（化学工程专业论文）固定化酶柱与固定化菌体柱耦联——高效拆分乙酰dl蛋氨酸.pdf

中文摘要 本文首次将固定化菌体与固定化酶实现了耦联，用于拆分乙酰一d l 一蛋氨酸。 先用固定化菌体在间歇振荡反应器内对乙酰一d l - 蛋氨酸进行初拆分，再用固定 化酶在填充床反应器内进行高效拆分。包括以下内容： 氨基酰化酶固定化载体的筛选。考察了十四种不同型号、性能的弱碱性大孔 树脂固定化酶活，研究发现，d e a e - d h i i i 固定化氨基酰化酶的效果最好，固定 化酶活1 3 5 6 4 1 u g 。研究了不同给酶量下d e a e - d i - i - m 固定化酶活力收率。结 果表明：酶液浓度1 1 5 u g 时，酶活力收率最高。为5 9 4 9 。具体分析了此固定 化酶性质。结果表明，最佳p h 、酶活最高时的反应温度和c 0 2 + 浓度分别为6 5 、 6 5 和5 1 0 - 4 m o l l 。同时考察了固定化酶的稳定性、再生性。在3 7 下，固定 化酶连续拆分乙酰一d l - 蛋氨酸3 0 天，酶活力降为最初的7 2 6 。失活的固定化 酶经洗脱、再生后，酶活达1 3 8 0 6 4 u g ，达到新树脂固定化效果，证明载体再生 性较好。 米曲霉菌体( a s p e r g i l l u so r y z a e 3 0 4 2 ) 的液体培养和固定化研究。选用豆汁 培养基，参照文献规定的培养条件进行培养，经冷冻干燥机干燥后菌体酶活2 0 3 9 u g 。采用甲醛和明胶固定化后的菌体酶活1 7 0 8 6 8 u g ，固定化效率为8 3 7 6 。 研究固定化菌体拆分乙酰一d l - 蛋氨酸的性质。结果表明最佳p h 、酶活最高时的 反应温度和c o ”浓度分别为8 0 、6 5 和5 1 0 4 m o l 【，。， 固定化酶和固定化菌体动力学研究。考察了底物浓度、产物浓度对拆分反应 的影响。研究表明：固定化酶底物抑制浓度o 4 m o l l ，低底物浓度下拆分反应 符合米氏方程，米氏常数k 。为6 1 9 m m o l l ，不存在产物抑制；固定化菌体底物 抑制浓度o 2m o l l ，产物抑制浓度0 0 1m o l l ，低浓度下拆分反应符合米氏方程， 米氏常数k 为7 7 6 m m 0 1 l 。 阃歇振荡反应器和填充床反应器模型建立。得出间歇振荡反应器在指定拆分 率下的反应时间；对填充床模型进行了验证，结果表明，当底物浓度0 2m o l l 时，填充床反应器出口处测得的实验数据与模型求解曲线吻合得很好。 关键词：d e a e d f t ，氨基酰化酶，米曲霉，固定化，耦联拆分，菌球 a b s t r a c t t h ec o u p l e dr e a t o r0 3 s t ra n dp b r lw a su s e dt o o p t i c a l r e s o l u t i o no f n - a c d l - m e t h i o n i n ef o r t h ef i r s tt i m e b s t rw a sf i l l e dw i t hi m m o b i l i z e d a s p e r g i l l u so r y z a ep e l l e t s w h i l ep b r w a sf i l l e dw i t hi m m o b i l i z e da m i n o a c y l a s e t h e f l u i dw a sf i r s tt r e a t e db yi m m o b i l i z e da s p e r g i l l u so r y z a ep e l l e t s ，a n dt h e nt h e e n z y m a t i cd e a c y l a t i o nw a st r e a t e db yi m m o b i l i z e da m i n o a c y l a s ew i t hh i 曲r a t eo f c o n v e r s i o n t h ei m m o b i l i z a t i o no fa m i n o a c y l a s ew a sp e r f o r m e dv i ai o n i ca d s o r p t i o no n t o s e v e r