机体尉烈运动后，或处于环境毒物影响下时， 自由基往往产生过多，或当机体处于生病、衰老、饮食不当情况下时，机体清除 自由基能力降低，这两种情况都会打破机体的自由基与抗氧化剂之间的平衡。所 以，人体需要通过适当补充外源性抗氧化剂来提高抗氧化水平，抵御自由基的损 害例。 1 2 生物抗氧化剂分类和作用 自由基生物学中的抗氧化剂，常指化学与生物化学上具有抗氧化作用化合 物。这类化合物又可分为内源性和外源抗氧化剂两大类。 内源性抗氧化剂可细分为内源性抗氧化酶和内源性非酶抗氧化剂两种。内源 性抗氧化酶有s o d 、c a t 、g s h p x 、过氧化物酶及与这些酶作用有关的其它酶， 如谷胱甘肽转硫酶、谷胱甘肽还原酶等。这些酶的协同作用能有效的清除自由基 及其衍生的活性产物。内源性非酶抗氧化剂是指生物体内部产生的具有抗氧化功 效的一类物质。包括金属硫蛋白、铜蓝蛋白、硒蛋白、谷胱甘肽、胆红素、白蛋 白、尿酸等。 外源性抗氧化剂是指生物体通过膳食、医药摄取的抗氧化剂，如黄酮、维生 素c 等。适当摄入外源性抗氧化剂可以降低体内自由基水平，防止脂质过氧化， 帮助抵御疾病【扣劓常见的外源性抗氧化剂包括如下几类 1 2 1 植物来源抗氧化剂 在自由基研究领域，植物类来源抗氧化荆以其独特的功效受到大家的关注。 就目前资料报道情况看，有消除自由基作用的植物达到5 0 多种。植物来源抗氧 化剂主要有黄酮类化合物、酚羟基化合物、皂苷类化合物、生物碱类化合物以及 植酸f 9 1 。 黄酮类化合物这类化合物大都呈黄色和具有4 位羰基。黄酮类化合物广泛 分布于植物界，根据苷原的基本结构可以分为黄酮、黄酮素、黄烷酮、黄烷酮醇， 异黄酮、查耳酮和花色素等十多种类型。目前研究发现黄酮类化合物可引入供电 子基团，具有生成稳定自由基的作用，可阻止自由基链式反应、抑制脂质过氧化 反应1 们。 2 硕士学位论文 酚羟基化合物关于酚羟基化合物清除自由基作用有大量报道，含酚羟基化 合物的儿茶素、卢丁等对大鼠还原型谷胱甘肽耗竭所致的肝脏脂质过氧化物升高 又抑制作用，存在明显的量效关系；香辛料，如迷迭香、丁香、生姜等因含有迷 迭香酚、丁香酚、生姜酚等多种酚羟基化合物，也有很强的抗氧化活性。绿茶提 取物中的有效成分茶多酚是一种天然抗氧化剂，能抑制食品的自氧化，并能抑制 细菌繁殖，而且能抑制生物体膜脂质过氧化，具有保健功效。但茶多酚对正常细 胞有一定的毒害性，作为保健品的成分，应规定使用量i l 皂苷类化合物人参皂苷有清除0 2 、h o 自由基，抑制脂质过氧化作用 人参叶总皂苷，人参果总皂苷可减少老年大鼠脑、心肌中褐脂质的生成并提高血 液中c a t 活性。绞股蓝皂苷具有类人参皂苷作用，不仅可以提高s o d 活性，而 且有降血脂，耐缺氧的作用。具有抗氧化活性的皂苷类还有三七皂苷、西洋参皂 苷、竹节参皂苷和柴胡皂苷等。 植酸植酸是肌醇的六磷酸酯，在大多数谷类、坚果类、豆类等植物中的含 量约为l 5 。它的抗氧化性能不是来自它与活性氧的反应，而是因为它与金 属离子的螯合作用，尤其是植酸与铁离子的高度螯合作用。一分子的植酸可与四 个铁离子结合，因此植酸可以抑制由f e _ 抗坏血酸系统催化的脂质过氧化反应 另外，植酸还可以催化f e 2 + 氧化为f e 3 + ，由于植酸的存在，f e 2 + 与f e 3 + 的循环被 打断，从而可以有效的抑制f e 2 + 作用下的脂质过氧化反应。 。 