（化学工程专业论文）酶解多肽一级序列分析与反应过程建模及结构变化初探.pdf

中文摘要 蛋白质酶促水解反应是在酶的专一性催化作用下使蛋白质水解生成胨、肽等 低分子量产物的过程。由于蛋白质高级结构复杂、酶作用位点众多，使得酶解过 程具有产物多样性和反应复杂性等特点。本论文在课题组已有研究工作基础上， 利用色谱质谱联用技术以及动态光散射检测方法等多种先进的分析测试手段， 从一级序列分析到动力学过程模拟以及高级结构解析等多层次，对蛋白质酶解过 程进行了较为详细的研究。具体内容如下： 酶解产物反相高效液相色谱( r p ，h p l c ) 分析条件的确定：选取一级序列已知 的牛血清白蛋白( b s a ) 和断裂位点高度专一的胰蛋白酶( t r y p s i n ) 组成模式酶解体 系，确定了反相色谱的紫外检测波长为2 1 4 n m ，流动相为水一乙腈一三氟乙酸 ( t f a ) 。通过研究流动相中水相一有机相的梯度条件、流动相中离子对试剂t f a 含量及流动相流速等因素对分离效果的影响，确定了针对此体系复杂产物分析的 适宜梯度洗脱条件，即流动相中t f a 含量为0 0 8 ，流动相流速为1 0 m l m i n 。 酶解产物液质分析及产物多肽一级序列的确定：采用已确定的反相色谱分析 条件，利用r p h p l c 对b s a - - t r y p s i n 体系酶解全过程中9 个不同水解度下的酶 解产物进行了色谱分析，并应用液质联用( l c e s i m s m s ) 技术对产物多肽序列 进行了解析。通过b i o w o r k s 软件和人工检索比对的方法对所得质谱数掘进行解 析，最终确定出各水解度下不同酶解产物所含的3 3 个多肽的一级序列。 酶解多肽色谱保留行为预测模型的建立：运用最小二乘与岭回归两种算法， 建立了b s a - t r y p s i n 体系产物多肽的反相色谱保留时间预测模型，经相关分析与 残差检验证明：对于酶解多肽，岭回归算法因消除了数据的多重共线性影响，而 使所建模型较最小二乘法拟合效果更佳；且对于不同多肽体系，各种模型之矧的 通用性不强，本文所建模型尤其适于酶解所得多肽的保留时间预测。 水解度值预测模型的建立：酶解过程中，水解条件( 如底物浓度s 、酶浓度 e 、酶解温度t 、酶解p h 值以及酶解时间t 等) 直接影响水解度( d h ) 值的大 小，故其反应机理非常复杂。本文引入神经网络模型的概念，以s 、e 、t 、p h 和t 作为输入，以d h 作为输出，建立了一个由输入层( 5 个神经元) 、两层隐含 层( 分别含4 个神经元和5 个神经元) 和输出层( 5 个神经元) 构成的神经网络模型。 利用大量酶解条件一水解度值数据对模型进行训练和验证，最终建立了较理想的 预测反应过程中水解度值的黑箱模型。 多肽酶解释放动力学模型的建立：根据不同水解度时酶解产物的质谱总离子 流图中各多肽对应的谱峰面积，计算各酶解多肽在水解产物中的相对含量。将多 肽释放过程分为生成阶段和消耗阶段，并选取两类合适的方程形式对酶解过程各 多肽含量的变化进行拟合，建立了各个多肽的酶解释放动力学方程。经初步分析， 得到方程中部分参数的物理意义，为活性多肽的准确、高效制备提供了理论依掘。 酶解过程蛋白质高级结构变化初探：以酪蛋白一胰蛋白酶为例，采用动态光 散射技术，以磷酸盐为缓冲液研究了温度、离子强度和酶解行为对酪蛋白粒子平 均流体力学半径( 冠) 的影响规律。结果表明：尼值在升温过程中发生不可逆减小： 随离子强度增大，届值先减小再增大；酪蛋白在胰蛋白酶作用下，溶液光散射 强度即分子量大小先急剧下降再逐渐趋于平缓，而届值的变化规律与之相反，并 推测了酪蛋白胶体酶解过程的结构变化模型即由原始致密的球状体逐渐舒展为 松散而规则的毛束状蛋白肽链。 关键词：蛋白质，多肽序列，h p l c e s i m s m s ，酶解，神经网络，岭回归 动力学模型 a b s t r a c t e n z y m a t i ch y d r o l y s i so fp r o t e i ni sak i n do fb i o c h e m i c a lp r o c e s st op r o d u c e s m a l lm o l e c u l a rp r o d u c t ss u c ha sp e p t o n e sa n dp e p t i d e s t h i sp r o c e s sh a s t h e c h a r a c t e r ss u c ha sv a r i e t yo fp r o d u c t sa n dc o m p l e x i t yo ft h er e a c t i o n i nt h i st h e s i s ， t h ep r o c e s so fp r o t e i ne n z y m a t i ch y d r o l y s i sh a sb e e nr e s e a r c h e di nd e t a i lb yu s i n g h p l c e s i - m s m sa n dt h ed y n a m i cl i g h ts c a r e r i n g d e t e r m i n