（遗传学专业论文）以减毒沙门氏菌为载体的口服免疫和基因治疗的初步研究.pdf

1 的：构建制备携带小鼠或人l l 1 2 、g m - c s f 、人c d 基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌口服活菌苗，口服免疫小鼠后，探索肿瘤防治的新道路。，、 方法构建带有p c m v m l l 一1 2 、p c m v m g m c s f 、p c m v h i l 一1 2 、p c m v h g m - c s f 、p l x s n c d 和e g f p n l 真核基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌，口服免疫b a l b c 及c 5 7 b l 6 小鼠，1 0 8 c f u 次，共三次，免疫开始后4 5 周给小鼠腹部皮下接种肿瘤( 1 x 1 0 6 c e l l s ) ，分别接种4 t 1 乳腺癌和l e w i s 肺癌细胞，观察肿瘤生长及小鼠存活情况。应用e l i s a 检测血清中i l 1 2 和g m - c s f 的含量；用荧光显微镜观察小鼠脾脏、肝脏细胞g f p 所发的荧光，用流式细胞仪检测表达g f p的细胞百分比；检测淋巴细胞亚群分类中c d s c d 。比值。结果s l 3 2 6 1 p c m v g f p n l 活菌株口服免疫后，小鼠脾脏、肝脏细胞中可见g f p 有效表达，提示减毒鼠伤寒沙门氏菌所携带的g f p 基因在体内获得表达。s l 3 2 6 1 p c m v m l l - 1 2 、s l 3 2 6 1 p c m v m g m c s f 、s l 3 2 6 1 p c m v i l i l 1 2 、s l 3 2 6 1 p c m v h g m c s f 的重组活菌株口服免疫后，小鼠血清中分别可检测到高水平的i l 1 2 和g m - c s f 。s l 3 2 6 1 c d 组，及其它各组除s l 3 2 6 1 g f p n l 组外，荷瘤小鼠的寿命都显著延长。至少延长5 天以上。57 一鲐论减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服肿瘤疫苗有效。细胞因子重组口服活菌苗对肿瘤有显著的预防作用。自杀基因重组口服活菌苗对肿瘤有治疗作用。一、一、t 本实验为肿瘤的防治提供了新的理论及技术方法。)蒸竺一| l | 点竺一解咏梅以战毒沙门氏茵为栽体的口服免疫和基因治疗的初步研究，2 0 0 0。二a b s t r a c t：7 碍您h a v ec o n s t r u c t e d6l i v eo r a lr e c o m b i n a n ta t t e n u a t e ds a l m o n e l l a巍峨撤* ”ms t r a i n s ，t h e ya r es l 3 2 6 1 p c m v m l - 1 2 、s l 3 2 6 1 p c m v m g m c s f 、s l 3 2 6 1 p c m v h l l - 1 2 、s l 3 2 6 1 p c m v h g m c s f 、s l 3 2 6 1 p l x s n c da n ds l 3 2 6 1 e g f p n l a f t e ro r a li m m u n i z a t i o n 也er e c o m b m a n ts a l m o n e l l as t r a i n sc o l o n i z e dt h ep e y e r sp a t c h e s ，s p l e e n s ，a n dl i a r so fb a l b ca n dc 5 7 b l 6m i c ea n ds t i m u l a t e dh u r n o r a la n dm u c o s a lr e s p o n s e s w cd e t e c t e dh i l 一1 2 、h g m - c s f 、i f n y 、a n dm g m c s fi nt h es e r ao fi m m u n e dm i c e a n di nt h es p l e e n sa n dl i v e r so fs l 3 2 6 1 g f p n li m m u n e dm i c e w ed e t e c t e dg 弛t h em i c et h a th a dc a n c e rs u r v i v e dl o n g e ra f t e rb e i n gi m m u n i z e dw i 出s l 3 2 6 1 p c m v m l l - 1 2 、s l 3 2 6 1 p c m v m g m c s f 、s l 3 2 6 1 p c m v h l i r1 2 、s l 3 2 6 1 p c m v h g m c s f ，a n dw i t hs l 3 2 6 1 p l x s n c df o u o w i n g5 f c 。