a lk i n d so fw e a k l yb a s i cm a c r o p o r o u sa n i o nr e s i n d i e t h y l a m i n o e t h y ld i v i n y l b e n z e n e ( d e a e d h 一1 1w a gs e l e c t e da st h eb e s ti m m o b i l i z a t i o nc a r r i e r , w h i l et h e s p e c i f i ca c t i v i t yw a gu pt o1 3 5 6 4 1 u g , w h i c hw a sm u c hh i g h e rt h a nt h eo t h e r s 1 1 l e a p p r o p r i a t ec o n c e n t r a t i o no ff r e ee n z y m es o l u t i o ni ni m m o b i l i z a t i o nw a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no ff r e ee n z y m es o l u t i o nw a s 115 u m l ；t h ea c t i v i t yy i e l dw a su pt o5 9 4 9 w h e ni tw a su s e df o rt h eo p t i c a l r e s o l u t i o no fn a c e t y l d l m e t h i o n i n e ，t h e o p t i m a lp h ，t e m p e r a t u r ea n d t h e c o n c e n t r a t i o no fc 0 2 + w e r e6 5 6 5 a n d5 x1 0 4 m o l l m o r e o v e r , t h ee n z y m e s t a b i l i t yw a ss i g n i f i c a n t l yi m p r o v e d t h ei m m o b i l i z e de n z y m em a i n t a i n7 2 6 i n i t i a l a c t i v i t ya f t e r3 0d a y so fc o n t i n u o u so p e r a t i o n a f t e re n z y m ei n a c t i v a t i o n , t h ep r o t e i n c o u l db ef u l l yd e s o r b e df r o mr e s i i l ，a n dt h e nt h er e s i nc a nb er e u s e d ，t h es p e c i f i c a c t i v i t y o fa m i n o a c y l a s ei m m o b i l i z e do nr e g e n e r a t i v ed e a e - d hw a su pt o 1 3 8 0 6 4 u g t h e r e f o r et h i sh a dg o o di n d u s t r i a lp o t e n t i a l i t y a s p e r g i l l u so r y z a ew a sc u l t u r e di nl i q u i dc u l t u r em e d i u m ，t h ee f f e c tf a c t o r s r e f e r r e dt oo t h e r s t h ea c t i v i t yo f 妊e dp e l l e t si sw a su pt o2 0 3 9u g ，w h i l ea f t e rt h e p e l l e ti m m o b i l i z e db yf o r m a l i na n dg e l a t i n , t h ea c t i v i t yo fi tw a s1 7 0 8 6 8 u 慷t h e y i e l do fi m m o b i