a t i o no ft h eh p l ca n a l y s i sc o n d i t i o n s ：t h eh p l cs e p a r a t i o n c o n d i t i o n s ( s u c ha st h ea e e n t o n i t r i l eg r a d i e n tc o n d i t i o na n dt h ec o n t e n to ft h et f a i n t h em o b i l ep h a s e ) w e r eo p t i m i t e af o rb s a - t r y p s i nr e a c t i o ns y s t e m t h em sa n a l y s i so ft h es e q u e n c e sf o rt h eb s at r y p t i ch y d r o l y s i sp e p t i d e s ： t h ec o m p l e xh y d r o l y s a t e sw e r ea n a l y z e db yu s i n gr p h p l c e s i m s m s a c c o r d i n g t ot h em a s ss p e c t r u md a t a , t h es e q u e n c eo ft o t a l3 3p e p t i d e sc o u l db eo b t a i n e db y b i o w o r k ss o f t w a r e p r e d i c t i o nm o d e lo fr e t e n t i o nt i m ef o re n z y m a t i ch y d r o l y s i sp e p t i d e si n r p h p l c ：u s i n gr i d g er e g r e s s i o nm e t h o d ，t h ec h r o m a t o g r a p h i c b e h a v i o r o f h y d r o l y s i sp r o d u c t sw a si n v e s t i g a t e d , a n da na p p r o p r i a t ep r e d i c t i o nm o d e l o f r p h p l cr e t e n t i o nt i m ew a se s t a b l i s h e d c o m p a r e dw i t l ls e v e r a lo t h e rm o d e l s i t d e m o n s t r a t e dt h a tt h em o d e le s t a b l i s h e db yr i d g er e g r e s s i o nw a sm o r es u i t a b l ef o rt h e e n z y m a t i ch y d r o l y s i sp e p t i d e s e s t a b l i s h m e n to fh y d r o l y s i sc o n d i t i o n s h y d r o l y s i sd e g r e em o d e l ：t h e d e g r e eo fh y d r o l y s i si sa f f e c t e db yt h eh y d r o l y s i sc o n d i t i o n ss u c ha sc o n c e n t r a t i o no f s u b s t r a t ea n de n z y m e ，t e m p e r a t u r ea n dp ho ft h er e a c t i o n , a n dt h er e a c t i o nt i m e b a s e do nt h ee x p e r i m e n t a ld a t a a r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r kw a si n t r o d u c e dt 0s i m u l a t e t h ec o m p l e xr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h eh y d r o l y s i sc o n d i t i o n sa n dt h eh y d r o l y s i sd e g r e e e s t a b l i s h m e n to fr e l e a s ek i n e t i cm o d e lf o rt h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i sp e p t i d e s ： b a s e do nt h ee l e t r o s p r a yi o n i z a t i o ni l a s