t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t e 出a ts t y p h i ：m u f i u mc a nb eg o o dl i v e - v e c t o rt op r e v e n ta n dc u r ec a n c e r 解咏梅以减毒沙门氏菌为载体的口服免疫和基因活疗的初步研究，2 0 0 0- 。o ip r e f a c eilj_一：目j吾：l j vh _ i 伤寒沙门氏哥( s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m ) ：鼠伤寒沙门氏菌是一种严重的寄生于消化道的致病菌。减毒的鼠伤寒沙门氏菌是经i 立适当的物理化学或差因工程( 如定点突变，缺失突变) 等方法使沙门氏菌的某些特定的基因发生不可逆的突变。这些突变位点( 不一定是编码致病毒力因子的基因突变而是管家基因的突变) 这类基因的突变损伤了细菌在体内的增殖能力因而其致死性大大降低口服几十甚至上千半数致死量( l d 5 0 ) 的减毒菌都不会致死。由于发生的是不可逆突变，这样的突变株在遗传上一般是稳定的。一沙门氏菌的减毒：早期沙门氏菌的减毒株主要通过紫外光照射和化学诱导的而得到，此种方法得到的沙门氏菌由于突变位点不清且有恢复突变的可能而渐遭淘汰。目前，人们根据沙门氏菌的基因结构，特意地缺失某个或某些基因，从而达到减毒并保持其免疫原性的目的。营养缺陷型菌株是沙门氏菌减毒的一种主要方式。其中a r o 缺陷沙门氏菌是较为常用一种治疗载体。a t o 基因编码控制分支酸合成酶。分支酸是芳香族化合物对氨莶苯甲酸、酪氨酸和色氨酸等合成途径的分支点。一旦a l o 基因缺乏，分支酸无法合成，继而芳香族化合物无法合成，细菌的增殖缺乏物质基础，毒力亦随之丧失。单一或同时缺乏二至三个基因( a r o a 、a r o c 或a r o d ) 的细菌其减毒程度相仿，并均显示出很强的免疫原性。此种减毒株在人、鼠体内( 包括受y 射线以及经其他免疫抑制处理的鼠) 所做的实验证实安全可靠，在其它兽类如牛、羊、猪和家禽身上同样取得良好效果。在a t o 缺乏的疫苗菌株中，c v d 9 0 8 ( d e i r aa r o c 、d e i r aa r o d ) 的应用最为广泛。另外，突变腺氨酸环化酶的c y a 和c a m p 受体蛋白的基因c r p 可以影响包括氨基酸和碳水化合物代谢等一系列功能。在小鼠、猪和禽类中已证明了此类减毒株的安全性和有效性。解咏楫以减毒沙门氏菌为栽体的口服免瘦和基因治疗的初步研究，2 0 0 0最近，人们发现突变沙门氏菌毒力岛2 中的三型分泌系统的纯化效应蛋白基因s s e c 、s s c d 折产牛的新型减毒株在正常与l f n y 缺乏的b a l b c 鼠的实验中，得到较理想的结粜( 5 0 致死菊 1 0 9 细菌) 且比a r o a 减毒株诱导出更强的免疫反应，并能产生特异性c d s + 杀伤性t 淋巴细胞，显示了较好的应用前景。另外，p r o p 基因的突变是沙门氏菌对吞噬细胞的防御索易感且无法在巨噬细胞中生存，这类疫茼已在小鼠和志愿者实验中得到证实。v a n c o t t 等还发现金p h o p突变株可刺激巨噬细胞的功能。控制沙门氏菌对外界渗透压和氧化反应产生适应性的o m p r 和h t r a 基因突变而得到的减毒株亦是蔑好的疫苗载体。目前z h a n g 等将强毒株v k l 和s l 3 2 6 1 缺失c r p 和c d t 基因，减毒株对不鼠安全( 5 0 9 6 致死量) 1 0 9 细菌) 且产生很好的保护性免疫使小鼠免遭1 0 4 倍5 0 致死景的s l 3 2 6 1 野生株的攻击。作者推论突变强毒株可比突变弱毒株产生更好的保护免疫。g a r c i a 最近证实缺失嘌呤甲基化酶基因的沙门氏菌在小鼠中侵袭肠道上皮细胞和m 细胞的能力下降，但仍可在细胞内生存繁殖。经此种减毒株免疫的小鼠可产生对野生株的保护性免疫。l o w 等将沙门氏菌缺失m s b b 基因不仅可避免由t n f a 所介导的败血症性休克且保留了和门氏菌对肿瘤部位的靶向性。在肿瘤部位与正常组织的聚集比为1 0 0 0 1 。以上的减毒株均呈现出良好的应用前景，但其安全性、有效性仍需进步探讨。二、以减毒沙门氏菌为载体的蛋白疫菌的研究现状减毒沙门氏菌活疫苗首先被用于预防伤寒沙门氏菌感染性疾病。后来的研究发现，将外源的来自其它细菌、病毒和寄生虫的基因导入沙门氏菌并得到有效表达后，以口服途径免疫动物，动物血清中可产生针对沙门氏菌和外来抗原的抗体( i 西) ，粘膜表面可形成分泌型i g h 以及特异性t 细胞反应，对该种感染性疾病起到预防作用。此种类型的疫苗应用甚为广泛，已在人、兽、家禽的感染性疾病的预防中起到了不容忽视的作用。近期已有两种不同剂型的t y 2 1 a 伤寒沙门氏菌活疫苗进入商品阶段，这是经三年随访的随机双盲临床实验的结聚。实验显示：液体型制剂比胶囊型制荆有更好的免疫防护能力，研究还发现隔日口服三次的免疫方法可达到最佳的预防伤寒热的效果。艾滋病对人类健康的威胁目益受到全球医学人士的关注，发展艾滋病疫苗也是研究艾滋病治疗的一个重要方向。w u 等将个无胞内区的h i v l 病毒的包解咏梅以减毒沙门氏菌为载体的口服免疫和基因治疗的柳步研咒，2 0 0 0_ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ - _ - _ _ 一膜基因在沙门氏菌载体巾进行分泌型表达，此类疫苗只需单次免疫就可在1 4 天产生g p l 2 0 特异性的t 细胞增殖反应，并在肠道内产生分泌型i g a 抗体。