1 2 2 维生素抗氧化和 维生素类抗氧化剂主要是指维生素c 、维生素e 和b 胡萝卜素等 ， 维生索c 是人类身体必须的最重要维生素，人体没有制造维生素c 的能 力维生素c 在参与体内氧化还原链的正常运转中起抗氧化作用，可以保护红 细胞膜，清除生物体内活性氧；维生素c 有助于降低胆固醇水平，延缓动脉硬 化的发生，防止血栓形成，使冠心病的症状减轻，防止心绞痛和发生心肌梗塞； 维生素c 还能阻断身体内形成的某些致癌物质，有防治癌瘤的作用1 1 2 1 。 维生素e 又称弘生育酚，是最重要的抗氧化剂之一，在人体内不能自动合 成，是一种有效的自由基清除剂维生素一e 具有脂溶性，能插入到不饱和脂肪 酸存在的生物膜中，主要通过还原而中断不饱和脂肪酸过氧化在膜脂双层内传 递，防止活性氧对不饱和脂肪酸的氧化，从而保护生物体的细胞质、溶酶体、线 粒体、核d n a 免遭氧化损伤。维生素e 广泛分布于高等植物、藻类、苔藓类中。 维生素a 包括视黄醇、视黄醛和视黄酸酯维生索a 是视觉、生殖、维 持细胞生长发育等正常功能所必需的，可调节铜蓝蛋白和血液中的锅在体内， 视黄醇、视黄醛和视黄酸酯的生理功能是作为维生素a 类的营养物质，因而人 们往往忽视了它们的抗氧化特性，实际是维生素a 类物质能抑制肝微粒体脂质 3 大豆多肽抗氧化研究 过氧化，并抑制亚油酸的生成【”】。维生素a 不是通过清除清除引发脂质过氧化 的自由基来抑制脂质过氧化，而是与反应生成的有机过氧化物结合，从而阻断链 式反应。 类胡萝卜素类胡萝h 素是胡萝h 素与叶黄素的总称。叶黄素是带有羟基、 甲氧基或环氧化合物结构的类胡萝卜素。类胡萝h 素的抗氧化作用主要表现为能 淬灭单线氧态，并能够清除自由基 1 2 3 微量元素类抗氧化剂 人体必需的微量元素如锌、铁、铜、锰、硒、碘等是构成机体生命活动重要 酶类和蛋白质的重要组成部分。微量元素以其自身的电子传递性质在生物体抗氧 化过程中起着重要作用。例如硒是种强抗氧化剂，对机体的免疫力和杀菌力有 促进作用，可以提高体液免疫，协助白细胞( 淋巴细胞) 和巨噬细胞消灭细菌和癌细 胞，并能吞噬自由基，保护细胞膜不受自由基的破坏，保护细胞核和基因成分的 完整性，同时还能抑制由于多元不饱和脂肪酸在体内分解而引起的细胞癌变，能 阻断因化学致癌物诱发细胞癌变的发展过程；锌可维持体内的m d a 和s o d 活 性的平衡、调节机体自由基代谢，从而清除运动时产生过量的自由基，这对保护 细胞膜功能具有重要意义；铜和锌是c u s o d 、z n s o d 的必需成分，可通过其 螯合作用来维持生物膜的正常功能。 1 2 4 氨基酸、多肽和蛋白质类抗氧化剂 这类抗氧化剂在体内可以消化吸收，兼具营养和保健特性，具有广阔的应用 前景详见下文 1 3 氨基酸、蛋白质和多肽的抗氧化活性 1 3 1 氨基酸的抗氧化活性 氨基酸也可作为抗氧化剂使用，h i s 和t r p 在亚油酸、亚油酸甲酯、亚麻酸 甲酯中有抗氧化活性。研究证实了o 0 2 的t r p 和0 1 5 0 2 0 的l y $ 能够有 效的防止奶油的氧化。m e t 、p h e 、p r o 、h i s 和t r p 能够有效的提高维生素e 的 抗氧化活力。碱性氨基酸中的l y s 和a r g 可与不饱和脂肪酸反应生成盐，因而 可抑制不饱和脂肪酸的氧化反应的发生。氨基酸抗氧化剂的缺点是其活性随反应 体系p h 值和氨基酸浓度变化比较大。