ss p e c t r u m ，t h er e l a t i v ec o n c e n t r a t i o no fe a c h p e p t i d ec o u l d b ec a l c u l a t e d ，a n dt h e nt h ep r o p e re q u a t i o n sw e r es e l e c t e dt om o d e lt h e k i n e t i cb e h a v i o ro fe a c hp e p f i d ed u r i n gt h ew h o l ep r o c e s so ft h er e a c t i o nv i ad a t a f i t t i n g e l e m e n t a r ys t u d i e so fs t r u c t u r a lc h a n g ef o rt h et r y p t i ch y d r o l y s i so fc a s e i n b yd y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n g ：t h es t r u c t u r e o fp r o t e i ni sa s s o c i a t e dw i t l lt h e p h y s i o l o g i cf u n c t i o no fp e p t i d e s i np r e s e n tw o r k ，c a s e i nw a ss e l e c t e da sa l le x a m p l e ， a n dt h ec f f o e t so f t e m p e r a t u r e ，i o n i cs t r e n g t ha n de n z y m a t i ch y d r o l y s i so nt h ea v e r a g e h y d r o d y n a r n i cr a d i u so fc a s e i nm i c e l l e si np h o s p h a t eb u f f e rw e r es t u d i e db yu s i n g d y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n g k e y w o r d s ：b s 气# e p t i d es e q u e n c e ，h p l c e s i - m s m s ，e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ， a r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r k , r i d g er e g r e s s i o n , k i n e t i cm o d e l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得鑫盗盘茎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：纠唏 签字开期：一年，月，同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盘盗盘茎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨盗盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：习踌 导师签名： 签字闩期：”f 年1 月，e l签字同期 刖舌 蛋白质作为人体必须氨基酸的最主要来源，日益受至人们的关注。蛋白质来 源非常丰富，主要包括植物蛋白和动物蛋白。在人体中，蛋白质由于分子量过大， 不易被直接吸收，有2 ，3 的蛋白质是以酶解后的小肽形式被利用。酶解产生多肽 不仅营养价值高、有利于吸收，而且具有极高的保健功能与医用价值，已经发现 许多活性多肽具有免疫调节、自由基清除、矿物质载体、抗癌抑菌、溶栓降压、 安神麻醉等多种生理功能，是极具开发价值的一类生物活性物质，也是蛋白质与 酶工程领域研究的热点之一。 由于蛋白质分子量大，蛋白酶作用位点广，使得产物极其复杂，多肽种类繁 多，而酶解产物的分离分析又是活性多肽准确、高效制备的基础与关键。高效液 相色谱技术因其分析速度快，分离条件温和不易使蛋白变性，分离效率高等特点， 是分析酶解产物的常用方法。其中包括凝胶排阻色谱法( h p s e o 、反相色谱法 ( r p - h p l c ) 、离子交换色谱法( i e c ) 等。不同方法有不同的分离原理，对于混合产 物的分析结果亦不相同，各种色谱的组合应用即多维色谱法，因结合了多种色谱 的分离优点，可更好地实现混合物的分离，是蛋白组学、多肽化学等领域分析分 离的研究热点。 色谱法可实现蛋白质酶解产物的理想分离，而质谱法是对各组分进行分析鉴 定最重要手段。