（生物化学与分子生物学专业论文）重组flag标签的融合表达纯化及亲和常数的测定.pdf

浙江理工大学硕士学位论文 摘要 f l a g 标签是由八个氨基酸残基d y k d d d d k 组成的表位标记物( e p i t o p e ) ，序列简 短，对目标蛋白的结构和生物活性影响小，可以用一条人工合成的寡聚核苷酸来编码。 f l a g 标签可以融合到目标蛋白的n 端或者c 端，或与其他亲和标签串联使用。f l a g 自 身含有一个肠激酶切割位点d d d d k ，可以通过肠激酶切割除去。现已发展出三种抗f l a g 单克隆抗体m 1 、m 2 和m 5 ，单抗m 1 特异性识别具有n f l a g 序列的融合蛋白，单抗 m 5 的出现是为了应用于具有n m e t f l a g 序列的融合蛋白，显示出对n 端m e t f l a g 具 有更高的亲和力，单抗m 2 可以识别以上几种n 端或c 端f l a g 融合蛋白，因而具有通用 性。f l a g 标签已广泛应用于重组蛋白的免疫印迹、免疫吸附纯化、免疫共沉淀等领域。 为了在多肽芯片上应用f l a g 标签检测蛋白质的相互作用，以f l a g 的原始序列 d y k d d d d k 为模板，设计了两个新的序列d y k d y k y k 和d y k g g g y k ，通过两次p c r 反应分别将以上三种f l a g 标签融合到人瓣2 基因编码的n s h 2 蛋白的c 端，将h i s 标签融合到n s h 2 蛋白的n 端并将其命名为h i s n s h 2 f l a g 基因，该系列重组基因长3 4 8 b p ，编码1 1 6 个氨基酸，预测分子量为1 4k d a 。将p c r 扩增得到的h i s n s h 2 f l a g 基因 亚克隆到表达载体p g e x 2 t 相应的酶切位点上，得到重组表达质粒 p g e x - 2 t h i s n s h 2 f l a g ，p c r 扩增、双酶切及d n a 测序鉴定表明重组质粒构建正确。 将重组质粒转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 感受态细胞并在l b 培养基中表达重组蛋白，用终浓 度为0 1m m 的i p t g 在3 0 0 c 诱导重组菌3h 后，裂解菌体作s d s p a g e 分析，在4 0 k d a 左右的位置有一条特异性蛋白条带，与预期值相符( g s t 融合标签2 6 k d a ，h i s - n s h 2 f l a g 1 4k d a ) ，该系列重组蛋白以可溶性形式存在于菌体裂解液上清中。经g s t 亲和纯化和 f p l c 分子筛层析进一步纯化后，s d s p a g e 电泳分析表明纯化所得重组蛋白纯度高于 9 0 。w e s t e r nb l o t t i n g 分析表明单克隆抗体m 2 能够特异性识别以上三种f l a g 标签。非 竞争性酶免疫法测得单克隆抗体m 2 与三种f l a g 标签d y k d d d d k 、d y k d y k y k 、 d y k g g g y k 相互作用的亲和常数分别为0 0 7 7p m 、0 1 0 2 “m 、0 1 2 6g m 。亲和常数的获 得，为更好的应用f l a g 标签打下了基础。 关键词：f l a g 标签；亲和纯化；亲和常数；非竞争性酶免疫法 浙江理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ef l a g t a gc o n s i s t so ft h ee i g h t - a m i n oa c i ds e q u e n c ed y k d d d d k d u et oi t ss m a l l s i z e ，t h ef l a g t a gd o e sn o ta f f e c tt h es t r u c t u r ea n db i o c h e m i c a lp r o p e r t i e so ft h et a g g e dp r o t e i n a n dc a l lb ee n c o d e db yas i n g l es y n t h e t i co l i g o n u c l e o t i d e f l a g - t a gc o u l db ef u s e dt oe i t h e rt h e n t e r m i n a lo rc - t e r m i n a lo fag i v e nf u s i o np r o t e i n , o ri na s s o c i a t i o nw i t ho t h e ra f f i n i t yt a g s t h e l a s tf i v ea m i n oa c i d sd d d d ki st h et a r g e ts e q u e n c eo ft h ep r o t e a s ee n t e r o k i n a s e ，i fd e s i r e d ，i t c a nb ec l e a v e du s i n ge n t e r o k i n a s e a tp r e s e n tt h r e em o n o c l o n a la n t i b o d i e s ( mi ，m 2a n dm 5 ) w i t hd i f f e r e n tr e q u i r e m e n t sf o re p i t o p eb i n d i n ga r ea v a i l a b l e ，t h ea n t i - f l a gm o n o c l o n a l a n t i b o d ym 1i so n l ys p e c i f i ct ot h en - t e r m i n a lo ft h ef l a gf u s i o np r o t e i n ，a n dm 5 ，w h i c hi s r a i s e da g a i n s tt h es e q u e n c en - m e t - f l a g - ，e x h i b i t sah i g h e ra f f i n i t yf o rn t e r m i n a lf l a g f u s i o np r o t e i n si nw h i c ht h ef l a ge p i t o p ei sp r e c e d e db yam e t h i o n i n e t h ea n t i - f l a g m o n o c l o n a la n t i b o d ym 2i ss p e c i f i ct ob o t hn t e r m i n a lm e t - - f l a ga n dc - t e r m i n a lf l a gf u s i o n p r o t e i n s t h ef l a g t a gs y s t e mh a sb e e ne m p l o y e di nav a r i e t yo fa p p l i c a t i o n si n c l u d i n g w e s t e r nb l o t t i n g ，i m m u n o a f f i n i t yp u r i f i c a t i o n ，i m m u n o p r e c i p i t a t i o n o b j e c t i v et oa p p l yf l a gt a go np e p t i d em i c r o a r r a yf o rd e t e c t i o no fp r o t e i n p r o t e i n i n t e r a c t i o n ，b a s e do nt h eo r i g i n a lf l a g - t a gs e q u e n c ed y k d d d d k ，f l a g l i k es e q u e n c e s d y k d y k y k , d y k g g g y kw e r ed e s i g n e da n df u s e dt oct e r m i n a lo f n s h 2d o m a i no fs h p - 2 g e n e ，a n dh i s t a gw a sf u s e dt on t e r m i n a lo fn s h 2d o m a i nb yp c r t h er e c o m b i n a n tg e n e h i s n s h 2 - f l a gi s3 4 8b pi nl e n g t h ，c o d i n gap o l y p e p t i d eo f116a m i n oa c i d sw i t hap r e d i c t e d m o l e c u l a rw e i g h to f14k d a , t h e ns u b c l o n e di n t op l a s m i dp g e x - 2 ta n dt r a n s f o r m e di n t o e s c h e r i c h i ac o i lb l 2 1 ( d e 3 ) a f t e rb e i n gi n d u c e d3hw i t ho 1m m i p t ga t3 0 0 ci nl bm e d i a , s d s p a g ea n a l y s i si n d i c a t e dt h tt h ef u s i o np r o t e i n sw e r es u c c e s s f u l l ye x p r e s s e d t h ef l a g f u s i o np r o t e i n sw e r ep u r i f i e db yg s ta f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , f u r t h e rp u r i f i e db yf p l c w e s t e r nb l o r i n ga n a l y s i si n d i c a t e dt h a tm a bm 2c o u l dr e a c ts p e c i f i c a l l yw i t hp r o t e i nf l a g f u s i o n p r o t e i n t h ea f f i n i t y c o n s t a n t sb e t w e e nm a bm 2a n dr e c o m b i n a n tf l a g t a g d y k d d d d k , d y k d y k y k , d y k g g g y kw e r eo b t a i n e du s i n gn o n - c o m p e t i t i v ee l i s a ， w h i c ha r e0 0 7 7p m ，0 10 2p m ，0 12 6p m ，r e s p e c t i v e l y , t h i sw o u l dh e l pa p p l y i n gf l a g t a g s y s t e m k e yw o r d s ：f l a g t a g ；a f f i n i t yp u r i f i c a t i o n ；a f f i n i t yc o n s t a n t ；n o n - c o m p e t i t i v ee l i s a 2 浙江理工大学硕士学位论文 a m p a f m b s a d a b e c o l i e d t a e l i s a f p l c g s h g s t 。h r p i p t g i g m a b o i 强 p c r p v d f p m s f p a g e s h p 2 s d s t e m e d t m b 缩略语 a m p i c i l i n 氨苄青霉素 a n t i f l a g m o n o c l o n a la n t i b o d y抗f l a g 单克隆抗体 b o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清白蛋白 3 t 3 d i a m i n o b e n z i d i n e3 ，3 二氨基联苯胺 e s c h e r i c h i ac o l i大肠杆菌 e t h y l e r i ed i a m e m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y 酶联免疫吸附实验 f a s tp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i c 高效液相色谱 r e d u c e dg l u t a t h i o n e 还原性谷胱甘肽 g l u t a t h i o n est r a n s f e r a s e 谷胱甘肽s 转移酶 h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e 辣根过氧化物酶 i s o p r o p y l t h i o p d g a l a c t o s i d e 异丙基硫代1 3 一d 一半乳糖苷 i m m u n e g l o b u l i n 免疫球蛋白 m o n o c l o n a la n t i b o d y 单克隆抗体 o e nr e a d i n gf r a m e开放阅读框 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p o l y v i n y l i d e n ef l u o r i d e 聚偏氟乙烯 p h e n y lm e t h a n es u l f o n y lf l u o r i d e 苯甲基磺酰氟 p o l ya c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ac y t o p l a s m i ct y r o s i n ep h o s p h o t a s e 一种酪氨酸磷酸酶 s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e十二烷基硫酸钠 t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e 四甲基乙二胺 t e t r a m e t h y lb e n z i d i n e 四甲基联苯胺 6 浙江理= 人学硕士学位论文 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师 的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰 写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 一 i i i 学位论文作者签名： 嗍：年 yi | 们 l 月1 1 ， 幻冰 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 学位论文作者签名： 日期： 保密口，在 不保密a 。 