幽上螺杆菌与急慢性胃炎、胃溃疡、胃腺瘤等疾病密切幸目笑。世界上约5 0 的入口从儿童期即感染幽门螺杆菌。将霍乱毒祟与幽门螺杆菌尿素酶b 亚单位相连后在沙门氏菌中表达，以此种疫苗免疫的b a l b c 小鼠可产+ 生粘膜和体液抗体反应同时抵御i 型和i i 型幽门螺杆菌的侵袭。此种方法价廉、安全、有效，为预防和治疗人类的同门螺杆菌感染性疾病提供借鉴。以上谈到的复合型表达疫苗均为组成型疫苗，由于外源基因的质粒的存在，且一旦进入体内则很快产生基因分开现象。基于此种缺憾，人们提出以体内诱导表达型疫苗替代组成型疫苗。h o h m a n 将外源碱性磷酸化酶克隆至p h o p 一活化基因c 中( p a g e ，此种基因在进入巨噬细胞后才有转录活性) ，以此种方法产生的p a g c 碱性磷酸化酶融合蛋白能引起比表达同样外源蛋白的组成型疫苗更强的体液反应。在不断的研究中发现n i r b 和h t r a 也是很强的体内诱导表达型启动子。r o b e r t s 等发现将破伤风c 片段置于h t r a 肩动予之下，再由减毒沙门氏菌载入小鼠体内，能诱发目前为止所观察到的最强的抗破伤风毒索反应。由此可见体内诱导表达型疫苗前景颇佳。三、以减毒沙门氏菌为载体的d n a 疫苗的优势与研究进展d n a 疫苗已被世界上众多的科学家所研究并取得了极大的进展。编码某抗原或多肽的d n 通过基因枪等方法被直接导入动物的组织或细腮中抗原表达后含激发机体的免疫保护作用从而保护机体免受病毒或细菌的侵害。这种方法衙单。有效。d n a 疫苗相对传统疫苗来讲有以下优点：( 1 ) d n a 可在较长的时间内被检测到，作为抗原储备库持续刺激抗体反应：( 2 ) 质粒中的某些序列可有免疫调节作用，相当于免疫佐剂；( 3 ) 可同时表达多种细胞因子，按理想方向调节免疫反应。但在实际应用中会有许多问题，例如，抗原表达量可能会太少，而达不到免疫保护效果；而且公众会关心d n a 疫苗的安全性。d n a 疫苗会不会整合到染色体上而诱发癌症? 科学家们正致力于研究利用减毒的鼠伤寒沙门氏菌做为裁体携带d n a 疫苗进行免疫并取得了很好的效果。他们的研究思路是：在减毒自9 沙f 氏菌中繁殖质粒并将携带质粒的减毒的沙门氏菌作为口服疫苗。以沙门氏菌为载体的d n a 疫苗将活菌疫苗和d n a 疫苗的优点合二为，变得更灵活更易于调控。6解咏梅以减毒沙门氏茵为载体的口服免疫和基因活疗的柳步研究，2 0 0 0一一以减毒沙门氏菌为载体的免疫原理：该菌由口腔进入体内一般定居于肠粘膜，可缓慢地刺激机体产生免疫应答而达到保护机体抵抗沙门氏菌的攻击。更熏要的是减毒的鼠伤寒沙门氏菌还可以在细胞表面或胞浆中表达外源基因诱导机体产生相皮的特异体液免疫、细胞免疫及局部免疫分泌反应，抵抗携带相应外源蛋白的病原体( 如细菌、病毒、原虫及寄生虫等) 入侵。利用减毒沙门氏菌口服活菌疫苗系统作为基因工程质粒的受体菌这种免疫途径己被广泛的研究并取得了进展，是一种很有前景的防治流行病臼9 手段。最近的研究发现携带d n a 的减毒沙门氏茧能通过胃穿过覆盖子肠壁淋巴结上的m 细胞。在此沙门氏菌进入巨噬细胞和树突细胞( 免疫系统的抗原星递细胞) 减毒沙门氏菌死亡释放出多拷贝的d n a 疫苗。d n a 表达诱发免疫反应。d a r j i 以c m v 为启动子真核表达载体携带李斯菌的溶解素基因，且a r o a缺失的沙门氏茵为载体经口服免疫b a l b c 小鼠可引起强的体人和细胞反应，保护小鼠免受李斯物菌感染。体外实验证实，减毒株能将质粒d n a 引导入宿主的吞噬细胞核中。以绿色荧光蛋白为标记基因的研究发现，外源基因可在抗原递呈细胞上表达，并以此途径诱发免疫反应。肿瘤相关性抗原也往往成为设计疫苗的靶点。p a g l i a 将携带有b 一半乳糖昔酶基因的真核表达载体p c m vb 以口服途径由沙门氏菌带入b a l b c 鼠体内，可对表达有b g a l 鼠纤维腺瘤产生体液和细胞排斥反应。s i z e m o r e 等也用该系统表达了真核载体p c m v 口基因可见利用减毒鼠伤寒沙门菌作为载体表达真核基因是行之有效的。x i a n g 等发现把编码自身免疫的自身抗原g p i 0 0 及t r p 一2 的可被删c i 类分子识别的表位g p l 0 0 ( 2 5 3 3 ) 及t r p 一2 ( 1 8 1 1 8 8 ) 分别克隆于泛紊基因下游构建了真核d n a 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，口服免疫后小鼠可打破对黑色素瘤自身抗原的t 细胞免疫耐受。通过粗c i 类分子限制的c d 8 + t细胞分泌t h l 细胞因子i f n y 及诱导肿瘤排斥及增殖。解咏梅以域毒沙门氏茸为我体的口服免疫和基因活疗的初步研咒，2 0 0 0_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ w - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - 一四利用沙门氏菌进行口服基因治疗一一基因治疗的新途径细菌作为基因转移的载体很少基因工程沙门氏菌具有转运裁体应具有的可取特性。