质谱技术中包含多种离子化方法，如电子轰击电离( e i ) 、化学电 离( c i ) 、电喷雾电离( e s i ) 以及基质辅助激光解析电离( m a l d i ) 等，不同电离方法 决定了其应用范围的不同，对于蛋白质酶解体系中，最常用的是e s i 和m a l d i 两种方法。而对于复杂混合物系的分析，常采用液相色谱一质谱联用 ( h p l c m s m s ) 技术，经色谱有效分离后进入质谱进行分子量、一级序列，甚至 高级结构信息的解析，最终确定混合物中的各成分。目前，此方向的研究大多针 对某种特定蛋白的鉴定或是低分子量多肽的测序，而对于酶解反应过程中多分散 性产物( 含高分子量多肽及低分子量小肽) 的全程级序列解析研究极少，而这 又是活性多肽制备和复杂反应过程表征与模拟的基础。 生物大分子酶促转化反应的动力学建模是生化反应过程研究的重要一环，它 可为工业反应器的设计、计算等提供必要的理论依据，并为工业装置与操作条件 的优化提供理论指导。对蛋白酶解过程而言，反应动力学还是评价与筛选蛋白酶 的重要依据之一，它可有效地描述反应过程并预测产物分布，对活性多肽等功能 性目标产物的获取具有重要的理论指导意义。 由于酶解过程具有反应组分多样、反应种类多元、反应网络庞杂，影响因素 繁多等特性，因此动力学模型的建立极其困难。传统的米氏方程及其修正形式描 述的仅是单底物酶促反应过程，适于底物结构、反应过程及产物种类都比较简单 的体系，而蛋白质酶解转化过程中多底物、多产物的特点决定了用一个动力学常 数来描述反应全过程必将产生较大偏差，即使是用水解度来描述宏观酶解反应速 度的快慢及酶解进行的程度，也只是把整个体系作为一个反应来进行研究，不能 表征各个组分反应性质的差异，更不能定量表征目标产物的生成趋势。因此，用 常规的动力学研究方法来处理生物大分子酶解反应这种产物多样性和反应复杂 性的体系将极为困难。 基于以上研究背景，本文从一级序列分析到动力学过程模拟以及高级结构解 析对蛋白质酶解过程进行了多层次的研究，具体内容如下： 1 首先确定复杂酶解产物反相高效液相色谱( i 蹬- t - n l c ) 分析条件，并将反相色 谱一电喷雾质谱联用技术引入牛血清白蛋白一胰蛋白酶水解产物的分析，利用软 件搜索和手工检索相结合的方法，对不同水解度下的酶解产物所含各种多肽序列 进行鉴定，进一步利用水解产物多肽序列和色谱出峰保留时间数据建立酶解多肽 反相色谱保留行为预测模型，为后续动力学模型的建立及反应过程的表征提供理 论依据； 2 根据大量实验数据，通过引入神经网络方法，建立基于酶解条件的水解度值 模型，该模型可用于预测任意一套酶解条件下的水解度值；进一步，利用酶解产 物的质谱总离子流图数据，计算不同多肽在反应全过程中的相对含量，利用这些 数据，并通过特定形式的方程拟合，建立各多肽的酶解释放动力学模型，同时对 方程中部分参数的物理意义进行分析，此部分工作可为活性多肽的高效制备提供 理论参考。 3 利用动态光散射分析法对酪蛋白酶解过程中的高级结构变化进行初步研究。 通过分析不同离子强度、不同溶解温度和酶解行为对酪蛋白粒子平均流体力学半 径( r h ) 和重均分子量的影响规律，推测了相应蛋白质胶粒高级结构的变化规律， 为深入研究酶解机理及其动态行为提供基础。 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 蛋白及蛋白水解多肽国内外研究进展 在当代人的生活里，食品的营养价值和保健价值已经成为人们关注的对象。 蛋白质，作为人体必须氨基酸的主要来源，在人们日常生活中日益重视起来。在 人们的食物组成中，豆制品、蛋类、肉制品比重日益增加。蛋白质在人体内分解 吸收，补充各种人体所需的氨基酸。蛋白质缺乏会导致疲倦无力，学习工作效率 下降，浮肿，胃肠道腺体萎缩，儿童生长迟缓，智力下降，免疫功能下降，甚至 导致贫血、白内障等疾病。对于婴幼儿，蛋白质缺乏严重时会危及生命。 但是，在人体中，一些蛋白质由于分子量过大，不易被吸收，一些蛋白在人 肠胃分泌物作用下会形成凝块。人体吸收到的蛋白质中，1 3 水解为氨基酸的形 式被人体吸收，而另外的2 3 则形成小肽被人体吸收。将蛋白水解为小肽，既利 于吸收，又增强了蛋白的有效利用率。蛋白质水解肽的研究在日本及美国已经商 品化，水解产生的小肽保持自身的活性，具有很高的医用和保健价值，在医药和 食品中都有广泛的应用。所以，蛋白质水解生成多肽已经成为研究的焦点。 蛋白质水解的研究是近代比较热门的方向之一。水解方法有多种：酸水解【l i ， 碱水解1 2 j ，和酶水解f 3 j 等方法。在酸水解与碱水解的过程中，由于水解的是肽键， 跟氨基酸的种类关系不大，所以水解没有专一性。而且酸碱水解的反应环境一般 是强酸或强碱或高温等条件，要求比较苛刻，产物难从体系中分离且环境不友好。 对于食品、药品的加工更是不可取。而生物酶的水解反应具有高效性，剪切位点 专一，反应条件温和( 一般都在常温或稍高于常温的环境下进行) 的特点，是食品、 保健品等行业广泛采用的水解方法。其水解产物主要用于食品增色、增味、增加 营养价值、增强吸收等方面。 1 1 1 水解蛋白的来源研究近况 水解的蛋白质的来源有很多，有植物蛋白和动物蛋白。植物蛋白中以大豆蛋 白的研究最为热门。大豆是我国的主要农产品之一，是营养比较全面的食物源之 一。它含有4 0 蛋白质，2 0 脂肪和1 5 的糖。它的蛋白质含量是标准小麦粉的 3 , - - 4 倍，是大米的2 5 倍，是玉米的4 - - 8 倍f 5 】。