（生物物理学专业论文）细菌视紫红质br基因的克隆和表达.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 f 细菌视紫红质( b a c t e r i o r h o d o p s i n ，b r ) 是嗜盐菌细胞膜上唯一的色素蛋 白，足一个分子量为2 6 k d 的2 4 8 肽的光敏蛋白。b r 以视黄醛( r e t i n a l ) 作 辅綦，在光诱导下吸收光子后会产，卜一系列的光循环中间体，最后又回到原 始状态。在b r 的光循环过程中发现了紫膜的光电转换过程，这种独特的光 驱色变和光电响应特性使b r 成为光子学研究中的理想材料。 国内、外对b r 的研究侧重于对其理化和光电特性的研究和质子通道机 理方面的理论研究，在遗传工程研究方面存在很多空白，限制了b r 研究的 深入。鉴于目前适用于嗜盐菌的表达载体很少，外源基因转化嗜盐菌的过程 要比转化e c o l l 复杂得多，过程较难控制，效率也不高，而且因为适合于转 化嗜盐菌的质粒拷贝数很少，通常无法用直接抽提质粒经酶切鉴定的方法确 认是否真正将外源基因导入了宿主细胞，故我l | 懿择e c o l i 作为宿主细菌， 将通过p c r 技术获得的b r 基因克隆入原核高效表达载体p g e x 一4 t 2 中，用 i p t g 诱导表达获得b r 与g s t ( 谷胱苷肽转移酶) 的融合蛋白。，由于g s t 的引入，方便了以后的纯化蛋白工作了然后经w e s t e r n b l o t 验证了表达蛋白的 大小与预想的一致。 f 由于b r 是一种生物分子材料，可通过化学修饰或定点突变等方法来进 行改造，可以自山选择来修饰b r 。如何通过定点诱变使得b r 成为人类所需 的材料是人们研究的摄终目的。经遗传工程改良的b r 蛋白质分子，往往具 有一些新的光电特性，与天然b r 相比，更适于用作生物分子器件的材料。 我们的研究工作为以后更广泛深入的改良b r 奠定了基础。 关键词：细菌视紫红质( b r ) ，视黄醛，紫膜，原核表达，融合 一 塑垩盔鲎堡主堂些丝墨 a b s t r a c t b a c t e r i o r h o d o p s i n ( b r 、f o u n di nt h ec e l lm e m b r a n e o fh a l o b a c t e r i ai st h eb e s t u n d e r s t o o di o nt r a n s p o r t p r o t e i n a n dh a sb e c o m eap a r a d i g mf o rm e m b r a n e p r o t e i n si ng e n e r a la n dt r a n s p o r t e r si np a r t i c u l a r b a c t e r i o r h o d o p s i ni st h es i m p l e s t k n o w n l i g h te n e r g y - c o n v e r t i n gs y s t e m s i ti ss m a l lp r o t e i na n dr e q u i r e so n l yl i g h t a n dal i p i d b i l a y e rt og e n e r a t ea n e l e c t r o c h e m i c a li o ng r a d i e n t t h e r e s u l t i n g t r a n s m e m b r a n ee l e c t r o c h e m i c a lg r a d i e n ti su s e db yt h ec e l lf o ra t p s y n t h e s i sa n d i o nt r a n s p o r t b a c t e r i o r h o d o p s i nc l o s e l yr e s e m b l et h ev i s u a lp i g m e n t so fa n i m a l s ，b u tn o o b v i o u s s e q u e n c eh o m o l o g i e so r i g i n a l l yi n d i c a t e da ne v o l u t i o n a r y c o n n e c t i o n b a c t e r i o r h o d o p s i nb e l o n g st ot h ef a m i l yo fs e v e nh e l i xm e m b r a n ep r o t e i n s w h i c hc a r r yr e t i n a la sac h r o m o p h o r e b a c t e r i o r h o d o p s i n ，w h i c hc o n s i s t so fa s i n g l ep o l y