沙门氏菌作为抗癌载体，有几个潜在的优点：可以在需氧和厌氧条件下生长，如实体瘤内；可表达特殊的体系使之能侵染至上皮细胞和巨噬细胞并在其中存活；而对于肠细菌已积累了大最的知识和遗传学资料。耶鲁医学院的m p a w e l e k 等人曾研究过沙门氏菌从远端接种部位对多发肿瘤的靶向性肿瘤内的选择复制，肿瘤阻滞表达有效基因的能力如，单纯孢疹病毒胸苷激酶( h s v t k ) 他们通过细胞培养和植入小鼠体内的方法研究沙门氏菌对黑色素瘤及其它实体瘤的侵染能力。并找到一个高毒性的野生型沙门氏菌，在体外侵染这些细胞，并能体内靶向到肿瘤细胞并在其中扩增，他们正致力于将此菌株发展为抗肿瘤载体。当野生型沙门氏菌导入黑色素瘤小鼠，尽管作为病原可引起小鼠死亡。但发现肿瘤内麓体水平可超迓1 0 9 g 。减毒后用侵染型的营养缺陷型。肿瘤靶向和扩增现象受到阻碍但病原性有限。用此减毒株菌的富积程度在肿瘤和肝当中比率在2 5 0 ：l 到9 0 0 0 ：l 。当这些营养缺陷型菌接种之患b 1 6 f i o 黑色素瘤的小鼠( c 5 7 8 6 ) 体内能抑制肿瘤生长并便其存活时间超过未受治疗鼠的两倍。他们首先分离到一个突变型与野生型不同的是。它在有氧条件下生长侵染力不被抑制因此在有氧和无氧条件下生长都保持对癌细胞的侵染力。虽然如此，对于用作抗j j 中瘤戴体的病原体，如沙门氏茵必须经过减毒以便他对宿主的潜在危窖减少。前期的工作证实减毒的沙门氏菌可通过营养缺陷突变得到例如那些影响嘌岭合成或芳香氨基酸合成的突变或复合突变。我们推论肿瘤的环境能为营养缺陷型提供必需的养分例如在坏死区或在肿瘤活跃的分裂细胞中。因此营养缺陷型不仅降低了毒性，也可能为选择聚居群和在实体瘤内扩增提供机制。他们构建一携带h s v t k 基因和口一半乳糖苷酶分泌信号的质粒当口一半乳糖苷酶表达时使h s v t k 蛋白转移至周质，将鸟嘌呤的前体磷酸化。但患有黑色素瘤的动物接种了表达h s v t k 的沙门氏菌允许鸟嘌呤介导及有剂量效应地抑制肿瘤生长和延长生命而只接种了细菌的个体没有。结果表明，减毒的沙门氏菌对于遗传上抗肿瘤活性和转移治猪蛋白之癌细胞都是很有用的。有氧条件下侵染性营养缺陷型沙门氏菌，在小鼠中毒性降低但却有明显的肿瘤靶向性和扩增能力。而且此菌株是墨因工程菌能表达效应基因。例解咪梅以减毒沙门氏菌为载体的口服免疫和基因治疗的初步研究，2 0 0 0如编码h s v t k h s v t k 能将药前体g c v 转变成有活性的磷酸化形式，从而在体内有抗肿瘤活性。综上所述，以沙门氏曲为载体的活疫苗其安全性和有效性已以经过定时期的验证，d n a 疫苗正显示h 不可低估的优势。同样，它作为基因治疗的载体，通过口服途径进行基因治疗的前景也非常光明。本实验基于上述认识，试图将g m c s f 、i l - 1 2 细胞因子基因由a r o a 、o r o c 、减毒沙门氏菌导入小鼠体内，研究它们对小鼠可移植肿瘤的预防作用，并在此基础j = 更深一步探讨以沙门氏菌为载体的口服基因治疗肿瘤的可行性。9解咏梅以战毒沙门氏莳为我体的口服免疲和基因治疗的初步研究，2 0 0 0_ 一_ _ 一- ：m a t e r i a l：i材4料i ； 1 ：、li7i_ o( 一) 实验动物：b a l b c ( h 一2 b )c 5 7 b l 6 j ( h 2 d )( 二) 菌株、质粒与细胞系：减毒鼠伤寒沙门氏菌l b s 0 0 0 ：s a l m o n e l l at y p h i m u r i u ml t 21 砷m e t er p s lf l a ae c t ，r + m 。f o ra l lt h r e es y s t e m ss l 3 2 6 1 ：s a l m o n e l l a ( y p h i m u r l u mw a r yh i s g4 6a r o ad e l4 0 7f u s a r i c r e se t cr + m 以上两种菌株均为美国s t o e k e r 教授及何笑松博士所惠赠。e c o l id 哪盯为本室保存菌株。真核表达质粒p c m v m l l 12 ，p c m v m g m - c s f , p c m v h l l 1 2 ，p c m v h g m c s f 由台湾中央研究院杨杨宁荪教授惠赠。e g f p n l 质粒由上海市第一人民医院惠赠。小鼠肿瘤细胞：4 t 1 乳腺癌细胞，l e w i s7 肺癌细胞均由第一人民医院中心实验室惠赠。( 三) 主要仪器：高速冷冻离心机：h i t a c h i2 0 p r - 5 2 d 型台式高速离心机：1 l - 1 6 c 型，上海安亭科学仪器厂恒温摇床：n e wb r u n s w i c ks c i e n t i f 配，e d i s o n ，n j u s a精益水平电泳槽垂直电泳槽真空冷冻干燥器：s v a n t旋涡混合器电击仪解咏棒以战毒沙门氏茵为载体的口腱免疫和基因治疗的初步研究，2 0 0 0一1目口_-n_p_tr”十，h_口，_prrr1_，_tnt，_rf一一冰冻切片机流式细胞仪荧光显微镜凝胶分析仪( 四) 试赉j ：t a q 酶为本实验室生产，d n t p 为b o e h r i n g e rm a m m h e i t r m 产品，d n