大豆蛋白含有人体自身不能合成 的8 种必需氨基酸，比其他谷物蛋白中所含的必需氨基酸含量都高。用水或稀碱 溶液就可以从大豆组织中浸出超过9 0 的大豆蛋白f 6 l 。它的等电点在4 5 左右， 第一章文献综述 一般将浸出液p h 调至4 5 ，蛋白就可大部分沉淀出来，其浸出液中有效成分的 分离也较简单。大豆蛋白分子量分布广泛，8 k 到6 0 0 k 以上的都有分布，不过以 6 0 k - 3 4 0 k 含量最多。大豆蛋白的食用价值非常高，在乳制品、肉类产品、乳槽 等各个领域都有应用。不仅在食用领域大豆蛋白占有重要地位，在动物饲养中， 大豆蛋白也是极其重要的饲料添加剂。大豆中含有3 5 的粗蛋白，经过压榨或浸 提过的豆饼仍含4 2 的粗蛋白。并且其氨基酸含量均衡，成为饲料中常用的蛋白 添加剂。但大豆蛋白的结构复杂，分子量大，在人体中的吸收远不及牛奶鸡蛋等 动物蛋白。并且大豆蛋白中含量最多的部分( 分子量在6 0 k 3 4 0 k 间的蛋白) 其热 力学特性很不稳定，在温度高于7 0 c 条件下就会发生不可逆的变性。这一现象 不利于豆浆等乳制品的制备。但在人们日常生活中常见的豆腐的制备正是利用了 大豆蛋白的这一特性。l i u z h i s h e n 9 1 7 】等人研究了大豆蛋白在制作豆腐过程中的 热力学特性，并得出在制作豆腐过程中采取两步加热法( 即先将豆浆在7 5 加热 5 m i n ，再在9 5 加热5 r a i n ) 得到的豆腐营养价值、持水能力都比传统的一步加热 法提高很多，并且通过扫描电镜看出其结构也比传统制作工艺致密细腻很多。但 由于大豆蛋白中含有多种抗营养因子，在儿章或幼畜体内会造成消化受阻，产生 过敏现象。并且大豆蛋白中含硫氨基酸含量偏低，大分子量单体过多，这些降低 了它的营养价值。近年来，人们通过酶法降解、发酵降解以及基因改造对其进行 处理，以提高大豆蛋白的营养价值。 除了大豆蛋白，小麦蛋白也是植物蛋白研究较热门的一种。在国内，小麦面 粉是人们食物结构中最主要的部分，也是入们摄取蛋白质的主要来源之一。小麦 中蛋白质含量1 3 ，是禾谷类农作物蛋白质含量最高的粮食。主要成分为糖类、 蛋白质、脂肪以及钙、磷、铁、维生素等多种物质。小麦蛋白主要由清蛋白、球 蛋白、醇溶蛋白和麦谷蛋白组成 g l ，其中含有丰富的谷氨酸和谷氨酰胺，是人体 必需的氨基酸，而且还是淋巴细胞和小肠细胞等免疫系统所需的营养成分，具有 防治免疫功能降低和抗疲劳的作用。在食品加工过程中小麦蛋白的弹性延展性起 着食品结构和组织作用，对其成型具有决定作用。与其他蛋白不同，小麦蛋白可 形成面筋，面筋在食品制造过程中起着非常重要的作用，它可以制成各种形状不 同质地的食品。在烘制面包时，面筋是影响面包膨胀的主要因素之一，因此优质 活性面筋成为在糕点制作过程中的改i 蕲u t 9 1 。近年来随着环保意识的增强，可食 性包装膜已成为包装领域研究的热点。而小麦蛋白具有弹性和塑性好价格低等优 点，成为在蛋白膜领域研究的焦点。张美艳f j0 】等人对小麦蛋白膜的成膜机理做了 研究，并确定了一个较为合适的制作工艺条件。在很多肉类食品的制作工程中， 小麦蛋白也被用来作为弹性加强剂。由于小麦蛋白含有很多疏水氨基酸，分子内 部疏水区域较大，限制了它的应用范围1 。通过酶法降解使其释放出分子内部的 第一章文献综述 疏水肽段，增强其营养价值和利用价值。水解小麦蛋白因其氨基酸含量丰富，已 经应用于许多保健品和化妆品添加剂中。 除了植物蛋白，动物蛋白也是水解蛋白的重要来源。酪蛋白作为牛奶中的主 要成分，成为水解动物蛋白中研究的最热门的方向之一。牛奶的成分包括：乳蛋 白质、乳脂肪、乳糖、纤维素、酶以及很多重要的微量元素。现代人越来越提倡 饮用牛奶，它能给人体提供大量必须氨基酸和微量矿物质。乳蛋白包括酪蛋白、 球蛋白、乳清蛋白和多种蛋白酶，其中酪蛋白含量最多。酪蛋白是由i - 酪蛋白、 a s 2 一酪蛋白、8 一酪蛋白、静酪蛋白等多个单体组成。在溶液中，酪蛋白并非己单体 形式存在，而是以多个单体聚集所成的胶束形式存在。蛋白质的空间结构决定其 功能，酪蛋白在溶液中的聚集形态直接影响着人们对牛奶中酪蛋白的吸收，故酪 蛋白的结构一直以来都是研究的热点问题。在早期酪蛋白粒子研究中，认为酪蛋 白为酪蛋白单体镶嵌于牛奶凝胶中所构成的粒子，但d a v i d 1 2 】等人通过研究发 现，酪蛋白并非为凝胶中镶嵌单体粒子的结构，而是由多个单体通过化学和物理 作用力结合起来的坚硬的网状结构。d o u g l a sg 等人【1 3 】通过场发射扫描电镜观测 到了酪蛋白在溶液中的形态：酪蛋白胶束在溶液中并非光滑球状体，并且存在很 多空隙，胶束表现出明显管状结构而并非球状单体构成。但是牛乳蛋白与人乳蛋 白组成不一样，人乳蛋白中含量最多的是易消化吸收的乳清蛋白，人乳中乳清蛋 白与酪蛋白之比为7 0 ：3 0 ，它在霄内形成凝块j m , ，易于吸收。但牛乳蛋白中 乳清蛋白与酪蛋白之比为1 8 ：8 2 ，在胃内形成的凝块儿大，不利于消化吸收。 研究中发现牛乳蛋白在被酶催化降解以后，其水解物的溶解性能大大改变，它在 等电点或三氯乙酸中的氮溶解指数明显增加，说明了牛乳蛋白水解生成了一些低 肽分子，改变了牛乳蛋白的性质，这将有利于人体对酪蛋白的消化吸收；此外近 来还发现酪蛋白水解物中的一些多肽分子具有某些重要的生理作用。