l i z a t i o nw a s8 3 7 6 v c l e ni tw a su s e df o r t h eo p t i c a lr e s o l u t i o no f n - a c e t y l - d l m e t h i o n i n e ，t h eo p t i m a lp h ，t e m p e r a t u r ea n dt h ec o n c e n t r a t i o no fc 0 2 + w e r e8 0 ，6 5 ca n d5 x 1 0 - 4 m o l l t od e t e r m i n et h ec a t a l y s i sp r o p e r t yo ft h ee n z y m er e a c t i o n , e x p e r i m e n t sw e r e c a r r i e do u t t h e r ew a ss u b s t r a t ei n h i b i t i o n , c o m p e t i t i v ei n h i b i t i o no fi ，m e tf o r i m m o b i l i z e dp e l l e t s ，a n dt h e r ew a ss u b s t r a t ei n h i b i t i o na n dn o n - p r o d u c t i e ni n h i b i t i o n f o ri m m o b i l i z e de n z y m e t h ec o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t ei n h i b i t i o no fi m m o b i l i z e d p e l l e t sa n di m m o b i l i z e de n z y m ew e r eo 2 m o l la n d0 4 m o l l w h e nt h ec o n c e n 仃a t i o n o fs u b t r a t ew a sm u c hl o w a i t h a nt h a to fe a c h , b o t ho ft h e ma g r e e d t o m i c h a e l i s m e n t c ne q u a t i o n n 坨c o n s t a n to fm i c h a e l i s - m e n t e nw a s7 7 6 m m o l la n d 6 1 9 m m 0 1 l f i r s t l y , t h er e s o l u t i o no fn - a c - d l - m e t h i o n i n ew a sc a r r i e do u ti nb a t c hr e a c t o r ；, t h er e a c t i o nt i m eo fs p e c i f i cc o n v e r s a t i o nc a nb ec a l c u l a t e db yt h em o d e lw h i c hw a s p u tf o r w a r di nt h ep a p e r t h e nt h ef i h - t h u r er e s o l u t i o no fe n z y r n a t i o nd e a e y l a t i o nw a s c a r r i e do u ti nc o n t i n u o u sr e a c t o r0 a c k e db e dr e a c t o r ) ao n e - d i m e n s i o na x i a l d i f f u s i o nm o d e lo fr e a c t o rw a sp u tf o r w a r d b a s e do i lt h em o d e l 。