氨基酸只有在一定浓度范围才显示抗氧化 活性，过高浓度的氨基酸，其抗氧化活性会减弱，甚至表现出促氧化性j 4 1 通 常p h 值越高氨基酸的抗氧化性越强。 4 硬士学位论文 1 3 2 蛋白质的抗氧化活性 生物体内的许多具有抗氧化活性的物质属于蛋白质类，而且蛋白质具有优良 的乳化型特性，能够在油水界面起到介导作用，对于清除生物体内过量自由基， 抑制膜脂质过氧化具有重要意义研究发现，酪蛋白可减缓猪油的氧化，铁蛋白 或铁传递蛋白能与铁结合，因而可以防止铁离子引起的h o 的产生和脂类的过氧 化。胆红素是血红蛋白等含铁卟啉的化合物在体内的代谢物，游离的胆红素具有 霉性，但与人学清蛋白结合后，其分子整合成无毒的形式，并且在低氧浓度下， 这种螯合物是一种生理抗氧化剂，可以有效的清除过氧自由基。 1 3 3 肽的抗氧化活性 蛋白质水解成肽后，具有抗氧化作用的基团充分暴露出来，能够更好的发挥 抗氧化作用，往往蛋白质的水解物的抗氧化活性比相应的蛋白质抗氧化作用更 强。肽类不仅在油溶体系中有良好的增效作用，如双肽对伍，5 - 生育酚有增效作 用，而且在水溶体系、乳化体系及干燥体系中也有较高的抗氧化活性，构成肽的 氨基酸种类、数量及氨基酸的排列顺序决定着肽的抗氧化能力。一般说来，肽类 的抗氧化能力大于氨基酸。以a l a 为n 端的双肽中，a l a - t y r ，a l a h i s ，a l a t r p 的抗氧化力很强，其他双肽也都比构成它们的氨基酸的抗氧化能力强。谷胱甘肽 ( 6 s h ) 是一种有g l y 、丫c y s 和谷氨酰基组成的含巯基多肽类抗氧化剂，可清除自 由基，其氧化态和还原肽的比值( g s s g g s h ) 能够反映生物体内的氧化还原水平。 g s h 在抗坏血酸和维生素e 组成的氧化还原链中可以使脱氢抗坏血酸在抗坏血 酸酶作用下还原成抗坏血酸，维持细胞内的自稳态，在生物体氧化还原链中和维 持生物体内氧化还原反应的平衡起着关键性作用g s h 的主要功能是除去氧化 剂的毒性，保护红细胞免受外源性或内源性氧化剂的损害f ”i 。肌肽( c a r n o s i n e ) 是由a l a 和h i s 两种氨基酸形成的二肽，它是一种从骨骼肌中获得的二肽，可防 止肌肉受到铁离子催化的氧化作用。侯传记探讨了肌肽对实验性脑缺血再灌注的 神经保护作用以及肌肽对缺血再灌注损伤后脑组织氧自由基含量、脂质过氧化物 生成量和细胞丢失的作用，结果显示使用肌肤的治疗组的氧自由基和脂质过氧化 物的生成量均显著低于对照组而假手术组和使用肌肽的治疗组的海马c a l 区 锥体细胞数明显高于盐水对照组。实验证明肌肽对脑缺血再灌注有明显的神经保 护作用1 1 6 1 。杨国玲等采用多肽固相合成法合成了九种胸腺肽，并对其抗氧化性 进行了研究，实验结果证明，采用人工合成的胸腺相关肽及其自旋标记类似物对 引起机体衰老的过量自由基及其脂质过氧化物具有不同程度的清除及抑制作用 f 】y o u j i n j e o n 等采用超滤膜分离鲟鱼水解产物中的多肽，研究了鲟鱼多肽的乳 化性和起泡性等理化性质和抗氧化性、降血压功能等生理活性【l ”大豆多肽就 是这类有抗氧化活性的肽类 大豆多肚抗氧化研究 1 4 立题背景 在生物体内活性氧不断通过非酶与酶反应产生，但在抗氧化酶和内源性抗氧 化剂的协同作用下不断被清除，在正常人体中维持有利无害的极低水平。