p e p t i d e c h a i no f2 4 8a m i n oa c i d s b a e t e r i o r h o d o p s i n ( 2 6 ，0 0 0 ) c o n t a i n sam o l e c u l eo fa l l t r a n s - r e t i n a la st l l ec h r o m o p h o r e w h i c hi sl i n k e dt o l y s - 2 1 6a sas c h i f f sb a s e t h ep o l y p e p t i d ec h a i nf o r m sac o n t i n u u mo fs e v e na h e l i c e s ，e a c ho f w h i c hs p a n s t h em e m b r a n ea n di sl a r g e l ye m b e d d e di ni t a b s o r p t i o no f ap h o t o nb yb ri n i t i a t e sa c a t a l y t i cc y c l et h a tl e a d st ov e c t o r i a l t r a n s p o r t o fap r o t o no u to ft h ec e l l a f t e r a b s o r p t i o n ，t h e a l l - t r a n s - r e t i n a l i s o m e r i z e st oa13 - c i sc o n f i g u r a t i o na n db r u n d e r g o e s ap h o t o c y c l e ： b r 5 7 0 - - - k 5 9 旷l 5 5 0 斗m 4 l o n 5 2 0 0 6 4 0 _ b r s 7 0 i nt h i sp a p e r , w er e p o r ts t u d i e so ne x p r e s s i o no ft h eb rg e n e t h ef i r s t r e q u i r e m e n t i st h ei s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no ft h eb rg e n ef r o m h a l o b i u md n a t h eb r g e n ew a sg o tf r o m t h eg e n o m i cd n ao fh a l o b a c t r i u m h a l o b i u mt h r o u g hp c r t e c h n i q u e s ，a n d c l o n e di n t ot h ep g e m tv e c t o r , i t s s e q u e n c ew a sd e t e r m i n e db yd n a s e q u e n c i n gs y s t e m i tw a s t h e ns u b e l o n e di n t o t h e p g e x 一4 t 2e x p r e s s i o nv e c t o r , a n de x p r e s s e d i nf c o l i b l ( d e 3 ) a f t e r t r a n s f o r m a t i o na n di p t gi n d u c t i o n t h ec o n s t r u c t e dp l a s m i dc o n t a i n i n gg s t ，b r f u s e d g e n eg a v eah i g h l e v e lo fe x p r e s s i o no ft h ef u s e dg e n e w e s t e r nb l o t a n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tt h ef u s i o np r o t e i nc o u l ds p e c i f i c a l l yb i n dt oa n t i g s t a n t i b o d y t h es d s - p a g ea n a l y s i ss h o w e d t h a tt h ew e i g h to f t h ef u s i o np r o t e i ni s c o r r e c t k e y w o r d s ：b a c t e r i o r h o d o p s i n ；c l o n e ；e x p r e s s i o n ；p u m p ；p h o t o c y c l e - 2 综述部分 细菌视紫红质的结构与功能 浙江丈学硕士学位论文 前言 视紫红质( r h o d o p s i n ) 足人们发现的第一种含视黄醛的膜蛋白。