am a r k e r 、小牛血清、胰蛋白酶为华美产品，m i l 1 2 、h i l 1 2 、r n i f n y 、m g mz s f 、h g m - - c s f 等e l i s a 检测试剂盒购自晶美公司，1 6 4 0 为g i b c o 产品，丙烯酰胺、n ，n7 一亚甲双丙烯酰胺、t e m e d 均为b r l ，l i f et e c h n o l o g i e s ，i n c 产品，蛋白胨购自日本大五营养化学株式会社，酵母提取物购自d i f c 0 公司，其它试剂为国产分析纯或优纯试剂5 一氟胞嘧啶( 5 f c ) 购自美国s i g m a 公司( 五) 常用储备灌及缓冲液：1 ) 3 0 丙烯酰胺单体储备液( 3 0 a c r - b i ss t o c k ) ：1 4 5 克丙烯酰胺，5 克n ，n7 一亚甲双丙烯酰胺溶于3 0 0 m l 预热至3 7 。c 的d d h 2 0 中，溶解后定容至5 0 0 n l l 。2 ) 5 0 x t a e 储存液p h 8 5 ，2 4 2 9 t r i s 碱，5 7 1 m l 冰醋酸，3 7 2 9 n a 2 e d t a 2 h 2 0 。加水溶解定容1 升。1x t a e ( t r i s - 乙酸) ：0 0 4 m o l lt r is 一乙酸，0 0 0 2 m o l le d t a 。3 ) 琼脂糖凝胶加样缓冲液：0 2 5 溴酚兰，4 0 ( w v ) 蔗糖水溶液4 ) 抽提质粒所需溶液：溶液i ：5 0 m m o 忱葡萄糖，2 5 m m o l lt r i sc l ( p h 8 o )溶液l h0 2 m o i ln a o h 1 s d s溶液i i i ：5 m o l l 乙酸钾( 6 0 r a l ) ，冰乙酸( 1 1 5 m 1 ) ，水( 2 8 5 m 1 )解咏梅以战毒沙门氏茵为我体的口服免疫和基因治疗的柳步研咒，2 0 0 0一一一5 ) 组织固定液：1 0 甲醛，2 0 蔗糖b ) e l i s a 检测所需溶液：n p p 底物溶液：3 m m o l lp - 氮苯基磷酸( n p p ，s i g m a ) ，o 0 5 m o l ln a z c 0 3 ，5 0 r r l i l , o l lm g c l 2 4 c 保存- 。包被剂：含0 0 5 n a n ，的p b s ( p b s n ) 。封阻液：硼酸缓冲液中加入o 0 5 ( v v ) t w e e n 2 0 ，i m m o l le d t a ，o 2 5 ( w v ) b s a ，o 0 5 ( w v ) n a n 3 。4 c 保存。洗涤缓冲液：h a n k s 平衡盐溶液( h b s s ) ，1 ( v v ) f b s ( 胎牛血清，5 6 加热灭活6 0 分钟)7 ) 溴化乙锭溶液；1 0 0 0 x 储存液：( o 5 m g m l 溴化乙锭溶液) 5 0 r a g 溴化乙锭溶子1 0 0 m l 水中。1 x 工作液：0 5pg m l 溴化乙锭溶液。8 ) 从动物组织中提取d l n a 所需溶液：消化缓冲液：1 0 0 m m o l ln a c i ，1 0m m o l l i r i sc 1 0 h 8 o ) ，2 5m m o l le d t a ( p h 8 o ) ，0 5 ( w v ) s d s ，0 t m g r a l 蛋白酶k ( 蛋白酶k 不稳定，使用前临时加入)t e 缓冲液：( p h 8 0 ) 1 0m m o l lt r i sc i ( p h 8 0 ) ，l m m o l f le d t a ( p h 8 09 ) p c r 缓冲液，1 0 x ：5 0 0m m o l lk c i ，3 0m m o l ld t t , 1 0 0m m o l lt r i sc l ( p h 8 8 ) ，l m g m lb s a ，1 5 m m o l lm g c l 21 0 )磷酸缓冲液( p b s ) ：1 0x 储存液1 0 0 0 m l ：8 0 9 n a c l ，2 9k c l ，1 1 5 9n a z h p 0 4 7 h 2 0 ，2 9k h 2 p 0 , ，lx 工作液：约p h 7 3 ，1 3 7 m m o i ln a c l ，2 。7 m m o l lk c l ，4 3 m m o l ln a 2 h p 0 4 7 h 2 0 ，1 4 m m o l lk h 2 p 0 4( 六) 培养基：1 ) l b 培养基：固体和液体，培养大肠杆菌和沙门氏菌用蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，氯化钠1 0 9 ，加水溶解，用氢氧化钠调p h 至7 0 ，定容至1 0 0 0 m l ，1 5 磅灭菌1 5 分钟。固体l b 则加入l s e d l的琼脂粉。解咏梅以战毒沙门氏茵为载体的口服免疫和基因活疗的初步研究2 0 0 02 ) 1 6 4 0 完全培养基：p h7 0 7 2r p m i 1 6 4 0 粉l o 4 9 ，n a h c 0 32 9 ，h e p c s2 2 9 ，加三蒸水定容为1 0 0 0 m l 后，o ，0 2 “m 滤膜过滤，加青霉素达1 0 0 单位m l ，灭活小牛血清1 0 ( v v ) 混匀。