飞月1 明 ， 年解密后使用本版权书。 h 一昔形k指导教师签名： 浙江理工大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 亲和标签研究进展 1 1 亲和标签的定义及分类 亲和标签是一个广义的概念，通常是指利用遗传学技术与目标蛋白融合表达的具有亲 和配基的多肽或者蛋白。根据其分子量大小可以分为两大类：大的蛋白质分子( 或蛋白质 结构域及其衍生物) 如g s t 、m b p 等和小的多肽片段如f l a g t a g 、s t a g 、c m y c t a g 等【1 1 。 在大多数情况下，由于多肽标签相对较小，对融合蛋白的结构和生物活性影响很小，不需 要从融合蛋白中切除，因而多肽标签较蛋白质标签更为常用。有很多文献较为详尽地报道 了各种标签，其大小从几个氨基酸到整个蛋白质，相互作用类型包括了酶与底物、细菌受 体与血清蛋白、聚组氨酸与金属离子、抗原与抗体等【2 矧。常见的亲和标签的序列和大小如 表1 所示： 表1 常见亲和标签的序列和大小 t a b l e1t h e p r o f i l eo fc o m m o na f f i n i t yt a g s 1 2 常见的亲和标签 1 2 1 谷胱甘肽s 转移酶标签( g s t - t a g ) 2 6k d a 的谷胱甘肽s 转移酶( g l u t a t h i n e - s t r a n s f e r a s e ，g s t ) 由日本血吸虫( s c h i s t o s o m a j a p o n i c u m ) g s t 基因编码【7 1 。g s t 标签可以融合到目标蛋白的n 端或c 端，融合蛋白可 7 浙江理工大学硕士学位论文 从未经处理的宿主细胞裂解液中用固定化的谷胱甘肽琼脂糖亲和层析加以纯化。结合的融 合蛋白在非变性条件下用1 0m m 还原型谷胱甘肽洗脱【8 】。在大多数情况下g s t 融合蛋白 是完全或部分可溶的，如果不溶的g s t 融合蛋白在1 t r i t o nx 1 0 0 、1 t w e e n 、1 0m m d t t 、0 0 3 s d s 或1 5 十二烷基肌氨酸钠缓冲液中是可溶的话，也可以进行亲和层析纯 化。可以用位点专一的蛋白酶如凝血酶或x a 因子从融合蛋白切除g s t 标签。p r e s c i s s i o n 蛋 白酶含有g s t 标签，蛋白酶解后，g s t 载体和蛋白酶通过谷胱甘肽琼脂糖亲和层析去除【9 】。 g s t 标签可以应用于g s tp u l l d o w na s s a y 研究蛋白质蛋白质相互作用【，也作为抗 原用于免疫学或疫苗研究【l 。 1 2 2 麦芽糖结合蛋白标签( m b p t a g ) 4 0k d a 的麦芽糖结合蛋白( m a l t o s eb i n d i n gp r o t e i n ，m b p ) 由大肠杆菌k 1 2 的m a l e 基 因编码【1 2 】。m b p 融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化，结合的融合蛋白可用1 0 m m 麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱，缓冲液p h7 0 - - 8 。5 ，盐浓度可高达1m ，不能使用变性 剂。m b p 可提高在细菌中过量表达的融合蛋白尤其是真核蛋白的溶解性。如果蛋白在细菌 中表达，m b p 可以融合在目标蛋白的n 端或c 端，但放在n 端可能降低翻译效率【13 1 。m b p 标签可以与小的亲和标签联用纯化蛋白，通过免疫分析可以很方便的检测【1 4 】。 1 2 3 多聚组氨酸标签( p o l y h i st a g ) p o l 卜h i st a g 是利用固定化金属螯合层析( i m m o b i l i z e dm e t a l c h e l a t e da f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y ，i m a c ) 的原理纯化带有多聚组氨酸亲和标签的蛋白( 序列见表1 ) 【1 5 】。 i m a c 的基础是固定在基质上的过渡态金属离子( c 0 2 + 、n i 2 + 、c 1 1 2 + 、z n 2 + ) 与特定的 氨基酸侧链之间的相互作用。组氨酸是与固定化金属离子作用最强的氨基酸，组氨酸的咪 唑环作为电子供体容易与固定的金属离子形成配位键【1 6 1 。基质n t a 树脂形成四齿的螯合 物，非常适合与金属离子形成6 价配位键，2 价用于可逆保留生物大分子【1 7 1 。