它位于动 物视觉器官的感光细胞中，将接受的光讯号转变为电讯号。在发现视紫红质 约一f 址纪之后，1 9 6 6 年o e s t e r h e l t 和s t o e c k e n i u s 研究极端嗜盐蒲 f h a l o b a c t e r i u mh a l o b i u m ) 时发现r 另种膜蛋白。1 9 7 0 年确定r 这科岱t l 质 类似视紫红质，也含视黄醛，爿二对光照起反应，从而被命名为细菌视紫红质 ( b a c t e r i o r h o d o p s i n ，b r ) 1 1 1 0 细菌视紫红质是迄今为止知道的最简单的光能转换色素蛋白之一，无论 结构、生色基团，还是光循环反应，尽管与视紫红质有众多相似之处，但是 二者在一级序列上却没有明显的同源性，颇不相似。这种在进化关系上相距 甚远而结构和功能方面却极相似的现象在生物学中不乏其例，引人深思。 细菌视紫红质是嗜盐菌紫膜上唯一的光能转换色素蛋白，占紫膜的 7 5 嘣2 孙】，个分子量为2 6 k d 的2 4 8 肽的光敏蛋白。b r 以紫色的视黄醛 ( r e t i n a l ) 作辅基，在光诱导下吸收光子后会产生一系列的光循环中间体， 最后又回到原始状态1 5 6 7 1 。在b r 的光循环过程中发现了紫膜的光电转换过 程，这种独特的光驱色变和光电响应特性使b r 成为光子学研究中的理想材 料f ”1 。 b r 被认为是最有前途的光敏蛋自。由十特有的高稳定性和对分子结构的 进一步了解，人们对它的兴趣越来越大。l j r 作为一种灭然材料，具有其它 人工合成材料所无可比拟的特性。作为视紫红质的类似物，l j r 可以存在于 嗜盐菌的体内，也可以组装到其它的人造膜系统中并保持完整的结构和功能 达数年之久。此外，还可以通过常用的变构法或特殊的选择分离法来得到b r 的多肽链o o ”。 作为一种生物分子材料，r r 可通过化学修饰或定点突变等方法来进行改 造，可以自由地选择来修饰b r 。如何通过定点诱变使得b r 成为人类所需特 性的材料是研究的最终目的。经遗传工程改良的b r 分子，往往具有一些新 的光电特性，与天然腓相比，更适于用作生物分子器件的材料5 , 9 , 1 0 , 1 3 l 。b r 基因的定点突变和它在大肠杆菌( 叵c 0 1 _ z 3 1 4 , 1 5 、酵母n 6 1 、爪蟾卵母细胞f 1 7 1 、 嗜盐菌突变体( 跏一) 、真核细胞。研中表达的成功，使得我们可以较自由地 止 浙江大学硕士学位论文 修饰b r ，获得某些新特性。可以说对b r 的研究开辟了材料科学的新纪元。 一结构 1 b r 的结构特点 嗜盐菌是一种在高浓度的钠盐和镁盐的条件f 才能生k 的细蒲。细蔺视 紫红质( b r ) 是嗜盐菌紫膜巾的唯一蛋白质。尽管所有的视黄醛蛋f _ ! ! 都折叠成 七次穿膜的螺旋形态，螺旋之间有环相连，但只有b r 能自发地在细胞膜e 形成二维的晶体斑块f 1 唧l ，即紫膜。 、y m m“t m “ m uum 蹈m v i i i e 目 t n l 印 藏麓 “u 博i t e t 咿 u 麟。 * y mym m mu uu m ；。心。 嗵虬u b c y l e u ，。o d e f g d f 礓r i f i g 1t h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo fb ra n dt h ei n f e r r e dh e l i c a ls e g m e n t s p r o p o s e d i n1 9 7 9 t h ee x a c tl e n g t ho ft h es e g m e n t sa n dt h e i rv e r t i c a l p o s i t i o n sa r ct a l c e n f r o mah i g h e rr e s o l u t i o n e l e c t r o n c r y s t a l l o g r a p h ym a pp u b l i s h e di n1 9 9 0 p o t e n t i a l l yc h a l 倒r e s i d u e sa r em a r k e d 浙江丈学硕士学位论文 b r 的一个显著特征是它作为膜蛋白在紫膜中排列十分规则。借助电子 显微镜和l 乜子束衍射技术可知，b r 在天然紫膜中以六角型二维晶体结构排 列，并以置个分予为单位成i 聚体排布，每个三聚体周围约有3 0 个磷脂分 子，其中有：个磷脂分子位f 三聚体中央。 b r 分子的2 4 8 个氨基酸折叠成7 段夫体与膜平面垂甑的枉状结构，这 七段疏水柱( 分别命名为a g ) 嵌在紫膜中，其问由露在膜外的短环状部分 f 亲水区) 相7 i 连接f 。其一 | b 、c 、d 、e 【q 段一般认为是螺旋结构，f 枉也 倾向于螺旋，a 和g 桂则可能有8 折叠成分吲。膜厚约4 0 埃，膜中每段柱 子约2 4 - - 2 8 个残基，k 度大约为4 n m l 2 “，排列成一个呈弓形的结构模型中， 紧紧围着b r 的色素基团视黄醛分子。