t h ep r e d i c tr e s u l t c o i n c i d ew e l lw i t ht h ee x p e r i m e n td a t a k e yw o r d s ：d e a e - d h ，a m i n o a e y l a s e ，a s p e r g i l l u so r y z a e ，i m m o b i l i z a t i o n , c o u p l e dr e a c t o r , r e s o l u t i o n ，p e l l e t s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得：叁鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：葛p 红参 签字日期：加锌，月够e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤垄盘生有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：葛p ，红彦 签字日期：) l j 口5 年1 月谚日 翩躲妇雄 签字日期：扣f 年，月叫。闩 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1l 蛋氨酸的性质及市场分析 蛋氨酸( m e t h i o n i n e ) ，即2 氨基4 甲硫基丁酸( d l - c h 。s c h 2 c h ：c h ( n h ：) c 0 0 h ) 是旋光性化合物，又名甲硫氨酸，分子量1 4 9 2 0 7 ，白色晶体或粉末，熔点2 8 1 ( 分解) ，相对密度1 3 4 0 ，易溶于水、稀碱和稀酸，微溶于乙醇，不溶于乙 醚。从立体结构讲，它有左旋体( l - 型蛋氨酸) 和右旋体( d 型蛋氨酸) i l l 。 l 型蛋氨酸为极微小的六角形薄片结晶体，熔点为2 8 2 2 8 3 ( 分解) 。溶 于水和热稀醇，不溶于无水乙醇、醚、苯、丙酮和石油醚。陋】苫：6 7 8 0 ( 水) ， 【a 】苫：+ 2 2 5 。( 1 m o f l 盐酸) 。d 型蛋氨酸为白色结晶，溶于水、稀酸及碱，极微 溶于醇，不溶于醚1 2 j 。 蛋氨酸最初的商业价值是作为家畜饲料中的营养成分【3 叫。目前全球蛋氨酸 市场由少数几家公司控制，其中n o v u s 、d e g u s s a 、a d i e s s o 公司分别占有3 4 、3 0 和2 8 的市场份额。而亚洲地区蛋氨酸供应紧张，中国作为世界第二大饲料生产 国，对蛋氨酸的需求更高，目前我国主要依靠进口解决需求问题，2 0 0 1 2 0 0 3 年每年进口量均在5 万吨，年以上n 我国开始研究化学法合成蛋氨酸，开始于2 0 世纪5 0 年代。1 9 5 9 年河北制药厂建成了我国第一套合成蛋氨酸生产装置。目前国 内生产厂家有天津蛋氨酸厂、湖南常德洞庭制药厂、上海化学试剂总厂试剂三厂、 广西南宁市有机玻璃厂、天津渤海化工集团天津化工厂、天津市河北制药厂等十 余家，总生产能力约3 0 千吨年，而产量仅为1 0 千吨年。国内蛋氨酸生产装置与 国外相比存在很大的差距【8 1 。随着世界各大生产能力增强，各大公司为争夺全球 市场份额面激烈竞争。在亚洲，d l - 蛋氨酸有时价格不足2 $ k g 9 1 。 近些年，人们更重视蛋氨酸的另一个商用价值。蛋氨酸是一种手性药物，而 且l - 蛋氨酸作为医药级产品的需求量逐年增加。a 1 f 认e s a r 公司2 0 0 3 2 0 0 4 年度的 产品报价：卜蛋氨酸，1 5 4 0 0 5 5 0 0 9 ；d 一蛋氨酸，1 4 8 $ s g 。可见，l - 蛋氨酸 的生产是市场导向的发展趋势 t o l 。目前l 蛋氨酸国内年需4 0 0 5 0 0 吨，价格2 7 2 8 第一章文献综述 万元吨( 医药级) ，而国内年生产不足1 0 0 吨，且有的成本已接近市场价格，因 此，目前的问题是必须改变落后的生产工艺，而采用世界上较为先进的生产工艺 和技术，将各项收率提高，试剂消耗下降，使其成本大幅度下降。 1 2l 蛋氨酸的临床应用 1 9 2 2 年m u e l l e r i 1 从蛋白质中分离出蛋氨酸，1 9 2 8 年b a r 衙和c o y i l e l l2 1 分析了 其结果为i f - 氨基一n 丁酸的t 甲基硫醇衍生物。1 9 3 9 ：l ；l z v i g n e a u d 【l3 】等人从动物营养 学角度研究发现蛋氨酸有转甲基作用。1 9 5 3 年，c a n t o n i 证实了蛋氨酸转甲基是 通过s 腺苷蛋氨酸( s a m ) 甲基化试剂实现的 1 4 1 。