因此，系统 的研究酪蛋白的酶促降解，在理论上和实际应用中都具有重要意义。 在动物蛋白中，血蛋白也是人们研究的热点问题。目前对动物血蛋白的酶促 水解研究主要集中在猪血蛋白方面。我国养猪的数量居世界首位，血资源十分可 观，但我国对动物血的利用率很低，每天将大量的废血排掉，既造成营养物白自 流失，又污染环境。而在猪血液里，蛋白含量高达7 4 ，相当于猪肉蛋白含量的 4 倍，鸡蛋蛋白含量的5 倍。在当今动物蛋白资源短缺的情况下，开发利用猪血 蛋白资源具有巨大的意义。猪血蛋白是一种全价优质蛋白，其中含有1 8 种氨基 酸，包括人体自身不能合成的全部必需氨基酸。早在8 0 年代我国科学家就对猪 血蛋白的营养价值作了研究。郑子修等人1 1 4 】在对猪血蛋白粉的营养价值远远高于 众多植物蛋白和部分动物蛋白，并且猪血蛋白粉富含血红素铁，血红素铁可以被 肠道顺利吸收而不受其他食物的影响，是预防儿章及老人缺铁性贫血的保健佳 第一章文献综述 品。猪血中的血浆蛋白，经分解后，有消毒和滑肠作用，能与侵入人体肠道的各 种粉尘、有害金属微粒发生化学反应，并使其排出体外【l5 1 。但由于猪血中含有血 红素，且发出一种特殊的腥味，因此在食品加工中未受到足够的重视。而用酶法 处理猪血，辅以活性碳脱色，可以达到脱色除腥的目的，得到的产品易被人体吸 收，可作为食品添加剂【1 4 “j 。牛血蛋白是另一重要的动物血蛋白来源，其中包括 血清蛋白、血红蛋白、纤维蛋白原等。以其为原料获得的牛血清白蛋白是一种应 用广泛的重要生化试剂。由于牛血清蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白，在哺乳动 物体内起着重要的存储和运输作用，它能与多种内源和外源性物质结合，经常作 为研究的模型蛋白。牛血红蛋白具有独特的氧结合能力和正常的生理代谢途径， 做为人类血液代替品比其他化合物更为适合。王鹤尧等人田l 研究了水性两相系统 大规模提取牛血红蛋白的工艺，有效的避免了提取过程中细胞碎片等其他杂质的 残留，为血液代替品的研究进一步奠定了基础。并目前国外已有用牛血蛋白为原 料水解制备活性肽的报道，其产品广泛应用于婴幼儿乳品，保健和功能食品。有 报道说添加牛血蛋白活性肽于肉制品中可以改善其组织状态和提高风味。 1 1 2 蛋白水解生成活性多肽的研究进展 1 1 2 1 蛋白质水解方法及蛋白水解酶 一些低分子量的肽化合物是有效的生物活性物质，在植物生长调节剂、水果 保鲜剂、抗肿瘤药物等方面都有重要的应用，是分子细胞学、临床医学、动物实 验学、营养及药物化学中相当有吸引力的研究领域。在食品领域，多肽可用作功 能食品、健康食品，也可作为非过敏性食品用作食品添加剂，可起n t l i i 好的改良 口感和性能的作用。在一些保健食品中添加，还可起到预防疾病的作用。 多肽般出氨基酸合成或蛋白水解两种方法生成。氨基酸合成多肽，产品含 量单一，纯度高。但由于合成条件较苛刻，合成过程有很多有机物加入，合成成 本昂贵，并且合成过程污染严重。蛋白中含有丰富的多肽片段，很多多肽可以通 过蛋白水解的方法制得。蛋白水解的方法有多种：酸水解，碱水解和酶水解等方 法。酸水解和碱水解的方法由于其水解位点不专一，不利于所需多肽片段的生成。 但由于其成本低廉，工艺要求不高，故在一些领域仍有使用。杨叶昆等人【2 3 l 研究 了香烟增香剂中，酸水解酪蛋白条件对梅拉德反应的影响，并确定了一个最佳的 水解条件。酸水解植物蛋白( 如豆粕等) 还可用于酱油的生产。 由于酶具有高效性，专一性与温和性的特点，在蛋白水解中应用最为广泛。 用于水解蛋白的酶统称为蛋白水解酶，它的研究是从胃中消化食物的胃蛋白酶和 胰腺分泌的胰蛋白酶、糜蛋白酶开始的。蛋白酶主要有三个来源渠道：动物蛋白 酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶。动物蛋白酶大都来自动物内脏，通常情况下是 第一章文献综述 以没有活性的酶原状态存在，在生理活动需要时再去掉| j 仃体活化产生活性。这种 酶主要有各种动物的胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、 溶血酶与凝血酶等。胃蛋白酶、胰蛋白酶等多用于医药和保健品中，可治疗消化 性疾病、高血压、抗炎症等方面，胰酶还常用于皮革的处理领域。植物蛋白酶常 见的有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等，这些酶在植物细胞的可溶性 蛋白中占有很大的比例，纯度也相当高。皮革的处理和肉类的软化中常用木瓜蛋 白酶，菠萝蛋白酶常用于啤酒澄清剂和药用消化剂中，无花果蛋白酶常用于杀虫 剂中。微生物蛋白酶大多为微生物发酵产生的胞外酶，这种酶能用工业化大规模 地生产，常用霉菌、细菌、放线菌等发酵生产。不同微生物产生的蛋白酶其性质 和种类很不相同，而且往往是多种酶的混合物，有些菌产生的混合酶几乎可以把 蛋白一直水解到氨基酸。微生物蛋白酶的生产最重要的是控制好氮源的种类，碳 氮比，金属盐类以及培养的p h 值【洲。有些蛋白酶发酵过程添加蛋白质及多肽作 为氮源明显促进酶的生产。 1 1 2 2 蛋白水解生成多肽的研究进展 由于多肽对许多疾病都有很好的治愈功效，故多肽的研究是生物化学领域一 个热门的问题。