视黄醛以质子化的s e h i f f 碱形式 连在g 柱的l y s 2 1 6 末端的 上i ”j ( 图2 和图3 ) 。全反式视黄醛与膜平面成 1 9 。2 8 。的角 2 5 1 ，距外膜表面约0 ，6 , - , 09n m 。 r i g 2t h es t r u c t u r a lm o d e lo fb a c t e r o r h o d o p s i nw i t hs e l e c t e dr e s i d u e si m p o r t a n t f o rp r o t o nt r a n s f e rs t e p ss h o w ni nb a l la n ds t i c kr e p r e s e n t a t i o n t h ep o s s i b l ep a t h o f p r o t o n si si n d i c a t e db ya l t o w s 浙江大学硕士学位论文 2 b r 在光循环中的结构变化 目前，对b r 结构的研究主要有两个方面：基态b r ( 光适应或暗适应状 态) 的结构和明适应b r 光循环中间体相对摹态b r 的结构变化。 紫膜独特的：维结构性质，可用电子衍射方法在0o c 下观测它的分子 结构。自从h e n d e r s o n 等的开创性t 作以来，电子衍射方法一直是研究b r 结构的i ：要手段，1 9 7 5 年h e n d e r s o n 和u n w i n 根据0 7 n m 的分辨率建立r b r 的空问模型1 2 3 , 2 6 i ，1 9 8 6 年建立0 3 5 n m 的分辨率的模型f 2 7 2 ，继而建立03 n m 分辨率的模型口”，最近已将分辨率提高至01 8 n m 。 h e n d e r s o n 等利用超低温电子显微镜不仅获得了较高分辨率的基态b r 的结构图像，还分析了生色团周围2 1 个氨基酸残基的位置及与视黄醛的空 间关系，确定了构成质子通道的2 6 个氨基酸的相对位置( 图2 ) ，并提出了质 子转运的主要过程及席夫碱基在泵出和摄入质子状态的构像( 图3 ) 。 一个b r 分子只含有一个辅基视黄醛分子。b r 分子是由视黄醛以1 ：1 的比例，藉席夫碱基与细菌视蛋i ；t ( b a c t e r i o o p s i r l ，分子量2 5 ，5 0 0 d a ) 的赖氨 酸残基( l y s 2 1 6 ) 以共价键相连接，构成的一种对光敏感的色素蛋白 3 t - 3 3 i 。席 夫碱将。一螺旋内的空间分成胞外、胞内两个“半通道”这两个“半通道”共 。心r 、r 2 j 叶r ” f i g 3t h er e t i n a li s o m e r i z a t i o n sd u r i n gt h ep r o t o nt r a n s p o r ti nb r 浙江大学硕士学位沧文 同构成了质子转运的通道。此通道贯穿细胞膜并以视黄醛发色团为疏水性 中心。胞外的“半通道”富含带电荷的或亲水的青氢键结合的氨基酸残基。胞 内的“半通道”则较简单，几乎都是疏水的氨基酸残基阻，由此推想，质了是 通过发色团沿着i jo 一螺旋侧链所建立的传递系统进行运输。 b r 分子仃两种可以棚互转换的存在形式，- 8 1 是含全反式视黄醛的异 构体：另一种是含1 3 一顺式视黄醛的异构体。视黄醛在b r 的光驱质子泵循 环叶 i 扮演着一个必不可少的角色，象一个控制质子的泵出及质子接受的开天 i i 。 由于时间分辨技术的进展和低温捕捉光循环中间体的实现，对中间体的 结构研究有了迅速发展。用电子衍射、x 衍射以及中子衍射技术进行的研究 表明，中间体m 与基态b r 有明显差异。主要表现在细胞膜内侧螺旋f 和 g 附近的结构变化。对定点突变引入半胱氨酸后连接自旋标记的b r 进行时 间分辨电子顺磁共振研究，更进一步证实了m 的衰减伴随着螺旋c d 间和 e f 间的连接肽段的构像变化( 在膜内侧) 。这些结果提示，席夫碱基的重质 了化和质子摄取过程伴随着b r 构像的显著变化，即a s p 9 6 附近微环境的显 著变化，使质予通道胞质侧一半的疏水性降低。 3 b r 折叠的有关因素 在视黄醛合成功能缺失株i w 5 细胞株中加入视黄醛，j w 5 细胞能够 在胞内合成有功能的b r ，缺失株所合成的b r 的席夫碱p k a 值和野生犁b r 的相同。在体外，j w 5 的脱辅基细胞膜蛋白和视黄醛重建而成的b r ，其席 犬碱p k a 值为8 5 1 3 5 ，用光照射时，视黄醛异构成全反式构像从而触发b r 的光循环的发乍。k a h n 下w 等由此推测：在体外折叠中，视黄醛的作用足 作为多肽链精确折叠的个模板，引导侧链围绕生色基团紧密结合。不管席 夫碱p k a 之间有多大的差别，在以上这些模型中，m 中间体激发和衰减的 光循环动力学都十分相似。而b r 制备条件的差别是，b r 的生物合成是在 高盐下，体外重建则是在低盐下。所以推测，b r 尽管在各种条件下都很 稳定，但是离子强度可能对最终形成有功能的成熟b r 蛋白的折叠过程仍会 浙江大学硕士学位论文 有一定影响。 