腺苷蛋氨酸 ( s a d e n o s y l l m e t i o n i n e ，简称s a m e ) 是存在于各种生物体内的天然物质，主要 作为甲基供体参与各种酶促转甲基过程，并通过转巯基通路，作为合成牛磺酸、 半胱氨酸及谷胱甘肽的前体。防治肝脏疾病：黄疸型病毒性肝炎、药物性肝炎、 妊娠期肝内胆汁淤积症( i c p ) 、酒精性肝病、全肠外营养( t p m ) 并发胆汁瘀积、 肝动脉插管栓塞化疗术( t a e ) 、防治胰腺炎、治疗抑郁症等1 1 ”。 l 广蛋氨酸是人类和其他哺乳动物体内生长和代谢过程所必需的微量元素。人 类的一些遗传疾病，如：胱硫醚尿、高胱氨酸尿都是由于蛋氨酸得不到正常代谢 造成的。胱硫醚尿、商胱氨酸尿通过染色体隐性遗传基因表达。这种遗传病人都 有以下中的一些症状，如：智障、血小板较少、畸形足、骨骼变形、关节脱臼和 听力等问题【1 6 j 。 饮食中缺少蛋氨酸常见的疾病有：血毒症、幼儿风湿、肌肉麻痹、脱发、沮 丧、精神分裂、帕金森症、肝功能衰退等。蛋氨酸在生物体中的作用主要是通过 s 腺菅蛋氨酸( s a m ) 来实现，s a m 能够促使活化甲基和硫基，从而在体内完 成1 0 0 多个反应。有些反应是合成细胞和生物体所必需的化合物的重要步骤。蛋 氨酸是抗脂肪肝药物，通过卵磷脂的生成，减少脂肪的积累。蛋氨酸对生物体吸 收、运送和硒和锌元素利用起着重要的作用。蛋氨酸是重要的螯合试剂，因此有 利于生物体的铬和汞的排泄。对于人类，蛋氨酸可以生成大脑所需的肌氨酸酐， a i d s 病人一般都缺少蛋氨酸。专家认为a i d s 病人在神经系统的退化如：痴呆 症，可能就是由于蛋氨酸的缺乏造成的。初步试验发现蛋氨酸可以治疗帕金森症。 蛋氨酸在人体叶酸代谢中起着重要的作用，当体内缺乏蛋氨酸时，叶酸就会在肝 第一章文献综述 内积聚，形成5 甲基一叶酸，造成短期叶酸缺乏症。维生素b 1 2 缺乏症与叶酸缺 乏症原因相同，从而使得病人出现过敏和贫血症i 6 1 。 l 一蛋氨酸是人类具有广泛应用价值的药物，包括调节体内p h 和电解质平衡、 其他药物的辅助药物、营养药物等其他的应用。它是人类常用的8 0 0 种药物之一。 而d 蛋氨酸和d l - 蛋氨酸不可以在人类体内应用，可能会出现过敏症状。动物 体内，d 型蛋氨酸要经酶转化成l 型蛋氨酸后才能参与蛋白质的合成【1 6 1 。 1 3l 蛋氨酸的生产方法 目前，l 蛋氨酸的合成方法有发酵法、生物拆分法和不对称合成法。 1 3 1 发酵法 谷氨酸的微生物发酵法生产促使人们研究蛋氨酸的发酵法生产，通过发酵法 生产的蛋氨酸为具有生物活性的。蛋氨酸。目前，赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和 组氨酸均实现发酵法工业化生产。然而l 广蛋氨酸发酵法生产中存在微生物的变异 和一些发酵工艺问题，至今没有能够生产出高浓度的蛋氨酸。目前，全球l 广蛋氨 酸的需求量为3 5 0 ，0 0 0 n 屯，主要通过d l - 蛋氨酸的化学消旋法生产。随着l 一蛋氨酸 临床应用的增长，l 广蛋氨酸的生产成为了研究的热点1 1 6 1 。 1 3 r 2 生物拆分法 蛋氨酸化学合成方法有丙烯醛法、氨基内酯法、丙二酸酯法以及固一液相转 移催化法。丙烯醛法具有原材料价格低廉、生产工艺路线短、工艺能耗少及收率 高等特点，被广大生产厂家所采用。世界上蛋氨酸的两大生产商法国的罗纳普朗 克公司和美国的孟山都公司的生产工艺都是以丙烯醛法为模型，稍加改进。选用 化学合成法合成的蛋氨酸均是混旋的氨基酸，需要进行手性拆分【1 】。 工业上拆分蛋氨酸作用的酶是氨基酰化酶或含氨基酰化酶的菌体。人们都先 将氨基酸用醋酸酐乙酰化为乙酰一d l _ 蛋氨酸，利用对酰基有立体选择性的酶拆 分，从而实现l 蛋氨酸的生物法拆分。主要的反应过程如下： 第一章文献综述 r r = c h 3 s c h 2 c h 2 鼍卜。 