带聚组氨酸 标签的蛋白质可以在天然条件下、在低或高浓度盐的缓冲液中结合到n i 2 + - n t a 基质上， 结合后，目标蛋白可用0 8 2 5 0m m 咪唑梯度洗脱，低浓度的咪唑( 如0 8r a m ) 可减少 宿主蛋白的非特异性吸附【1 8 】。 多聚组氨酸标签广泛应用于重组蛋白的纯化和检测【1 蛆。 浙江理工大学硕士学位论文 1 2 4c - m y c 标签( c - m y c t a g ) c - m y ct a g 由1 1 个氨基酸残基组成( 序列见表1 ) ，可融合在目标蛋白的c 端或n 端。 c - r n y c 标记的蛋白质可通过偶联9 e 1 0 单抗到二乙烯砜活化的琼脂糖上进行亲和纯化，用 低p h 缓冲液沈脱，但低p h 往往降低蛋白质的活力【2 2 1 。c - m y c 标签已成功应用在 w e s t e r n b l o t t i n g 、免疫沉淀和流式细胞术，因此可用于监测重组蛋白质在细菌、酵母、昆 虫细胞和u 甫- l 动物细胞中的表达情况【2 3 之7 1 。 1 2 5 链球菌抗生物素蛋白结合肽标签( s t r e p 4 a g ) s t r e p 标签用于在链球菌抗生物素蛋白( s t r e p t a v i d i n ) 层析柱上亲和纯化相应的融合蛋 白【2 8 1 。链球菌抗物生素蛋白( s t r e p t a v i d i n ) 在特定位点第4 4 、4 5 和4 7 位的突变体与天然 形式相比，对八肽s t r e p t a gi i 的亲和力更强，这一链球菌抗生物素蛋白突变体称为 s t r e p t a c t i n 。s t r e p 标签融合的蛋白在生理缓冲液条件下结合到生物素结合区域中，并可用 生物素衍生物温和洗脱，洗脱时推荐使用2 5m m 脱硫生物裂2 9 1 。s t r e p 标签可以融合到目 标蛋白的c 端或n 端，其与s t r e p t a c t i n 的亲和常数接近l 斗m 【3 0 1 。重组s t r e p 融合蛋白在细 菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞中都有成功表达【3 1 粕】。 1 2 6 多聚精氨酸标签( p o l y - a r g - t a g ) 多聚精氨酸标签通常由6 个精氨酸组成( 序列见表1 ) 3 5 】。精氨酸是碱性最强的氨基 酸，带6 个精氨酸标签的融合蛋白可以结合到阳离子交换树脂s p s e p h a d e x 上，而大部分 杂蛋白不结合，结合后，带h i s 标签的融合蛋白在碱性p h 下运行线性n a c l 梯度洗脱进行 收集【3 6 1 。精氨酸残基的c 末端序列可用羧肽酶b 处理去除，但常常由于低的切割得率或者 发生不必要的切割而受到限制【3 7 1 。 1 2 7s 标签( s - t a g ) s t a g 是个多肽标签，由4 个带正电荷氨基酸残基、3 个带负电荷氨基酸残基、3 个不 带电的极性氨基酸残基和5 个非极性氨基酸残基组成，这使s 标签保持高可溶性【3 8 】( 序列 见表1 ) 。该系统的基础是1 5 个氨基酸残基的s t a g 与1 0 3 氨基酸残基的s 一蛋白质之间的 强烈相互作用，二者都来自r n a s e a 3 9 】。s 蛋白质s 标签复合物的亲和常数接近o 1 州【加】。 s 标签融合蛋白的洗脱条件较苛刻，如p h2 0 的缓冲液【4 1 】。该系统可用于纯化的重组蛋白 质来源包括细菌、哺乳动物细胞和杆状病毒感染的昆虫细胞抽提物【4 2 铂】。此外，该系统经 9 浙江理工大学硕士学位论文 常与第二标签联用，r n a s e 酶a 高度灵敏的荧光底物的发现使得该系统可用于与高通量筛 选联用的检测【4 5 1 。 1 2 8 钙调蛋白结合肽标签( c b p t a g ) 钙调蛋白结合肽( c a l m o d u l i n b i n d i n g p e p t i d e ，c b p ) 来自骨骼肌的肌浆球蛋白轻链激酶 的c 端2 6 个残基( 序列见表1 ) 。它在0 2m mc a c l 2 存在时与钙调蛋白的亲和力可达纳摩 尔水平，紧密的结合使洗涤更严谨，确保仅少量的杂蛋白与融合蛋白共纯化。如果在第一 步目标蛋白质没有完全洗脱下来，可进一步用e d t a 和1 mn a c i 洗脱【4 6 1 。由于没有可与钙 调蛋白相互作用的内源蛋白质，该系统在纯化大肠杆菌表达的重组蛋白时能够达到很高的 纯度【4 7 】，且可耐受还原剂和高达o 1 的去污剂f 4 8 】。真核细胞的纯化则不是很理想，因为 有许多内源蛋白质可与钙调蛋白作用【4 9 1 。钙调蛋白结合肽可融合到目标蛋白的n 端或c 端，但位于目标蛋白n 末端可能降低翻译效率，而在c 末端则可高表达【5 0 】。 1 3 亲和标签的应用 1 3 1 亲和层析 亲和层析的原理是利用蛋白质能够作为许多配体结合蛋白( 如抗体、酶和凝集素) 的 配体或者其本身就是配体结合蛋白( 如作为受体) 这一性质来进行蛋白质纯化的各种技术。 由于受体配体的相互作用具有很高的特异性，而且能与目的蛋白结合的受体配体位点是 唯一的，因而亲和层析方法通常只需要极少的步骤就可以获得纯的或接近纯的蛋白质【5 1 1 。 