另有实验证明，将经过s d s 变性处理的b r 蛋白迅速与去污剂脂类微胶 刚( s d s d m p c c h a p s ) 混合，小管视黄醛存在与否，都可以起始折叠。 b r 即使在s d s 中仍能保持6 0 的二极结构，相当于3 - 4 个跨膜的o 螺旋 1 3 6 3 7 1 。不过有机酸则可以导致二极结构的完全丧失1 4 2 i 。用圆二色性光谱技术 跟踪观察，结果显示折叠过程中螺旋结构的形成涉及到7 0 个氨基酸，其r p 4 0 个氨基酸的折叠是非时间分辨的1 3 7 1 。由此可见，b r 的折叠机理尚有待于 用x 光衍射、电子扫描、时间分辨荧光波谱、时间分辨吸收波谱、圃二色 性跟踪等多种技术进一步探索和研究。 研究表明，两个或三个包含互补的螺旋的片段就可以折叠形成有功能的 b r ”“。连接螺旋a 到f 之间的小环尽管使b r 的结构更加稳定，但对螺 旋的正确定位和定向并没有作用。在折叠的第二阶段，功能分子形成之前， 这些螺旋( 或螺旋的复合片段) 代表着独立的折叠单位i “l 。但并不是所有的螺 旋都这样，对应于螺旋a e 的肽链形成了稳定的跨膜a 一螺旋；螺旋f 则 不形成任何稳定的二级结构；螺旋g 形成一个超稳定的1 3 一折叠；螺旋c 可以在适当的p h 条件下，可逆性地插入到膜中 4 3 , 4 4 】。对这些肽腱而言，一 些外部的约束对螺旋结构的形成可能是必需的。 二功能 1 b r 的能量代谢途径 从七十年代起，人们就对b r 的功能作了研究并获得_ 重大发现。首先， 在有氧和无氧条件下分别对四种生理类型的微生物进行光照禾l 暗培养，测定 a t p 的合成。结果发现，h a l o b a c t e r i u mh a l o b i u m 可以生长在光照和氧都具 备的条件下，但在两者都不存在的情况下不能生长。这就说明，嗜盐菌可通 过两条途径获取能量，一条是有氧存在下的氧化磷酸化途径，另一条是有光 存在下的某种光合磷酸化途径。实验还发现，在波长为5 5 0 6 0 0n m 的光照 f ，a t p 合成速率最高，这一波长范围恰与b r 的吸收光谱相一致。因此 浙江大学颂士学位论文 认为，b r 扣p 绿素相蒙，在光蹙子的驱动下，具有质子泵的作用，这时它 将产生的h 推出细胞膜外，使紫膜内外造成一个质子梯度差。 嗜盐菌的主要能：黩来源是通过呼吸作用泵质子，形成跨膜的电化学离子 梯度。当缺氧对呼吸作用变肉难，菌即会在光照条件f 合成b r ，形成紫膜。 这时，l i 常的氧化磷酸化已无法满足其能量需要，因而转由紫膜的光合磷酸 化束提供。通过紫膜的光能转化而建遗起来的质子梯度除r 可驱动a t p 合 成外，还可为嗜盐菌在高盐环境f 建立跨膜的n 掣电化学梯度，并由此完成 一系列的生理生化功能( 图4 ) 。嗜盐菌紫膜光合磷酸化功能的发艘，使经典 的叶绿素和菌绿紊所进行光合磷酸化之外又增添了一种新的光合作用类型。 紫膜的光合磷酸化是迄今所知道的最简单的光合磷酸化反应，是研究化学渗 透作用的极好的实验模型，对其机制的揭示，无疑会对人类的生产实践例如 太阳能的利用和海水的淡化等带来巨大的推动力。 f i g 4 嗜盐菌的紫膜及其光合磷酸化示意图 八1 年代，人们推测：光照引起细菌视紫红质发生构型变化，把质子释 入外通道，再经过一系列低p k 基团( 如羧基) 将其渡运到壁膜间隙。然后， 非质子化的脱色发色团经占据着内通道的一系列高p k 基团( 如赖氨酰基) 从 细胞质内接受一个质子，细菌视紫红质随即恢复到原初构型。另一种可能的 方式是，某种跨越膜的“冰”通道代替这些酸碱基而起作用，它使质子沿着结 浙江大学硕士学位论文 合着氢的晶格结构通行。 最近的研究表明，在黑暗中，b r 的辅基部分视黄醛以1 3 顿式和全 反式异构体的混合形式存在，二者之间建立起一种平衡。它们与细菌视蛋白 一起形成一种暗适应的、在光波长5 7 0 n m 处有最大光吸收的紫色复合体 b r ，。低温和迅速闪光光谱的研究结果表明，低强度光照引起b r ，7 0 发生从 1 3 顺式到全反式的构像变化【4 5 】。b r ，。在光激发下，可以有效地建立起一个 光循环反应，泵出一个质子到膜外，并从细胞内吸收一个质子，即光驱动质 子作跨膜运动，在膜两侧产生电位差( 3 0 0 m y ) 和p h 梯度( p h 约1 0 ) 。 细胞利用这种电化学梯度由a d p 合成a t p ，把光能转换成化学能，并完成 一系列生理反应。 2 b r 的光循环过程 光循环过程是一个相当复杂的过程。在光照下，b r 的分子构型发生一 系列的瞬态变化，其最大吸收峰也相应地发生一系列变化，期间产生不同最 大吸收峰的b r 瞬态物，称为“光循环中间体”。b r 经历一系列中间体及亚 稳状态，最后又回到原初态b r ，7 0 ，形成一个光循环，如图5 所示【4 7 】： b r 5 7 0 k 娴j l ，5 0 j m 4 l o j n 5 5 0 0 j b r 5 7 0 光循环开始于一称为“b r ；。”的原初状态，在此状态f ，视黄醛保持全 反式构象。