但是当 机体处于衰老、生病或疲劳状态时，体内自由基的平衡可能出现破坏，过量的氧 自由基对机体大分子造成一系列氧化性损伤。当这种损伤不能及时修复或修复出 错时就可能引发或加重细胞、组织乃至全身的机体紊乱与病理变化。有资料显示 人类很多严重疾病和衰老均与活性氧对机体大分子的氧化性损伤有关，要从根本 上治疗和预防这类疾病就必须从消除自由基入手，通过捕获或淬灭过氧自由基， 恢复体内自由基的平衡1 1 ”。这就是所谓的自由基治疗学。 而研究者发现，具有抗氧化性的食品，在人体内能够捕获或淬灭自由基，恢 复体内自由基的平衡。由此可知，研发抗氧化保健食品将有着非常重要的社会价 值和经济价值。 1 s 立题依据 中国自古就有药补不如食补之说，食物和药物虽然都具有抗氧化效果，但通 常药物往往具有副作用，如增加肝脏的解毒负担等。而食物却相对更安全，可以 长期食用。对于预防和治疗像心血管病、糖尿病、癌症以及延缓衰老等，应该着 眼于补充抗氧化食物，尤其是那些天然食物及其提取物的补充。通过对这些具有 天然抗氧化特性的食物进行研究，从中提取和分离出抗氧化成分，有可能发现对 治疗由自由基过量引发的疾病非常有效的新型药物和保健食品。 大豆多肽是大豆蛋白经水解获得的短肽混合物，分子量分布在3 0 0 2 0 0 0 d a 的范围内，氨基酸组成与大豆蛋白质基本相同，其必需氨基酸平衡良好，含量丰 富，具有许多优良的理化特性，且易为人体消化，安全无毒，是一种优良的肠道 营养液。前面已提及大豆多肽具有抗氧化、降血压、降胆固醇、降血糖、免疫、 抗疲劳和抗癌等生理活性。其中抗氧化性是大豆多肽其它生理功能的基础。通过 筛选、分离抗氧化大豆多肽有可能从中发现治疗自由基引发疾病的药物或保健食 品。 虽然制备多肽的原料有很多，如鱼蛋白，魔芋粉等，但国内外众多专家学者 更看好以大豆为原料的大豆多肽，因为与其他食用多肽相比，大豆多肽具有极大 的优越性。在原料方面，大豆多肽的原料是大豆，是一种健康、优质、易得的原 料；在功能特性方面，大豆多肽具有易吸收、降血压血脂、抗疲劳和促进氮代谢 等诸多功能特性，对许多人群具有良好的效果；在加工特性方面，大豆多肽具有 很好的加工特性，可以广泛应用于各种食品加工工业中；在研究开发方面，大豆 多肽在国内外都已经实现了产业化生产，这使得将大豆多肽作为高档营养食品和 6 硕士学位论文 保健食品的原料、配料成为可能；经济价值方面，开发抗氧化大豆多肽可以大幅 提高大豆制品的附加值，拓宽大豆的应用领域。因此研究开发大豆抗氧化肽具有 广阔的前景 1 6 研究意义 大豆在中国乃至世界上都是最重要的植物之一，从大豆及其衍生产品中开发 出抗氧化食品，原料来源容易，成本低，消费者容易接受。开发大豆抗氧化食品 可以为上述疾病患者提供种价廉物美，安全可靠的保健食品。因此进行大豆抗氧 化肽的研究开发具有重要的意义。 近年来的研究发现大豆蛋白水解得到的大豆多肽具有降血脂，降血压，提高 免疫力，抗癌，促进血红细胞恢复和抗氧化等多种功能，根据前面有关过量自由 基导致部分疾病的论述，可以推断大豆多肽的抗氧化活性与其降血脂，降血压， 提高免疫力，抗癌和促进血红细胞恢复等功能存在一定相关性，因此可以把对大 豆多肽抗氧化性的研究作为其它功能特性研究的基础。 1 7 立题的可行性 本课题是山东中食都庆生物技术股份公司拟开发的项目，本文从原料来源及 其改性、水解和抗氧化研究、产品开发以及工业化现状和前景等方面论证其可行 性。 