某些目的蛋白上的受体或配体位点( 抗原决定簇和酶的活性位点) 通常是有限的，一 旦识别，就能为蛋白质的纯化提供强有力的手段，而其他一些受体或配体位点( 如能与某 些染料或外源凝集素作用的位点) 与前者相比，特异性较差，但是仍可以作为从复杂的蛋 白质混合液中分离特殊蛋白质的方法。对蛋白质上的受体和( 或) 配体结合位点的特性通 常早已了解( 如能与特殊底物或单克隆抗体发生反应) ，且先于蛋白质原始的生化特性， 这既能为蛋白质纯化节省时间，又能促进纯化程序的建立。而其他的结合位点( 如能与某 些染料或外源凝集素反应) ，则通常必须先进行试验性的研究才能决定此种特殊的蛋白质 层析方法是否可行圈。由于每种蛋白质具有多种受体配体结合位点，因而为了获得高纯度 的蛋白质，有时会将几种不同的亲和层析方法结合起来使用。 1 0 浙江理工大学硕士学位论文 广泛应用的亲和层析方法是利用基因工程的手段引入亲和标签( 如金属结合位点) ， 将其融合到目标蛋白的n 端或者c 端，对天然蛋白质进行这样的改造，极大的方便了目的 蛋白的纯化【5 3 】。如果不希望由于亲和标签的引入而导致重组蛋白的结构或生化特性发生改 变，那么可以在紧邻亲和标签的位置加入蛋白酶切位点，以便在用亲和层析纯化之后，将 多余的蛋白质片段去掉( 如用凝血酶切去多聚组氨酸镍离子结合位点) 。 1 3 2 提高目标蛋白的可溶性表达水平 据统计，超过一半的重组蛋白在大肠杆菌中表达时形成包涵体，这大大影响后续工作。 目前已知有些亲和标签能够促进目标蛋白的溶解，如谷胱甘肽s 转移酶【5 4 1 、麦芽糖结合蛋 白【5 5 1 和大肠杆菌蛋白n u s a l 5 6 】等。理论上任何自身具有高溶解度的蛋白质都可以作为亲和 标签与目的蛋白融合表达从而提高其可溶性。近年来，一种新的多肽标签s t a g 得到应用， 与通过促进目标蛋白形成稳定的三维结构来提高溶解度的蛋白质类标签不同，s t a g 可能是 通过在新生的多肽之间产生高的静电斥力来阻止多聚体的形成从而促进了蛋白的溶解【5 7 1 。 1 3 3 融合于蛋白n 端的标签通常能够提高蛋白产率 m r n a 形成的二级结构会阻碍核糖体与其结合影响了翻译的起始，而位于目标蛋白n 端的亲和标签通常能够提供良好的环境来促进核糖体起始翻译。位于重组蛋白n 端或c 端 的亲和标签还能够影响到蛋白的降解，可能是亲和标签通过抗细胞内的蛋白酶的降解从而 相对提高了目标蛋白的产率【5 8 】。 1 3 4 提供检测目标蛋白高灵敏度方法 亲和标签与配体之间的相互作用为重组蛋白的检测提供了极大便利，很多商业化的信 号酶报道系统都是基于此构建的，如碱性磷酸酶链霉亲和素复合物、辣根过氧化物酶链 霉亲和素复合物都是基于链霉亲和素与生物素或链霉亲和素结合肽( s t r e pt a g 、s b p - t a g 、 n a n o t a g ) 之间的相互作用结合信号酶显色反应来实现重组蛋白质的检测【5 9 石1 1 。 1 3 5 用于蛋白质蛋白质相互作用研究 目前研究蛋白质蛋白质相互作用已经有很多成熟的技术平台，如蛋白芯片【6 2 捌】以及基 于表面等离子体共振原理的b i a c o r e 系纠6 5 , 6 6 。这些技术平台都有一个关键的技术步骤即 将某种生物分子( 蛋白质、核酸等) 固定在固相基质上。目前固定核酸的方法已经比较成熟， 而蛋白质与其不同，其对所处环境要求比较严格，而且蛋白质分子在固相表面容易失活。 浙江理工大学硕士学位论文 利用亲和标签与其配基之间的相互作用可以较好地克服上述困难，亲和标签在目的蛋白与 固相基质之间能够起到一种间隔臂( s p a c e ra r m ) 的作用，这大大减少了目的蛋白与固相基质 直接接触的机会，同时由于亲和标签通常位于融合蛋白的n 端或c 端，从而可以使其活性 中心充分展露，形成一种均质配基表面，而这种均质表面的形成对于蛋白芯片以及基于 b i a c o r e 系统的实验成功非常关键。g s tp u n d o w na s s a y 技术已广泛应用于研究蛋白质- 蛋 白质相互作用6 7 , 6 8 】。 1 4 影响亲和标签应用的因素 1 4 1 亲和标签对目标蛋白结构和功能的影响 亲和标签与目标蛋白之间的作用是相互的，既要考虑到对目标蛋白结构和功能的影 响，又要考虑到对标签与其配体亲和作用的影响以及实际的用途。大多数情况首选短的多 肽标签，因为多肽标签对目标蛋白的结构和生化活性影响最小，在某些应用中，短肽不必 去除，因为目标蛋白已经具有完全的生物学功能，这也是h i s 标签比g s t 标签应用更广泛 的原因，而且短肽不具有或者较少具有免疫原性，因此融合蛋白可直接用于制备；而大的 亲和标签可能影响目标蛋白的结构及生物学功能6 9 1 。另外，目标蛋白可能会干扰多肽标签 与其配体的结合，与小的多肽标签相比，蛋白质标签也在实验室作为常规选择，它们的亲 和配体大多是低分子化合物，可以降低目标蛋白对结合的影响，增强纯化的特异性，许多 情况下，融合蛋白去除亲和标签后，目标蛋白可形成j 下确的构象。 1 4 2 蛋白质的稳定性 含有二硫键的蛋白质或某些蛋白在进行非融合表达时，容易形成包涵体，或有降解发 生【7 0 】。