光吸收导致视黄醛发生光致异构化反应，从全反式一1 3 一顺式， 于是触发rb r 分子的原初异构化过程b 心，。订。此过程极为快速，在5 0 0 f s 内完成，质子的产额也相当高( o 6 4 - + 0 4 ) ，但j 。中间体极不稳定，在5 p s 内，b r 形成第一个中间体k ，。在l p s 内，k ，。斗l ，。，此时视黄醛席夫碱 质子被传递到a s i h ，于是b r 形成中间体m 。( 地。在视黄醛席夫碱的去 质子化作用下，会发生强烈的蓝移) 。在毫秒内，视黄醛席夫碱会重新质子 化形成中间体n 5 。( 此质子由细胞质膜附近的内部质子施主a s 提供) ， n ，。中的视黄醛重异构成全反式构象，形成0 ，最后出。这些光 循环中间体的寿命各不相同，如：k 为p s ，l ，o 为岫，而m 。为m s 。在正 一 塑望查兰堡主兰堡堡兰一一 常状态下，一个光循环过程需要十几个m s 。 t h et i m es h o w n r e f e rt ot h ef o r w a r d r e a c i i o n st h eq u e s t i o n m a r k si n d i c a t eo t h e r g r o u p sp a r t i c i p a t i n gm t h e p r o t o n t r a u s f c r ， w h i c hc o u l dn o tb e s p c c i f i e d f i g 5a c o n s e n s u sv e r s i o no f t h eg e n e r a lp h o t o c y c l em o d e l r a m a n 光谱的研究表明，在b r 分子的各中间体中，只有m 。含1 3 顺 式视黄醛，即m 4 。卜的席犬碱是去质了化的，其它中问体足质了二化的。这 意味蕾，在菜些循环期问视黄醛发生全反式0 1 3 顺式寸全反式的笄构化循 环反应，但是循环中间产物的详细化学性质仍不十分清楚 b r 分子在光循环过程中可进行质子的运输，把质子从膜内运到膜外， 在紫膜的两侧产生质子梯度，紫膜利用此质子梯度的能量合成a t p 。现已知 道b r 的质了转运有六个主要步骤( 图6 1 。 a ) 光激发使b r 生色团异构化席夫碱基的位置变化弱化了与t y r l 8 5 、 a s p 2 1 2 、a r 9 8 2 、a s p 8 5 等的相互作用，蛋白质构像出现扭曲力； b ) 席夫碱基将一个质子传递给去质子化状态的a s p 8 5 ，c - d 和e - f 间的 连接肽发生构像变化，改变了席夫碱基的取向，增强了质子通道细胞内侧一 浙江大学硕士学位论文 半的亲水性，也因此提高了席夫碱基的p k a ： c ) 质子经过一未知基团释放到胞外侧； d ) 蛋自质构像的扭曲力被松弛，质子从质子化状态的a s p 9 6 在胞内侧 传递给席夫碱( 可能亦通过未知基团，包括需要一些水分子) ； e ) a s p 9 6 从胞内侧重新获取质子： d 蛋白质驱动生色团由1 3 ，顺式再异构化为全反形式b r 回复到基态。 f 遍6s k e t c ho f t h ep u m pm o d e la si ta p p e a r e da r o u n d1 9 9 0 b r 的功能是作为光驱动的质子泵，吸收光能将 r 由胞质中泵向胞质外， 把光能转变成膜两侧的电化学势差而储存备用。在膜两边可测量到直流光电 压信号以及快速的位移电流信号。这种电化学势差a1 1h 包括膜两侧的电 - 1 3 堑婆查兰婴主堂焦堡塞一 位差av 和 r 浓度差p h 两部分。h h 中蕴藏的能量为： u i = f at f - 2 3 0 3 r t a p h ( 其中f 为法拉第常数，r 为气体常数，t 为绝对温度) 一个h + 由膜内泵向膜外所产生的膜两侧自由能之差为： p = e a 2 3 0 3 k t a p h ( a p 又称为质子驱动力) ( 其一中e 为正电子电荷，k 是波尔兹曼常数) 应用光谱技术、p h 测定、电位测定以及快速激光闪光等实验手段，对b r 的光循环中视黄醛的构像变化已了解得较清楚( 图7 ) 。 n b r5 7 0 k 5 帅 f i g 7t h et r a n s p o r tm o d e lp o s t u l a t e dc o n n e c t i o no ft h es c h i f f sb a s ei nt h e g r o u n ds t a t et ot h ee x t e r n a ls u r f a c ea n das i m u l t a n e o u si s o m e r i z a t i o no f t h er e t i n a l i nt h ee x c i t e ds t a t ef r o ma l l - t r a n st o1 3 - a n d1 4 - c i s t h es i n g l eb o n d r e i s o m e r i z a t i o nt ot m n sw a sa s s u m e dt oo c c u ri nms t a t es w i t c h i n gc o n n e c t i v i t y f r o mt h ee x t e r i o rt ot h ei n t e r i o rs u r f a c e s u b s e q u e n ts c h i 酽sb a s er e p r o t o n a t i o ni n t h en _ mt r a n s i t i o nw o u l dt h e nf a e i f i t a t et h e r m a ld o u b l eb o n dr e - i s o m e r i z a t i o n 光循环中间产物h 。