蛋白是由众多氨基酸构成，它也可以看作一个个的多肽库，水解 蛋白生产多肽因其成本低廉，环境友好，条件温和等众多优点，同益受到人们的 重视。酪蛋白作为人体特别是婴幼儿所需氨基酸的主要来源，倍受人们关注。酪 蛋白作为一个整体没有生物活性，在人体中，它被分解成小的肽才显现出生物活 性。酪蛋白各个单体所含氨基酸都在2 0 0 个左右，氨基酸种类比较平衡，酶解产 生的肽中很多有很高的医用价值，可作用于神经系统、心血管系统、消化系统以 及免疫系统。 在酪蛋白酶解产物中，酪蛋白糖巨肽( c a s e i n g l y e o m a c r o p e p t i d e ，简称c g m p ) 是x 一酪蛋白上的1 0 6 1 6 9 序列肽片段，它不含芳香族氨基酸残基，全部由脂肪 族氨基酸残基构成，在酪蛋白胶束中处于胶束的外缘部位，亲水性较强。由于它 携带有糖链故得名塘巨肽。e 1 s a l a m l 2 5 】等人指出酪蛋白糖巨肽可以用于食品添加 剂，以预防很多肝脏疾病。k e l l e h e r t 2 6 1 等人研究指出c g m p 在促进钙铁锌微量元 素吸收方面也有很强的功效。并且q i a n t 2 7 】等人研究指出，从山羊的* 一酪蛋白中 酶解提取出的肽片段1 0 6 1 7 1 可以减少血液中的凝血酶诱导及胶原诱导产生的血 小板，有效的治疗血栓类疾病。和国内吴疆等人 2 8 捌也对酪蛋白糖巨肽做了大量 的研究，并提出了适合于工业化生产的分离纯化条件。抗高血压多肽作为抑制血 管紧缩酶，治疗高血压的一种药物，早在1 9 8 2 年m a r u y a m a 3 0 】等人就通过胰酶 水解酪蛋白得到了。p i h l a n t o l e p p a l a d l 】等人研究得知酪蛋白经过乳酸菌发酵然后 再加消化酶水解，所得产物可抑制血管紧缩酶。 第一章文献综述 人们都知道，在睡觉前喝杯牛奶可以更快的入睡，而婴儿在吃奶时则表现的 很安静。这些都是神经舒缓肽的作用。酪蛋白中所含的神经舒缓肽于1 9 7 9 年由 b r a n t l 3 2 等人首次发现。神经舒缓肽的结构一般都为n 端是t y r - ，然后是两个相 同的芳香族氨基酸( 如p h e 或t y r - ) 。在以后的几十年里，酪蛋白水解生成神经舒 缓肽的研究不计其数，并从酪蛋白的不同单体中都分离出了神经舒缓肽p 驯m 1 ， 对医药事业的发展起到了指导推动作用。 酪蛋白中的免疫肽和抗菌肽发展比较晚，但由于环境污染等原因，人们对自 身健康愈加关注，这两类肽在保健品和药品中应用前景非常广。j o l l e s l 3 5 1 等人首 次从胰蛋白酶水解人乳酪蛋白产物中发现免疫肽。l a h o v | 3 6 1 等人首次从中性p h 条件下胰凝乳蛋白酶水解酪蛋白的产物中分离纯化出酪蛋白抗菌肽，并发现这种 肽可以抑制葡萄球状菌、八叠球菌、枯草杆菌、肺炎双球菌以及化脓链球菌的生 长。虽然免疫肽和抗菌肽在人体和动物体内的作用机理还没有一个公认的说法， 但这方面的研究在医学上前景广阔。 许多营养肽可以携带钙及其他微量元素被人体有效的吸收。酪蛋白能与多种 微量元素结合( 如钙、锌、铁等) ，是补充身体营养的最佳选择。但是由于牛奶中 的蛋白分子量大( 一般都是多个单体的聚合体，大于8 0 0 0 ) ，而人体小肠能吸收的 氨基酸钙的分子量却必须小于1 5 0 0 。m e i s e lh e ta 1 【3 ”等人通过对不同水解体系 中水解产物的研究表明酪蛋白水解物的持钙性能很好。y e u n g a n d r e wc 1 3 8 1 等人对 酪蛋白水解产物酪蛋白磷酸肽( c p p ) 的持铁离子性能进行了研究，研究表明c p p 对铁离子的螯合能力很强，有利于铁离子在人体中的吸收。国内对c p p 的研究 也很多，齐崴3 9 】【4 0 】等人对酪蛋白酶解制备c p p 的过程进行了研究和优化，并对 其做了动力学模型，很好的指导了c p p 的工业化生产。 植物蛋白中，大豆蛋白的水解肽也是人们研究的热点问题。而且由于蛋白水 解酶的引入是增强大豆蛋白在人体内的吸收，提高它的实际营养价值的有效途 径。h o b s o n , j o l mc 等【4 1 1 做了大豆蛋白水解产物的研究，他们做了大豆蛋白在胰 蛋白酶的水解下产物的分析，并做了小鼠实验，通过对小鼠的体重、血液等样品 的测定证实了大豆蛋白水解物的营养价值比起大豆蛋白要高。大豆蛋白氨基酸含 量丰富，其水解物不仅在营养方面有很高的价值，在医药保健方面也有很高的价 值。k u b a m 【4 2 1 等人通过色谱及氨基酸测序等手段对红曲霉酸性蛋白酶酶解大豆 蛋白的产物进行分析，得知经红曲霉酸性蛋白酶酶解大豆蛋白，可产生4 种血管 紧缩素再生酶的抑制剂，分子量大都分布在5 0 0 d a 以下。并且大豆蛋白经胃蛋 白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶的酶解，其中一种抑制剂的合量有明显提高。血 管紧缩素再生酶抑制剂可用于高血压、血栓等各种疾病的治疗和预防上。由于大 豆成本低廉，而其酶解产物种抑制剂含量和种类又很多，所以大豆酶解肽的研究 第一章文献综述 和应用很有发展前途。 1 2 高效液相色谱技术在生化上的应用研究进展 色谱法是一种最广泛且有效的分离分析方法。