i 7 1 大豆蛋白 大豆多肽属于大豆蛋白类制品，这里先对大豆蛋白做个简单的介绍。 通常大豆含蛋白质约为4 0 ，脂肪2 0 ，碳水化合物2 0 ，水分1 0 ，粗 纤维5 ，灰分5 。大豆的一个重要用途就是提取豆油，但是过去对榨油后剩 下的大量蛋白质却未充分利用，只是用作饲料和肥料。随着食品工业的发展，人 们采用先进的工艺技术将脱脂豆相加工成多种豆制品，如浓缩大豆蛋白、分离大 豆蛋白，组织化大豆蛋白等，这些大豆蛋白制品的蛋白质含量普遍超过5 0 ， 其中大豆分离蛋白的蛋白质含量更高达9 0 左右，而且具有许多功能特性。 大豆蛋白不仅蛋白质含量高，而且质量好。根据世界卫生组织( w h o ) 建立的 蛋白质推荐摄入量，大豆蛋白质含有人体必需的所有氨基酸，其营养价值与动物 蛋白相当，能够很好的满足人类的营养需要。尽管和鸡蛋、牛奶相比大豆蛋白所 含必需氨基酸的比例稍差，但却是植物蛋白质中营养价值最高的蛋白质，其所含 八种人体必需的氨基酸含量接近或高于联合国粮农组织( f a o ) 和世界卫生组织 ( w h o ) 建议的理想构成见表1 1 。 7 大豆多肽抗氧化研究 1 7 2 大豆蛋白改性 大豆蛋白的营养价值较高，资源丰富，原料成本低，而且还具有热凝胶性等 与食品加工密切相关的功能特性，不仅可以作为动物蛋白的替代物，广泛应用于 儿童食品、强化食品和保健食品等食品的生产，还可以用来研制透明的可生物降 解材料。但是，大豆蛋白在酸性条件下溶解性差，在热、酸、碱等条件下易变性， 对某些消费者具有过敏性等缺陷，使它在现代食品工业中的应用受到了一定程度 的限制。随着食品工业的发展，需要大量具有良好功能特性和较高营养价值的蛋 白质，作为食品的原料成分或添加基料成分来提高食品的营养价值。为此，加强 或改善大豆蛋白的功能特性，提高大豆制品营养成分的生物有效利用性成为食品 加工业亟待解决的问题。天然的蛋白质往往不能完全满足要求，人们通过采用物 理方法、化学方法、酶方法以及基因改造等方法来处理蛋白质，使蛋白质的氨基 酸残基和多肽链发生某种变化，引起蛋白大分子空间结构和理化性质的改 表1 1 一些食品中的必需氨基酸含量( ) t a b l c l 1t h en e c e s s a r ya m i n oa c i di ns o m ef o o d 变，从而获得具有理想的功能特性和营养价值的蛋白质由于各种单一改性方法 均有其局限性，当采用一种蛋白改性技术仍不能达到理想效果时，可以考虑综合 8 硕士学位论文 采用多种改性手段，最终获得较理想的蛋白产品。从某种意义上说，蛋白质的改 性技术就像神话传说中的“点金术”，能够将普通的低价值蛋白原料通过改性变成 高附加值的产品，以满足食品工业、医药行业、保健行业及其相关产业的特殊需 要。 蛋白质的物理改性方法是指通过加热，冷冻、加压、磁场、电场、机械作用、 超滤、低剂量辐射及添加小分子双亲物质等物理手段来改善蛋白质的功能特性、 提高营养价值的方法。物理改性方法具有加工费用低、耗时少、无毒副作用以及 对蛋白营养价值破坏小的特点，但也同时存在设备投入大和改性范围窄的缺点 蛋白质的化学改性方法主要是指采用化学方法针对蛋白中的氨基、羟基、巯 基和羧基进行改性，具有反应简单、效果显著的特点，但同时也存在试剂专一性 不强，反应条件苛刻，易有化学物质残留和副产物混杂等不足之处，蛋白质的化 学改性方法主要有酸碱处理、酰化、脱酰胺、磷酸化、糖基化、共价交联以及氧 化方法。 