o 0 + + ， 肿 c h 3 r h a c a c d l 啊e t 图i - i 乙酰d l 蛋氨酸拆分原理 f i g l l t h er e s o l u t i o np r i n c i p l eo f n - a c - d l - m c t 乙酰d l - 蛋氨酸( a c d l m e t ) ，分子量1 9 1 1 4 4 2 ，白色结晶体或结晶粉末， 透过率9 5 ，重金属( p b ) 一 5 , 5 d , t i i i 淡黄色不透明球状颗粒 5 3 5 8 - n h 2 3 3 d 勘正- d 肥 浅黄色不透明球状颗粒 5 3 5 8t n 3 9 d e a e - d h i v深黄色不透明球状颗粒5 3 5 8 n 4 5 d e a e - d h v 乳黄色不透明球状颗粒 5 3 5 8猷 5 2 d e a e d h 黄色不透明球状颗粒5 3 5 8 n 3 6 d e a e d m 黄色不透明球状颗粒5 3 5 8a n 4 2 d e a e ，d h 黄色不透明球状颗粒5 3 5 8 n 3 2 2 2 2 固定化载体的筛选 表2 - 3 载体的基本性能和同定化酶活力比较。 t a b l e 2 3c o m p a r i s o nt h ea c t i v i t yo f i m m o b i l i z e de 1 1 z y n l eo nd i f f e r e n tc a r r i e r 载体名称 骨架 功能基酶活力酶活力收率 a 国( u g )搦 d 3 1 5 聚丙烯酰胺划4 4 3 9 21 9 a 7 d 3 0 1 苯乙烯一二乙烯共聚体 - n ( c h 3 ) 2 2 9 6 ，2 41 2 9 9 3 3 5环氧氯丙烷n h 2 ，烈，卧m ? - n = 00 d 3 8 0 聚苯乙烯 - n h 2 6 1 3 3 62 6 9 0 d 3 9 2 聚苯乙烯 - n h 2 3 8 6 3 41 6 9 4 d e a e d h i二乙烯基苯i n 2 0 9 8o 9 2 d h i r同上 - n h 2 00 d e a e - d h i i i同上斟 1 3 5 6 4 15 9 4 9 d e a e d m 一 同上划8 0 1 83 5 2 d e a e - d i - i - v 同上酬3 0 5 61 3 4 d e a e - d h - v i同上酬 3 3 1 2 41 4 5 3 d e a e - d h v l l 同上 斟 3 7 6 8 61 6 5 3 d e a e - d h - 同上盛 5 5 0 72 4 1 5 8 4 1 2 甲基丙烯酸环氧丙酯n9 8 04 2 9 8 表中的弱碱性阴离子交换树脂均被转化成磷酸型后固定化。 固定化酶活均表示千酶活。 1 9 第二章氨基酰化酶固定化载体的筛选 本文对十四种弱碱性树脂进行了固定化氨基酰化酶的研究，实验结果见表 2 3 。其中d e a e d h i i i 号树脂固定化氨基酰化酶效果最好，其固定化酶效率 5 9 4 9 ，固定化酶活力1 3 5 6 4 1 u g - 1 ，与d e a e s e p h e d a x 固定化酶活力7 0 0 u 9 1 4 6 相比较，酶活得到很大提高。 不同骨架树脂固定化效果不同，其中骨架为二乙烯基苯( d h ) 的树脂固定化 效果较其他结构树脂好。不同功能基树脂固定化效果不同，功能基为伯胺和仲胺 的树脂3 3 5 和d h i i 固定化酶酶活为0 ，可见功能基为叔胺基是树脂固定化酶的 重要因素。功能基为叔胺的树脂固定化酶活有差异，不同型号d e a e d h 其固 定化效果不同，其中8 “1 2 、d e a e d h i 、d e a e d h - 、d e a e d h 、 d e a e d h v i i 、d e a e d h v i 功能基为二乙基氨基乙基，其固定化效果较功能基 为其他的d e a e - d h - i v 、d e a e - d h - v 固定化酶活高。由此可见，叔胺功能基 的种类不同对树脂固定化酶也有定影响。 由此可见，骨架为d h ，功能基为d e a e 的树脂较适合于固定化氮基酰化 酶，然而d e a e d h i 、d e a e d h 、d e a e d m 、d e a e d h 、 d e a e d h 树脂骨架、功能基都相同，而固定化酶活不同，说明树脂具体结构 也是影响树脂固定化酶的另一个因素。 2 1 3 树脂s e m 图片 考察骨架为d h ，功能基为d e a e 的树脂的s e m 结构，选择固定化效果酶 活最低的树脂d e a e - d h i 和固定化酶活最高的d e a e - d h i i i 的电子扫描电镜 照片。 图2 - 1 树脂d e a e - d