( 七) p c r 检测所用引物：引物i ：5 c c c a g t a c a t g a c c t t a t g g g g g a g a c t t g g a a a t c c c c g t 3 ，3解咪梅以战毒沙门氏茵为栽体的口服免疫和基因治疗的初步研究，2 0 0 0m e t h o d实验方法( 一) 携带p c m v m i l - 1 2 、p c m v m g m - c s f 、p c m v h i l 1 2 、p c m v h g m c s f 、p l x s n c d 和e o f p n l 真核表达载体的6 种减毒沙门氏菌s l 3 2 6 1 重组菌株的构建。1 电转化法转化减毒鼠伤寒沙门氏菌l b s 0 0 0 ：挑选沙门氏菌l b 5 0 0 0 菌种于2 m ll b 液体培养基中，3 7 c2 5 0 转分钟振荡过夜。取5 0pl 菌液，接种于5 0 m lb l 液体培养基，3 7 c2 5 0转分钟振荡培养至o d 5 在o 6 o 7 ( 约2 2 5 小时) ，4 。c 、4 0 0 0 r p m离心5 分钟收菌；0 。ct 0 甘油洗涤，4 c 、4 0 0 0 r p m 离心5 分钟，3次；最后悬浮于2 m ll o 甘油中，得到感受态菌株。取2 0 0 pl 感受态细菌液，加入lug 质粒d n a ，( 对照不加d n a ) ，冰浴5 分钟，使d n a 吸附到细菌上，然后移入电击杯中。电转化条件：2 0 0 0 v 电压、2 5uf 电容、2 0 0 q 电阻、放电时间为4 毫秒。电击后加入4 0 0 ull b ，3 7 静止培养2 小时。涂布在含氨苄青霉素或卡那霉素的平板上。2 阳性克隆的挑选：挑取l b ( a m p ) 平板和l b ( k a n ) 平板上生长的转化子，分别接种到2 m l l b ( 加了a m p 或k a n ) 的试管中，3 7 c2 5 0 转分钟振荡培养7 小时。( 菌呈饱和状态o d 6 0 0 约4 ) 。3 质粒抽提碱法抽挺质粒d m 。取1 5 m l 培养液离心2 0 秒，沉淀用1 0 0ul 溶液i 重悬，于室温静置5 分钟。用等量酚：氯仿，等量氯仿各抽提一次。解咏梅以减毒沙门氏菌为戴体的口服免疫和基因活疗的韧步研究2 0 0 0j ：n a - 1 5 0ul 溶液i i i 。在旋涡混合器上振荡2 秒，冰浴5 分钟。加入2 0 0u1 n a o t f s d s 溶液i i 混匀，在冰上放置5 分钟。离心3 分钟，然后吸取0 4 m l 上清液移入干净的微量离心管中，加0 8 1 9 5 乙醇，室温静置2 分钟。室温离心3 分钟，用l m l 7 0 的酒精清洗沉淀，然后真空千燥。沉淀用3 0 ult e 缓冲液重溶，取2 5 5 ul 进行酶切分析鉴定或或p c r鉴定。4 0 8 琼脂糖凝胶电泳检测d 卧，确定正确的阳性克隆。制备凝胶，将电泳缓冲液和电泳级琼脂糖熔化，混匀，冷却至5 5 ，加入溴化乙锭，至浓度0 5ug m 1 倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳。待凝胶凝固后，从制胶平台上，除去封带，拔出梳子，放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约l m m 。用适量的l o x 加样缓冲液制备d n a 样品，然后用移液器将样品加入样品孔中。( 一定要包括合适的d n a 分子量标准物。接通电极，使d n a 向阳极移动，在卜l o v c m 凝胶的电压降下进行电泳。当加样缓冲液中的溴酚兰迁移至足够分离d n a 片段的距离时，关闭电源。在紫外透射仪上观察，拍照。5 电转化法转化减毒鼠伤寒沙门氏菌s l 3 2 6 l ：接种重组菌株，抽提质粒d n a 。电转化法同l 。6 阳性克隆的筛选：同2 - 4 。7 重组菌株的保存：将阳性重组菌株的茁液加同体积的无菌甘油，标记好后，一7 0 c 保存。解咏梅以减毒沙门氏茵为载体的口服免覆和基固治疗的初步研究2 0 0 08 质粒d n a 保存：溶于t e 缓冲液的质粒d n a 可在4 短时问保存，并可于2 0 或一7 0长时间保存。9 小鼠的口服免疫：将含有真核表达载体的s l 3 2 6 1 接种于2 m ll b ( 加a m p 或k a n ) 中振荡过夜，次日取5 “1 加入5 0 m ll b 培养基( 加a m p 或k a n ) ，3 7振荡培养至o d 5 9 0 卸6 ( 约2 2 5 小时) 。离一t b 收集沉淀，p b s 洗涤后，用1 0 n a h c o ，溶解，调整细菌为1 x 1 0 y m l 。将b a l b c 、c 5 7 b l 6各分成8 组，每组7 只。分别将p c m v m i l - 1 2 s l 3 2 6 1 ，p c m v m g m - c s f s l 3 2 6 1 ，p c m v h l l 一1 2 s l 3 2 6 1 ，p c m v h g m -c s f s l 3 2 6 1p c m v m l l 一1 2 + p c m v m g m c s f ，s l 3 2 6 l ，p c m v h i l 一1 2 + p c m v h g m c s f s l 3 2 6 1 ，e g f p n l s l 3 2 6 1 和l o n a h c 0 3 ，各0 i m l 用胃管饲服各组小鼠每两周一次，共三次。