蛋白质的生物工程改性是指应用植物育种和分子技术，改变蛋白质分子的结 构，进而影响其功能性质的方法。广义的基因工程改性包括基因重组、基因突变 和染色体变异：狭义的基因工程改性是指基因的定点修饰。目前大豆蛋白的基因 工程改性主要包括两方面，一是研究如何改变大豆球蛋白的组成，尤其是减少胰 蛋白酶抑制剂的含量，提高大豆蛋白的营养价值；二是研究改变脂肪氧合酶同工 酶的组成，减少大豆产品的豆腥味。 蛋白质的酶法改性通常是指利用酶对组成蛋白质分子的氨基酸残基侧链基 团的修饰。化学改性虽然具有反应简单、效果显著的特点，但由于有容易发生副 反应、试剂易残留、蛋白质营养价值下降等缺点，在食品工业中的应用受到限制 蛋白质的酶法改性具有专一性强、条件温和，无毒副作用的特点，而且对营 养几乎无不良影响等优越之处，因而受到人们的广泛关注。随着酶工业、固定化 酶技术和膜反应器的不断发展，酶解过程更趋于自动化和简单化。酶法水解己成 为一种趋势。随着一些新用途的酶的发现和应用，极大的拓宽了酶法改性的应用 范围，例如各类蛋白水解酶、转谷氨酰胺酶、磷酸酶以及过氧化氢酶的应用，使 得过去只能采用化学方法进行的去酰胺、水解、磷酸化、交联聚合、氧化等改性 方式都可以采用酶法改性来进行特别是一些低廉价格的微生物酶的出现，进一 步降低了酶法改性的成本，使其更具有实用性i i 争吒 有目的酶促改性不仅能改变大豆蛋白的功能特性，而且可使其氨基酸组成更 趋合理，消化吸收率更高。进一步的研究还发现，酶解大豆蛋白可产生一系列具 有生理活性的多肽，如抗氧化肽，降血压肽等等，不仅提高大豆蛋白的营养价值， 也提高了大豆的附加值。 9 大豆多肽抗氧化研究 1 7 3 关于大豆蛋白水解的研究 多年来国内外学者研究表明，酶解有助于改善大豆蛋白的溶解性、乳化性、 发泡性、抗凝胶形成性等加工功能特性日本在大豆多肽开发研究方面也已进入 生产阶段，据报道，他们已经克服了水解产物产生苦味和蛋白酶菌种的选育难关。 经改善风味后的大豆多肽产品必定被更多的消费者认识和接受，成为人们日常生 活中的一种优质蛋白质营养品。日本京都大学松野隆一教授利用碱性蛋白酶有控 制地水解大豆蛋白，从酶解产物中分离出两类多肽：多支链氨基酸寡肽和低芳香 族氨基酸多肽，前者可用于治疗肝硬化等症，后者由于去除了部分较苦的芳香族 氨基酸，苦味降低，可作为添加剂用于食品工业1 2 2 2 引。j i n y e o l 研究了酸处理、 热处理对大豆分离蛋白酶解的影响，研究了不同预处理方法对水解度、氨基氮、 氮溶指数和肽链长度的影响1 2 4 j ；w e n d e ec h i a n g 等采用酶膜反应器连续生产大豆 多肽，由于及时分离了酶解生成的多肽，消除了产物反馈干扰，提高了酶解效率； 并且采用氧化稳定指数( o s i ) 检测了大豆分离蛋白及其水解物的抗氧化活性，结 果显示大豆分离蛋白酶水解后抗氧化性提高f 2 ”。a d l e r n i s s e n 认为，将大豆蛋白 部分水解，使其分子量与鸡蛋清蛋白相当，则可提高大豆蛋白的发泡性 2 6 1 舒 展经研究发现，以微生物中性蛋白酶水解大豆蛋白，当水解度达到4 3 时，热 凝结度从9 3 增加到3 5 6 ，酸性溶液中的氮溶解率从5 7 增加到4 8 1 t 2 。7 1 。 c a l d e r o nam 研究了大豆蛋白的水解和再聚合过程，通过在水解液中添加甲硫 氨酸，有效增加了类蛋白中的m e t 含量，提高了蛋白质的营养价值【2 引。