色谱这一概念最早是由俄国植 物学家t s w e t t 于1 9 0 3 年提出，经过1 0 0 多年的发展，已经发展了无数种色谱。 按固定相几何形状分可分为平面色谱( 即层析) 和柱色谱，按流动相分可分为气相 色谱、液相色谱以及超临界流体色谱。对于液相色谱，还可有多种分类，按处理 量多少分为毛细管色谱、普通分析色谱、半制备色谱和制备色谱，按流动相与固 定相极性大小可分为正相色谱、反相色谱，按分离机理可分为吸附色谱、离子色 谱、亲和色谱、疏水色谱以及凝胶排阻色谱等等。 气相色谱常用于易挥发、沸点不太高并且化学性质稳定不易分解的化合物的 分析分离中，而液相色谱常用于不易挥发沸点高，并且加热易分解变性的物质的 分析分离上。对于生化产品，多为易分解，性质不稳定，有一定活性的物质，更 适合用液相色谱分析。并且液相色谱有分离产品易回收的优点，更适合于产品的 分离制备。高效液相色谱，又成为高压液相色谱，它的理论塔板数较制备色谱高 许多倍，分离效果也优很多，在复杂混合物的分析中应用广泛。 色谱分离混合物的种类繁多，而凝胶排阻色谱和反相色谱是化学化工及生命 科学领域最常用的色谱分离手段，本文仅就这两种色谱分离方法做详细介绍。 1 2 1 高效液相凝胶排阻色谱( h p s e c ) 的应用研究进展 高效凝胶排阻色谱主要是利用多孔凝胶固定相的独特特性，对物质依据分子 尺寸大小的差异来进行分离的方法。由于凝胶排阻色谱柱中凝胶孔径大小控制精 确，使样品通过时大于某个尺寸的分子都不能进入凝胶孔洞而只能沿凝胶粒子间 的空隙通过色谱柱，它们首先就被分离沈脱出束。而分子越小，经过的凝胶孔越 多，在柱中停留的时间就越长，依据这一原理，使分子量不同的物质得到了有效 的分离。凝胶排阻色谱适于分析水溶液中的多肽、蛋白质、生物酶、多聚核苷酸、 多糖等生物分子。由于凝胶排阻色谱是单靠分子量的大小分离物质的，需要避免 样品在固定相上的吸附作用，故流动相中常加入少量无机盐，如n a c i ，k c i ， n h 4 c l 以及纳、钾、铵的硫酸盐、磷酸盐等。流动相p h 值一般在4 8 之问， 过酸或过碱都会使凝胶填料降解受损。 凝胶排阻色谱虽然已经发展了很久，但现在它在化学、生物学中的应用仍是 不可代替的。h e l m u ts c h l a a d l 4 3 】等人通过编制好的程序，利用传统凝胶排阻色谱 方法直接测量出了接支共聚物的分子量分布，为凝胶排阻色谱与计算机的进一步 第一章文献综述 结合做了很好的铺垫工作。m e y e rm 】等人利用凝胶排阻色谱表征了酸性可溶胶 原质和牛皮胶的分子量分布，并用多角激光光散射技术对凝胶排阻色谱进行了精 确度验证。结果表明凝胶排阻色谱所得的分子量标准曲线与多角激光光散射所测 得的重均分子量一致，在表征物质分子量分布过程中两种方法都可以应用。 虽然现在凝胶排阻应用广泛，但其机理仍未完全研究清楚。t e r a o k ai 4 5 1 等 人对凝胶排阻色谱保留体积的标度做了研究，结果表明，在凝胶排阻色谱中，用 样品分子的流体力学半径对其保留体积进行校准比用回旋半径作校准更准确。流 体力学半径标定的方法还可以快速便捷的从色谱保留体积中推出所测分子的链 结构，这项工作进一步发展了凝胶排阻色谱的分离机理。 1 2 2 高效液相皮相色谱( r p 哪l c ) 的应用研究、 高效液相反相色谱以多孔( 或薄壳) 微粒硅胶为载体，经酸活化处理后与含有 烷基链( c 4 、c 8 、c 1 8 ) 或苯基的硅烷化试剂反应，生成表面具有烷基( 或苯基) 的非 极性固定相。流动相一般采用极性较强的物质，有水、乙腈、甲醇、乙醇、二氯 甲烷等物质。由于反相色谱依掘物质的极性进行分离，故需要消除离子化对物质 出峰的影响。在流动相中添加离子对试剂就是一种很好的消除离子化的方法。常 用的离子对试剂有甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、磷酸、硫酸等等。反相色 谱的分离机理目前有两种理论：分配理论与吸附理论。分配理论认为，极性弱的 有机流动相分子被吸附到非极性固定相表面，样品分子被流动相分子溶剂化。并 与吸附在固定帽上的弱极性溶剂分子进行置换，从而构成样品分子在固定相与流 动相中的分配平衡。而吸附理论则认为样品分子在固定相上以相似相溶原理吸附 与固定相的烷基功能团上，当流动相极性减少至样品分子的极性大小时，样品分 子与流动相间斥力减小，被流动相从固定相上溶下来，从而达到了不同极性样品 分子的分离1 4 6 。 反相色谱的分类也有很多，根据键合烷基链的长短和种类可分为c 4 柱、c 8 柱、c 1 8 柱以及氨基键合柱等，键合的烷基链越长，固定相的疏水性就越强，对 于小分子样品分离效果就越好，但对于疏水性强的大分子，固定相疏水性太强会 导致样品分子在固定帽上的永久吸附，分析结果不准确且污染色谱杠。对于大分 子肽以及蛋白的分离，常用c 4 柱或c 8 柱。根据填料的尺寸不同可以分为5 “m 、 1 0 p 。m 等，在分析柱中，常用5 1 m a 的柱填料，而1 0 p m 填料的色谱柱常用于半制 备柱和制备柱。根据填料孔径可分为9 0a 、 1 0 0 a 、1 2 0a 、3 0 0 a 等等，不同 的公司制备的填料孔径都不同。小孔径填料适合分离小分子有机物、氨基酸等， 对于大分子物质的分析( 如蛋白、蛋白酶解物等)