目标蛋白的不正确折叠容易形成包涵体，n a , 亲和标签可以促进目标蛋白的正确折 叠从而提高融合蛋白的可溶性。如麦芽糖结合蛋白( m b p ) 具有分子伴侣样的特性，进行 n 端融合，常有助于蛋白质的正确折叠和活性蛋白的获得。末端氨基酸不稳定容易造成目 标蛋白的降解，此时标签蛋白在n 端融合有助于保护目标蛋白的n 端，而c 端融合有助 于保护目标蛋白的c 端，从而可以获得全长的目标蛋白【7 1 1 。 1 4 3 亲和标签所融合的位置 亲和标签可以加在目标蛋白的n 端或c 端，也可与其他标签串联起来使用。在选择融 合位置的时候，要考虑所处位置对标签亲和性的影响，如g s t 标签适合加在目标蛋白n 1 2 浙江理工大学硕士学位论文 端；还要考虑融合可能对目标蛋白的影响，如果目标蛋白的c 端序列包埋在蛋白的内部， 那么进行c 端融合就不合适。多数情况下在n 端融合亲和标签能保留目标蛋白的生物学功 能。n 端标签对表达蛋白的溶解性也有影响，如在n 端使用天然h a t 标签比h i s 标签有 助于目标蛋白的可溶性表达，而n 端进行m b p 融合表达也常用来提高目标蛋白的溶解性。 进行分泌表达时，常选用可分泌的亲和标签，有些亲和标签不适合于放在目标蛋白的n 端 如h i s 标签，因为h i s 标签具有多个带电咪唑残基，放在n 端会影响重组蛋白信号肽的处 理和目标蛋白的分泌【7 2 1 。 1 4 4 是否需要在变性条件下进行亲和纯化 如果融合蛋白以包涵体的形式存在，由于大多数的亲和标签不适于在变性剂存在的条 件下进行亲和纯化，所以只能先进行包涵体的溶解和复性，再在非变性条件下进行亲和纯 化。组氨酸标签在非变性和变性条件下通常均可进行亲和纯化，可以直接在变性条件下进 行亲和纯化或亲和层析复性，而且亲和层析复性常常可以提高目标蛋白的折叠效犁7 3 1 。 1 4 5 亲和标签对表达水平的影响 亲和标签对表达水平的影响不仅与亲和标签和目标蛋白相关，还与选用的表达系统密 切相关，需根据具体情况进行分析。 1 4 6 亲和沈脱的条件 表2 列出了融合蛋白亲和沈脱的条件，有些条件比较温和，而有些条件较为剧烈，选 择的亲和表达系统应该不使目标蛋白变性。 表2 亲和标签基质及洗脱条件 t a b l e2a f f m i t yt a gm a t r i xa n de l u t i o nr e q u i r e m e n t s 浙江理工大学硕士学位论文 1 4 7 亲和介质的费用 目前已有许多商品化的预装亲和层析柱可供选择，当然也可以购买填料和柱子自己填 装，这样花费较低，不过与预装柱相比其亲和纯化效率较难保证。 1 4 8 标签的切除 尽管亲和标签融合策略可以一步使融合蛋白的纯度达到很高，但在蛋白质的下游处理 阶段又引入了新的问题，即需要位点特异的剪切。在进行融合表达时，以下三种情况通常 不必去除亲和标签：目标蛋白作为免疫原用来产生和纯化；目标蛋白的生物活性不受融合 标签的影响；目标蛋白用来直接固定化在介质上。如果亲和标签影响了目标蛋白的功能， 或为了结构生物学研究或治疗用途，则要在融合标签和目标蛋白之间加入特异的剪切位 “- - 一 一一 点，以便去除亲和标签，可用的方法有化学法和酶法。在选择这些方法时除要考虑选择性 等因素外，还要考虑标签去除后氨基酸的残留。目前c 端的标签还没有很好的方法去除， 都会在目标蛋白的c 端引入额外的氨基酸残基。针对n 端标签e 唷巩种蛋白酶在酶切后可 使目标蛋白不带额外的氨基酸残基。化学方法廉价，但是常缺乏选择性，而且使用剧烈的 反应条件常使目标蛋白变性失活，使用蛋白酶的优点是反应的条件温和( 中性p h ，温度为 4 到3 7 ) ，特异性强。如果使用蛋白酶进行特异性剪切，在酶切完成后要有相应去除蛋 白酶的纯化方法，有的重组蛋白酶具有亲和标签，如n 端带有h i s 标签的肠激酶、二肽氨 基肽酶和t e v 蛋白酶，可在酶切后使用金属螯合亲和层析去除，n 端带有g s t 标签的 p r e s c i s s i o n 蛋白酶，可以用谷胱甘肽亲和层析柱去除，还可以将蛋白酶固定化在介质上进 行融合蛋白的酶切，使蛋白酶可重复使用【7 4 】。 2f l a g 亲和标签研究进展 f l a g 亲和标签是一种由八个氨基酸残基d y k d d d d k 组成的表位标记物( e p i t o p e ) 【_ 7 5 】。其序列简短，融合表达后对目标蛋白的结构和生物活性影响小，可以用一条人工合成 的寡聚核苷酸来编码。目前已开发出三种抗f l a g 的单克隆抗体m 1 、m 2 和m 5 。利用 f l a g 标签可以建立个基于融合多肽的高效检测和纯化系统。 1 4 浙江理工大学硕士学位论文 2 1f l a g 标签的结构特点 虽然序列简短，组成f l a g t a g 的八个氨基酸残基却并非随意排列，其位置和序列与 f l a g 的抗原作用密切相关。现已知道芳香族氨基酸是抗原抗体相互作用的主要因素， f l a g 序列的第二个氨基酸是t y r ，t y r 左侧与带电氨基酸a s p 相连，参与抗原性位点的芳香 族氨基酸在高极性环境中产生作用的可能性高于在低极性环境中，位于n 端带负电的a s p 可以辅助t y r 的抗原性。