的产生与膜两侧p h 及电位差间间有着密切联系 1 4 浙江大学硕士学位论文 【4 9 1 。m 。的产生和消失基本与h + 的释放和吸收同步。在产生m 。和泵出w 的同时产生一屯位差，而当m 。消失和h + 被吸收时又较慢地出现第二：个电 位差，其幅度约为前者的四倍。 有关b r 质子泵功能的许多问题仍有待进一步讨论，例如，许多光致反 应的测量结果如何纳入质子转运过程；蛋白骨架和生色团的构像变化如何介 导和调节质子传递；不同条件下，质子泵功能如何作相应的改变等等。可以 预期，随着b r 研究的深入，将能阐明质子转运的分子机理。 三结构与功能的关系 1 视黄醛的结构与b r 的功能 类视紫红质蛋自的生色团都是视黄醛。在b r 的结构和功能关系的研究 中，一个重要方面是视黄醛的结构与b r 最大吸收峰的关系及其对质子泵效 率的影响。 人工合成视黄醛的类似物进行相关实验，实验结果表明： ( a ) o o f i g 8t h e t w o p r e f a b r i c a t e da n a l o g so f r e t i n a l ( 1 ) 在质子泵过程中，视黄醛由全反式一1 3 _ j 顿式的异构化反应是不可缺 少的。如图8 ( a ) 所示之类似物，相当于将视黄醛固定在全反构象，用它取代 1 5 - 浙江大学硕士学位论文 视黄醛导致最大吸收峰变为5 7 6 n m ，光循环和质子泵均消失。( 2 ) 紫罗酮环 对质子泵似乎并不必需。用图8 ( b ) 所示之物取代视黄醛，光照后同样可见到 中间产物m 的形成和伴随的p h 改变 s o l 。( 3 ) 视黄醛的共轭系统稍被破坏立 即严重影响光谱红移效应1 。( 4 ) 除去1 3 位上的甲基导致质子泵效应和二个 正电位差都完全消失1 5 2 i 。 2 b r 的氨基酸组成与质子泵功能 在b r 的结构和功能关系中，另一个重要方面是w 转运通道、参与h 传递的氨基酸残基及h + 的传递方式的研究。 k h o r a n a 实验室通过有选择性地对b r 的氨基酸残基进行化学修饰，或 者采用基因工程技术对b r 进行定点突变，然后测定突变产物的最大吸收峰 及质子泵效率的变化等一系列相关实验f 5 3 】【跏，得到下列结果： 、 当做代换t r p 8 6 ，t r p l 3 7 ，t r p l 8 2 和t r p l 8 9 一p h e ，产生2 0 7 0 n m 的蓝 移。p r 0 1 8 6 一l e u ( 或v a o 和t i l r 8 9 一v a l 产生7 0 n m 蓝移。a s p 8 5 一a s n ，a s p 2 1 2 一g l u 和a r 9 8 2 一c y s ( 或g i n ) 产生3 0 3 5 n m 红移。t y r l 8 5 一p h e 质子泵效 率降为正常的4 0 。a s p 8 5 一a s n 或a s p 9 6 一a s n ，质子泵几乎完全消除。 a s p 2 1 2 一g 1 u ( 或a s h ) 质子泵效率为正常的l o 2 0 。a s p 2 1 2 一a 1 a 导致对 光不稳定，同时质子泵完全消除。这些突变中最引入注意的是a s d 2 1 2 一 g l u ，该取代从化学角度看只是使残基2 1 2 加长了一个c h ，基团，却导致了 显著的光谱红移和质子泵效率下降。它提示我们a s p 2 1 2 在b r 中的位簧和 构象对b r 的功能至关重要。 3 脂类分子与光循环 紫膜中含有2 5 的脂类分子，约1 0 个脂类分子一个b r 单体。在 h a l o b a c t e r i u ms a l i n a r i u m 中，甘油的c 2 和c 3 以醚键和二氢植烷的侧链 ( a r c h e 0 1 ) 相连，c l 则以携带着极性头部基团的众多组分中的某一种，形 成磷脂酰甘油磷酸( p g p ) 、磷脂酰甘油磷酸甲基脂( p g p - m e ) 、磷脂酰甘 浙江大学硕士学位论文 油硫酸脂( p g s ) 或者一个三糖苷硫酸脂( s - t g a 1 ) 。用温和的去污剂处 理去掉部分脂类会影响光循环的动力学。将盐细菌的脂类分子加回去，可 以回复野生型的动力学。没有醚键连接的二氢植烷侧链的磷脂，则b r 光动 力学小受影响m ，提示脂类在维持b r 功能中有特殊作用。 4 b r 质子泵理论模型 人们对b r 的光循环途径一直存在不同的看法。