y o s h i k a w a m 等的研究表明大豆球蛋白a i 亚基( 氨基酸序列g l y a r g p r o a r g ) ，大豆蛋白的 胰蛋白酶解物( 氨基酸序列h i s c y s g i n a r g p r o - a r g ) 分别具有免疫活性，而且大 豆球蛋白a l 亚基还具有抑制肿瘤生长的作用渺l 。 赵毅等则注意到大豆蛋白水解产物对保加利亚乳杆菌的增值有促进作用，且 其促进作用优于大豆蛋白。另外，通过酶解还可产生一些具有生理功效的小肽： 可以减弱和打破产生大豆腥味的有味物质与大豆蛋白之间的紧密结合，使有味物 质挥发掉，从而减弱豆腥味【3 0 】。赵新淮从酶水解过程中水解度随水解时间的变 化曲线，推断大豆蛋白的酶水解方程是指数方程形式1 3 刘粼研究了大豆蛋白 酶水解的机理，在此基础上推导出了大豆蛋白酶水解的动力学方程，指出水解过 程中，大豆蛋白底物浓度的上限约为1 0 ，超过此浓度反应速率显著下降，并 通过试验进行了验证【3 ”。 l - 7 4 大豆多肽的抗氧化研究现状 自从发现大豆多肽具有抗氧化活性以来，众多学者多此进行了大量的研究。 沈蓓英分别采用酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及胃蛋白酶水解大豆分离蛋白，分别 采用硫代巴比妥方法和铁一硫氰酸铵法研究了水解物对油脂氧化模拟体系的抗 1 0 硕士学位论文 氧化效果，得出了大豆分离蛋白的酸性蛋白酶水解物的抗氧化活性最强的结论， 并进一步指出，大豆多肽的抗氧化活性最强的分子量范围是7 0 0 1 0 0 0 d a l ” 。 h u a m i n gc h e n 等采用五种蛋白酶对大豆伴豆球蛋白( 7 s ) 进行水解，采用铁一硫 氰酸铵法检测了不同水解产物的抗氧化活性，并采用g - 2 5 凝胶层析和反向高压 液相色谱对水解产物进行分离、提纯，检测了不同大豆多肽的抗氧化活性，得出 了六个抗氧化肽的氨基酸序列3 4 j 。陈美珍等采用木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白， 采用硫代巴比妥酸一脱氧核糖方法检测了水解产物的抗氧化活性，得出了大豆抗 氧化肽的分子量范围是5 1 5 4 k d a 1 5 5 3 k d a 之间的结论p5 1 。卢阳等通过选择四 种蛋白酶来对大豆分离蛋白进行水解，在其最适水解条件下，测定不同水解时间 下的水解度，比较四种蛋白酶水解产物的地抗氧化活力的大小，并分析了抗氧化 活性与水解时间和水解度之间的关系，结果表明，四种蛋白酶水解产物中，风味 蛋白酶水解物的抗氧化活性最大i 3 6 1 。刘大川等采用碱性蛋白酶2 7 0 9 水解大豆分 离蛋白，采用铁一硫氰酸铵法检测水解物的抗氧化活性，得出大豆多肽抗氧化的 分子量范围是1 0 0 0 2 0 0 0 d a i ” 1 7 5 大豆多肽生产工业化 蛋白质水解产物的工业化生产最早出现在1 9 1 4 年，酶解物作为食物则出现 在第二次世界大战期间，当时主要是用于饲料中或用在制糖及糕点业中代替短缺 的鸡蛋蛋白。这两种用途代表了蛋白质酶解产物的两个受人重视的特性：营养特 性和功能特性。1 9 7 2 1 9 7 3 年质构化的大豆蛋白可作为肉类填充剂的发现更是导 致了对蛋白质酶解物功能特性研究的高潮。 