l o 小鼠血清的收集：每只小鼠口服免疫前和免疫后每两周眼球放j l i l + 次，收集予0 5 m l e p p e n d o r f 管中，约0 1 m l 。置4 c 冰箱1 2 小时后，1 2 x 1 0 3 转速离心收集上清标记好组别、日期置予2 0 c 存放。冰冻切片的制备：口服免疫四周后e g f p n i 组与空自对照组各取一只小鼠，放舡处死，剖开腹腔取肝脏、脾脏、肾脏和小肠，置于l o 甲醛中固定4 8 小时后放入2 0 蔗糖溶液中处理1 2 小时。进行冰冻切片，切片厚度1 2um 。在荧光显微镜下观察荧光强度并拍照。1 2 用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白在小鼠脾细胞中的表达：口服免疫六周后，e g f p n l 组与空白对照组各取三只小鼠，放血处死，剖开腹腔取脾脏，p b s 清洗三次，4 0 0 目钢网上研磨成单细胞悬液，0 8 5 n 。c 1 溶解红细胞后用p b s 将脾细胞调成1 x 1 0 7 m 1 用流式细胞仪检测。6解咏棒以战毒沙门氏茵为载体的口服免疫和基因活疗的初步研究，2 0 0 01 3 小鼠细胞免疫的检测：e l i s a 试荆盒方法检测各组小鼠不同时间血清。步骤：实验前准备：l 、) 提前2 0 分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。2 ) 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释。3 ) 标准品：将冻干标准品( 1 a ) 用标准晶标本稀释液( 1 b ) 1 o r a l进行复溶，静置1 5 分钟后混匀( 浓度为2 0 0 0 p g m 1 ) 。然后进行倍比稀释( 浓度分别为1 0 0 0 、5 0 0 、1 2 5 、6 2 。5 、3 1 2 5 、0 p g m 1 ) 。复溶未用完标准品子2 0 。c 保存。4 ) 生物素化抗体工作液：以生物素化抗体稀释液稀释生物素化抗体( 1 ：1 0 0 ) 。5 ) 酶结合物工作液：以酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物( 1 ：1 0 0 ) 。操作步骤：1 ) 在己平衡至室温的9 6 孔实验板，除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品( 5 0pl 孔) 加入相应孔中后再加入稀释好的生物素化抗体工作液( 5 0l a1 孔) 。用封板胶纸封住反应孔，室温( 2 0 2 5 ) 共同孵育1 2 0 分钟。2 ) 洗板四次。3 ) 除空白孔外，加入酶结合物工作液( 1 0 0ul 孔) 。封住板孔，室温( 2 0 - 2 5 ) 孵育6 0 分钟。4 ) 洗板四次。5 ) 加入底物a ，b ( 各5 0u l 孔) 。避光室温5 1 5 分钟。6 ) 加入终止液( 5 0ul 孔) ，混匀后即刻测量o d 。，值。1 4 肿瘤细胞的培养：4 t 1 与l e w i s7 细胞均用1 6 4 0 完全培养基培养，培养条件均为：3 7 。c5 n a l t c 0 3 ，5 c 0 2 ，饱和湿度。每三天换液一次。细胞贴壁生长。细胞铺满瓶壁后，用0 2 5 胰酶消化，l ：2 传代。继续培养。解咏梅以战毒沙n 氏茵为我体的口幔免疫和基因活疗的初步研览、2 0 0 0一一_ _ _ 一1 5 肿瘤接种到小鼠体内：每种癌细胞1 0 瓶用0 2 骗胰酶消化后，p b s 清洗，吹打，离心收集细胞，用p b s 调整至1 x 1 0 7 m l 。每只小鼠用o 1 m l ，接种于右侧腋窝皮下。1 6 小鼠组织总d n a 的抽提：小鼠接种肿瘤三周后，每组各取一只，放血处死，剖开腹腔取肝脏、脾脏、肾脏和小肠，用p b s 清洗后，按下述步骤提取组织中总d n a 。1 )切下的组织立即切成小块，置于液氮中冻结。2 )将2 0 0 m g - l g 的组织用预冷的研钵研碎，每l o o m g 组织用1 2 m l消化缓冲液悬浮。3 )将样品在盏紧的管中于5 0 。c 振荡温育1 2 - 1 8 小时。4 )用等量的酚氯仿异戊醇抽提样品，1 2 0 0 转分钟离心1 0 分钟。重复有机抽提，将上层转移到一个新的管子中。5 )加入1 2 体积7 5 m l l 乙醇铵和2 倍体积无水乙醇，1 7 0 0 转分钟离心2 分钟。6 )用7 0 乙醇洗涤，晾干，沉淀用t e 缓冲液重新溶解，使终浓度在l m g m l 。1 7 p c r 检测组织中有无真核表达载体的存在：p c r 反应混合物：l xp c r 缓冲液，0 5 m m o l l 引物i ，0 5 m m o l l 引物i i ，模板d n a ，d d h 2 0 。0 。2 m l o l l4 d n t p ，2 5 ut a q 酶，5 d m s o ，l o 甘油，i p i 旧e d d i - 1 2 0 。p c r 反应条件：9 4 变性5 分钟。