t y r 下游的六个氨基酸残基形成一个六肽序列l d d d k ，这样的序 列可以达到最大的亲水性，并且这个亲水序列能形成高度暴露的三维结构，展示出很强的 抗原性。f l a g 短肽以最短的形式高效地表达了亲和标签的作用【7 6 1 。 2 2f l a g 标签的应用 选择使用f l a g 亲和标签，主要是基于以下因素：首先，该序列短小，仅由八个氨基 酸组成。由于其短小，所以该标签可以只用一条人工合成的寡核苷酸链就可以编码。其次， f l a g t a g 含有一个肠激酶( e n t e r o k i n a s e ) 切割位点d d d d k ，可以通过肠激酶处理除去标 签从而获得天然的非融合蛋白质【7 6 1 。第三，f l a g t a g 可以被融合到目标蛋白的n 端或c 端， 不过n 缅l l t l a 融合具有多种优点，有研究显示，融合在n 端的f l a g 序列稳定且不会被大肠杆菌 蛋白酶除去。f l a g 标签在酵母和大肠杆菌中表达的性质相似。此外，目的蛋白n 端融合了 f l a g 多肽后，c 末端还可以融合其他模块或者不同的亲和配体7 7 1 。 目肖f f l a g 标签系统已成功应用于免疫亲和纯化【7 引、免疫印迹【7 9 1 、免疫染色【8 0 1 、免疫 共沉淀【8 l 】等领域。 2 3f l a g 标签的去除 是否去除f l a g t a g ，取决于目的蛋白的最终用途：对于实验室水平的研究，在初步证 实f l a g t a g 不会干扰目的蛋白的生物学活性后，可以将标签留在上面；当遇到f l a g t a g 会产生干扰的情况时，为了获得可靠的结果，就必须去除标签；对于制备抗体，可以将标 签留在上面作为运载体以促进抗原性；对于药物应用，由于需要得到绝对可靠的产物，通 常都需要准确地去除标签【7 6 1 。 f l a g t a gc 端的五个氨基酸残基d d d d k 是肠激酶的识别位点，该酶包含通用切割试 剂所具有的大多数特征，活性高、可以在很宽的p h 范围、变性剂水平和清洁剂浓度下使用， 对其五肽识别位点的高度专一性识别并在识别位点的c 末端进行切割，留下没有多余氨基 浙江理工大学硕士学位论文 酸的切割产物。通常在设计引物时，在f l a g 序列与目的基因序列之间存在多余的碱基。 h o s f i e l d 等通过不依赖连接的克隆( 1 i g a t i o ni n d e p e n d e n tc l o n i n g ，l i c ) 方法，在f l a g 和 目的基因之间引入一个氨基酸，形成2 d 4 k x 2 序列，x 代表引入的氨基酸。他们将钙调蛋白 的基因引入d 4 k 下游编码蛋白质作为底物，研究氨基酸x 对肠激酶切割效率的影响。实验 结果证明，当切割位点相邻的氨基酸侧链较长、体积较小时，切割更有效。当多余氨基酸 为a l a 、p h e 、l y s 、l e u 、l i e 、m e t 、a s p 、g l u 和a s n 时，水解最完全，切割效率达到8 0 以 上，而t y r 和p r o l 妇于会增加空间位阻而影响切割，切割效率不到7 0 【捌。这一结果对于去 除f l a g 多肽获得天然蛋白质非常重要，可以使用l i c 方法，使得f l a g 序列与目的基 因序列直接相连，中间没有多余的氨基酸。在表达蛋白质后，利用f l a g 标签纯化融合蛋 白，再利用肠激酶切割除去f l a g 短肽得到天然蛋白质，以迸一步用于天然蛋白质性质和 功能的研究。 2 4 抗f l a g 单克隆抗体 根据不同的抗原结合要求，目前已开发出三种抗f l a g 的单克隆抗体：m 1 、m 2 和m 5 ( 见表3 ) 。最早应用的是单克隆抗体m i ，常用于n 端融合f l a g 标签的融合蛋白的纯化和 鉴定。氨基酸扫描实验表明，m 1 抗体的结合主要在前四个氨基酸，并要求具有自由的n 末 端氨基，因此m 1 单克隆抗体专一作用于n 末端f l a g 融合蛋白质，且不能作用于f l a g 融合 蛋白n 端还有其他氨基酸如甲硫氨酸的融合蛋白质，或者是f l a g 标签融合到c 端的蛋白质 【8 3 】。m 1 单抗与f l a g 的结合是否依赖于c a 2 + 目前有争议。 表3 三种抗f l a g - 单- 克隆抗体的作用比较 t a b l e3c o m p a r i s o no fa p p l i c a t i o n so f m a bm i ，m 2 ，m 5 抗体名称作用位点作用序列 c a 2 + 依赖性 为了拓展f l a g 标签的应用领域，后来开发出了单克隆抗体m 2 。m 2 单抗与f l a g 标签 的结合不依赖于c a 2 + ，因此吸附了抗体后的抗原不能被螯合剂如e d t a 等从吸附柱上洗脱。 此外，该抗体允许f l a g 序列前面有多余的氨基酸如m e t 存在，因此这种抗体的重要优势是 1 6 浙江理工大学硕士学位论文 可以应用于在真核系统中表达具有n 端m e t f l a g 结构的重组蛋白，m 2 单抗还可以识别并 结合c 端融合f l a g 标签的重组蛋白【s 4 】。 与单抗m