1 。1 随着国内对大豆功能性成分越来越深入的研究，大豆多肽成为了热门研究课 题，这主要是因为大豆资源丰富，经水解而得到的大豆多肽无论从理化特性、营 养特性还是功能特性都优于大豆蛋白质，所以其应用前景非常广阔，市场潜力巨 大目前国内已有十余家生物高科技企业纷纷切入这一领域，继武汉天天好生物 制品有限公司之后，山东中食都庆生物技术股份公司、哈尔滨乐能生物股份有限 公司、哈高科大豆食品有限责任公司、东莞市银华饲料有限公司、北京原平皓生 物技术有限公司、山松( t h 东临沂) 生物制品有限公司、陕西国萃生物制品有限公 司、兰州同健生物技术有限公司、乐能( 哈尔滨) 生物工程股份有限公司、南通宏 通生物科技有限公司、武汉九生堂生物工程有限公司、中国爱欣( 哈尔滨) 食品有 限公司、上海安尔雅保健科技有限公司和上海生远公司等企业都已有成熟的大豆 多肽产品；而且，据笔者了解，越来越多的企业已经或正在考虑投资生产大豆多 肽。 在中国内地，大豆多肽只是作为一种食品配料添加于其他产品中，如在白酒、 啤酒、黄酒、果酒、保健食品及饲料里添加少量大豆多肽，以增强产品的功能性。 大豆多肽抗氧化研究 迄今为止，只有少数几种以大豆多肽为主要成分的成型产品的报道。如哈高科生 产的“大豆肽片”，山东都庆生产的“肽尔康”肽素营养片、低聚肽全蛋白营养粉， 北京原平皓生产的“蛋白肽片”，兰州同健生产的大豆燃脂肽，中国爱欣生产的爱 欣牌多肽蛋白质粉等就是可喜的进展；西安市食品研究所也己研制成功一种独具 特色的大豆肽清酒。在台湾，自从德国丹尼尔营养研究所陈栋梁博士和多肽应用 研究中心联合开发出一类新的多肽类减肥物质后，台湾立刻决定尽快引进这种无 毒、无副作用且具有高效性的减肥多肽，以满足台湾减肥市场的需求。据专家估 计，2 0 0 4 年国内大豆多肽的产量应该在8 0 0 0 吨以下，5 年内产量有可能突破1 0 万吨。 大豆多肽的优越性科学研究及功能性验证使得食用多肽成为研究开发的热 点，引发了各种食用多肽开发的热潮，比如有助于改善睡眠的多肽、降血脂血压 的多肽、增强免疫力的多肽以及促进钙吸收的多肽等。可以预测大豆多肽的市场 价值将越来越高i 3 分”4 m 。 1 7 6 大豆肽的开发与应用 大豆多肽是指大豆蛋白经蛋白酶作用降解后，再经特殊处理而得到的一种混 合物，主要成分为分子链不等的各级肽类，还包括一些游离氨基酸、少量糖类、 水分和灰分等。大豆多肽的分子量分布以低于1 0 0 0 d a 的为主，必需氨基酸平衡 且含量丰富，不仅具有比大豆蛋白更丰富的加工特性，如无豆腥味，在热、酸、 碱条件下也不容易变性沉淀，具有良好的起泡特性、吸湿性，还具有使凝胶软化 功能，促进微生物的增殖作用和促进有益代谢产物生成的能力等，而且具有许多 重要的治疗特性，表现在大豆多肽具有易消化吸收的特性，还能够促进脂肪代谢， 增强肌肉力量，有助于及时恢复疲劳和增强体力，同时具有低抗原性、降胆固醇、 抑制血压上升等，大豆多肽作为一种非常有用的功能性食品原料己越来越受到人 们的重视。应用大豆多肽的这些特性，人们可以将它开发成功能性食品、运动员 食品、特殊病人食品，或将其作为具有良好加工特性的食品原料应用于食品及相 关领域。 由于食用多肽具有易被吸收利用的特点，所以，当体内因消耗过多的营养物 质而出现内环境失调，各系统功能处于低效状态而感到疲劳时，服用多肽就能迅 速地使您体内所缺乏的活性物质和营养得到补充，从而改善细胞代