扩增循环：9 4 变性3 0 秒，5 5 c 3 0秒，7 2 延长4 5 秒，共进行3 0 个循环。7 2 延长l o 分钟。最后4 保持。2 琼脂糖凝胶电泳检测。1 8 小鼠死亡后，解削并称量脾、肝脏、和肿瘤。解咏梅雌战毒沙门氏茴为戢催的口服免疫和基固治疗的初步研究，2 0 0 0。：r e s u l t sa n dd i s c u s s i o n第部分结果与讨论i l - 1 2 和g w = - c s f 的重组沙门氏菌菌株对小鼠肿瘤的预防作用。i 流式细胞仪检测绿色荧光蛋白在小鼠脾细胞中的表达结果：g r o u pl2345a v e r a g eg f p n l3 5 02 7 32 4 42 2 23 0 l2 7 8 4 - _ 0 5 0s l 3 2 6 l1 1 01 7 41 7 81 7 81 9 61 6 7 o 3 3b l a t l k1 5 21 1 41 7 41 8 61 5 41 5 6 0 2 7t a b l e1 p e r e e n to fc e l l s 恤a th a dg f pi ns p l e e ni nd i f f e r e n tg r o 叩o fp e r o r a ii m m u o a i z e dm i c e 小鼠以s l 3 2 6 1 口服免疫六周后，g f p n i 组免疫小鼠脾细胞中绿色荧光蛋白表达的细胞占总脾细胞百分比值平均为2 7 8 土0 5 0 ，s l 3 2 6 1 ( 未有质粒) 组平均百分比值为l6 7 0 3 3 两者相比有显著差异( n = 4 ，p = o 0 3 2 0 0 5 ) ：完全空白组平均百分比值为i 5 0 2 7 。与g f p n i 组有显著差异( n = 4 ，p = o 0 1 5 0 0 5 ) 。1 9解咏梅以减毒沙门氏茼为载体的口服免麦和基因治疗的初步研究，2 0 0 0一一2 冰冻切片荧光显徼镜观察结果；f i g ! g r pi nt h ec e l l so f m l e e ls p l e e n 3 p c r 检测实验小鼠组织中有无真核表达载体的存在：26 泳道中为不同实验c 5 7 小鼠组织中d n a 的p c r 检测结果，检测有无p c m v 质粒载体。23456| - - - l m舢b p 舢队、参r7 5 0 b p ；、? 05 0 0 b p 1 ，j ir2 5 0 b p j4。、=。“2 5 b p 卜_ 1 4 1 b p丘g2 u s i n gp c rt e c h n o l o g y 协t u ti f t h e r ew e 心p l u m i dv e c t o ri nt h eo r a l l yi m m u n o n i z e dm i c e3w e 曲咯- h ”o r l t 坶l m m u u o u i z e dw i t hs l 3 2 6 1 2 0解咪梅以减毒沙门氏茵为栽体的口服免疫和基因治疗的初步研究，2 0 0 01 ) d n am a r k e rd l 2 0 0 02 、p c m v m i l - l23 、p c m v l l 】l - 1 24 1p c m v h g m - c s f5 、p c m v m g m c s f6 、p c m v g f p n lr i g a u - l a gp e rt e e h a o l o u y 协蛔ii f f l t e w o mp l u m l t lv 柏t o r 砸t h eo r a l l yi m m u a o n l l m 删o 3 w m l u 舶rc h a r g 捌1w i t h n c , e rc e l l s 1 ) d n am a l k m - d l 2 0 0 02 ) p c m v n d l - 1 23 ) p c m v h i l - 1 24 1p c m v h g m - c s f5 1o c m v m g m - c s f6 1p c m v g f p n l结果在各组实验小鼠中都有p c m v 质粒载体检出，p c r 片段为1 4 1 b p 。我们在第一次饲喂小鼠各重组s l 3 2 6 1 三周后就有检出p c m v质粒载体的存在，而在接种肿瘤三周后依然有p c m v 质粒载体检出，说明s l 3 2 6 1 携带的重组质粒能在实验小鼠体内长期存在，质粒所带的外源基因有起作用的可能。解咪梅以减毒沙门氏菌为载体的口服免疫和基因活疗的初步研究2 0 0 0小鼠细胞免疫的检测e l i s a。) 在b a i b c 小鼠血清中检测到h g a _ i - - c s f 情况a1 81 61 4坦 1 086420f i g1 d e t e c t i o no fh g m - c s fi ns e r l io fp e r o r a u yi m m t m i z e db a l b ci n i c e 。h i g hl e v e lo fh g m - c s fw a sd e t e c t e di nt h es l 3 2 6 1 ( p c m v h i l 一1 2 ) + s l 3 2 6 1 ( p c m h g m - c s