随着b r 研究的进展， 分别提出线性单向的四中间体机制、协同模型、平行模型及分支( 旁路) 模 型等4 种光循环模型。在这些模型中，包括了转运方向的逆转印】、双光予驱 动的转运和同一分子对质子或氯离子的二者选一的转运1 5 8 1 1 5 9 1 。 每个模型都证实b r 中有许多大小可容纳一个或多个水分子的洞穴。在 氢键网络已确定的基础上，需要用允许对水分子进行定位的最高的分辨率， 来区分不同的质子转运机制。转运机制中水分子的作用尽管很久以前就有人 提出过 6 0 l ，但它们的位置大多数埋藏在模型内部，至今不能准确定位。中子 衍射实验已经探测到在胞质和胞外侧有7 1 2 个水分子的存在，其中有4 个 牢固地结合在蛋白结构中1 6 “。 值得注意的一点是，视黄醛受光照后由全反式变为1 3 顺式的异构化过 程辟管足质子泵过程的关键步骤，但是根据理论模型计算，这异构化导致 s c h i f f 碱在b r 中的位移却只有o 3 o 4 r i m 。故现有的b r 模型不足以明确 解释b r 的质子泵等功能。完善模型有待于对b r 的结构和功能有进一步明 确的了解。 毫无疑问，b r 分子是迄今r 解最好的离子转运蛋白，但是它的结构仍未 达到原子分辨率，对应于质子转运活性中心的结构变化尚不清楚。而且，质 子沿着传导途径的运动的时间分辨分析仍未完全阐述，还需要对这个蛋白的 完全结构进行动力学分析，尽管用传统的x 衍射或电子衍射方法确定的蛋 白三维结构模型是静态的，但它可用来对蛋白质结构的动态变化进行解释， 或是对设计有功能的突变体进行解释。 1 7 - 塑坚查兰堡圭堂垡丝兰 四应用 所有有关b r 应用的设想都基于其有如下特性： 1 ) b r 是一个光驱动质子泵； 2 ) b r 体系大约可产生3 0 0 m y 的跨膜电势： 3 ) b r 是一个光敏蛋白； 4 ) b r 的原初光异构化过程极快； 5 ) b r 的吸收光谱和光学特性对周围介质很敏感。 b r 作为光驱动质子泵的应用 b r 作为光驱动质子泵，吸收光能将h + 由胞质中泵向胞质外，把光能转变 成膜两侧的电化学势差而储存备用。嗜盐菌利用产生的电化学驱动如a t p 合 成等各种生命活动。 、 1 ) 将太阳能转变成电能 7 0 年代末和8 0 年代初，对b r 的研究主要集中在：b r 作为光驱动质子 泵可以将太阳能转变成光能和化学能。从原理上看，b r 的光能转换特性有 可能为人类所利用，以便使太阳能转化为电能。光合作用在这个方面本来是 最有希望的，但是人们在用光合色素做成的薄膜体系中，发现其光能转换效 率不理想，仪为0 2 1 ，而b r 体系转换效率比较商，更有发展前途。 b r 的质子泵功能相当稳定，可以数年里保持其色泽和功能，因此可将光 驱动质子泵的跨膜位移运用到人工膜系统的研究中。例如：光照下，含有定 向b r 的薄膜或薄片，作为大面积的质子泵可产生一个正交方向的光感应质 子穿过人工膜t 6 2 1 。已有人将b r 融合到人造脂膜上，此时b r 在膜上有一定取 向，光照时，膜两侧能产生光电位，一般照明条件下，单层膜可以产生 2 0 0 5 0 0 m y 电位差。至今为止，人们已经成功地将多层膜串联起来，得到了 更高的光电位。但目前离实际应用还相差很远。 上述这种系统仅在理想状态，且膜片的体积小、容抗低的情况下成立， 实际情况并非如此。这e h - - _ - 方面的因素所决定。首先是紫膜的定向度，尚未 1 r 浙江大学硕士学位论文 找到合适的方法，使得b r 在膜上有完全一致的取向；其次是找不到合适的 支持体，目前采用的人造脂膜，随时间延长，其机械性能愈来愈差：第三是 质子位移的表面量子效应，一个质子穿过人工膜需要几个光子? 理论l 对单 层的膜片来说，传递一个质子只需要一个光子。但很难保证产生一个高光感 应的质子传递效应并且不发生散射。这也许是由b r 将太阳能转变成电能所 要解决的问题。 假设有一完全取向的b r ，其支持体的机械性能也很理想，则可以估算它 的光能转换效率。实际估算表明，理想条件下，b r 电池的电流密度可达到 1 0 。3 a c m 2 ，以温带地区太阳辐射为1 瓦i c m ：计，支持膜电阻为1 0 5 q c 舻，则此 时光能转换效率至少可达1 。但现在实验室条件下转换效率仅可达0 0 0 1 ， 这表明潜力很大。b r 电池的造价比现用的硅太阳能电池便宜很多，如果用 生物学方法，选育出高产率、高转换效率的菌株，又因嗜盐菌大规模生产时， 成本非常低，这样b r 将有可能成为市场上有竞争力的有机光能转换材料。 不过硅太阳能电池所达到的效率是b r 光电池望尘莫及的，标准太阳能电池 的效率为1 4 ，而b r 的仅为1 1 6 m ， 所以必须提高b r 光电池的效率，台则 b r 光电池难于实用。 2 ) 人工合成a t i ) 【“1 理论上认为：在人工膜系统，b r 可利用膜两侧的质子跨膜势能将a d p 转 换成a t p 。其原理和过程与b r 在嗜盐简体内的相似。具体做法足将a t p 合 成酶嵌入一个双层脂质膜中，由b r 质子泵膜以产生能量来合成a t p 。这里b r 作为质子供体。但这个系统的低效率被产生a