（细胞生物学专业论文）条斑紫菜性别差异基因的筛选和初步分析.pdf

条斑紫菜性别差异基因的筛选和初步分析摘要 摘要 紫菜是我国重要的经济海藻，年产值占整个海藻业的2 3 。条斑紫菜为线性发 育模式，雌雄同株。紫红紫菜的性别决定的研究是目前唯一的对紫菜性别决定机 制的研究。为了深入了解紫菜的性别决定机制，掌握紫菜的发育模式，我们首次 对条斑紫菜进行了性别差异基因筛选的抑制性消减杂交实验。 在分离了条斑紫菜的精子囊细胞和营养细胞的样品后，提取总r n a ，作为 t e s t e r 和d r i v e r 。所得的微量r n a 采用s m a r t 的方法进行c d n a 的合成，然后 用黜a i 进行酶切。将t e s t e r 分成两组，分别加上接头1 和接头2 r ，经过两轮消减 实验和两轮p c r ，得到条斑紫菜性别差异的s s h 文库。将该文库进行连接转化， 蓝白斑筛选阳性克隆，再通过菌落p c r 进行二次验证。挑选大小适合的p c r 产物 进行斑点杂交，筛选差异克隆测序。 将测序得到的结果提交n c b i 进行在线分析，结果如下：原始的碱基序列经去 除载体序列、模糊序列及重复序列后得到相应克隆的e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ) 序列，共有1 1 5 个。序列已全部提交n c b i 。登录号为f g 0 0 7 2 8 0 f g 0 0 7 3 9 4 。精 子囊细胞库中特异性的克隆有6 5 个，有5 个与叶绿体基因组序列同源，2 8 个与核 基因组序列同源，1 9 个和m r n a 或c d n a 同源。营养细胞库中特性的克隆有5 0 个，1 1 个与叶绿体基因组序列同源，6 个与核基因组序列同源，1 6 个与m r n a 或 c d n a 同源。精子囊细胞库中和营养细胞库中分别有1 3 个和1 7 个的e s t 序列无 法查到对应的同源序列，可能代表了新基因。 本实验成功构建了条斑紫菜的抑制性消减杂交文库，并分析了精子囊细胞和 营养细胞的差异片段。由于紫菜的性别决定机制研究较少，很多基因的功能还不 明确，对于所做的分析仅能推测某些基因表达的蛋白或是参与的途径可以影响或 决定紫菜的性别发育方式。紫菜性别决定作用的基因还有待于更深入更细致的研 究。本实验为条斑紫菜性别差异基因的研究提供了理论基础，为进一步得到紫菜 性别相关基因，培育全雌全雄株创造了条件。 关键词：条斑紫菜；抑制性消减杂交；性别差异 作者：王丽 指导教师：沈颂东 条斑紫菜性另u 差异基因的筛选和初步分析英文摘要 s c r e e n l n ga n dp r e l l m l n a r va n a l y s l so tg e n c l e r - s p e c l 士l c 一 ， 鐾e n e so tp o r p i y r ay e z o e n s i s a b s t r a c t 凡p 砂朋i so n eo f l ei n l p o r t a n te c o n o m i ca l g a ei nc 1 1 i n aa i l di t so u _ t p u tv a l u ei s t w oo ft ：i l i r d so ft o t a la l g 舱v a l u e 尸d 厂p ，移朔) 旧z d p ，疆括、) v ：1 1 i c hi sb i s e x u a ld e v e l o p sw i ma l i n e a rw a y t h es t u d yo fj ) 删， ，p 口i sm eo n l yr e s e 砌lo fs e xd e t e 册i 彻t i o nm e c h a i l i s m o fp d 伊矗胂t i l ln o w t og a i n 缸m e ru i l d e r s t a l l d i n go fs e xd e t e m i n a t i o nm e c h 越s m 觚dd e v e l o p i n gm o d e lo fn 伊协嘲，w cm a d es u p p r e s s i o ns u b 仃a c t i v eh y b r i d i z a t i o n e x p e r i m e n t si ns o r n es p e c i a l i z e dg e n e s 、) v _ i l i c hr e l a t e dt os e xo f 尸d 7 矽砂懈y 聊p 瑚妇a r e s c r e e n e df o rt l l ef i r s tt i m ei nt l l i ss t u d y w ec x 仃a c t e d 砌妊o fs p 咖a t 觚百u mc e l l s 觚dn u t r i t i o nc e l l so f 尸叩矗y m y 绍d p 珊捃鹳t e s t e l ? a i l dd r i v e rr c s p e c t i v e l ya n d9 0 tt 1 1 ec d n au s i n gt h em e t l l o d0 f s m a r tn ec d n as 锄p l e sd i g e s t e d 诵t l l 黜ai t e s t e r 啪sd i v i d e di m ot w 0 印u p s o n eg r o u p 、 ，船l i g a t e dt 0a d 印t o r1w l l i l e l eo l e rt 0a d a p t o r2 r t 、0r o u i 】d so f s u b t r a l m v ea n dp c rw e9 0 tn l es s hl i b r a 巧o fg e n d e r - s p e c i 矗co f 凡叩匆懒妒扣p 埘捃 a 盘e r 慨s f o m a t i o no fm es s hl i b 哪，w ec h o s e p o s i t i v ec l o n e si i la 、a yo f b l u e 、砌t es p o t ss c r c e n i i l ga i l d 俐f i e da g a i nu s i n gt l l em e 也0 do fc o l o n yp c r f i n a l l y ， w em a d ead 0 tb l o t t i l l go ft l l ep r o p e rp c r p r o d u c t st oc h e c kd i f r e r e n c e sa i l ds e q u e n c e d 1 kr e s u l t so fs e q u e n c i n g 、 桩c h 、e r ea i l a l y z e do nn c b ia r e 舔f 0 1 l o w s ：a f b e r r e m o v i n gs e q u e n c e so fv e c t o r ，如z z ys e q u e n c ea n dr 印e a _ t s 丘o mo r i g i n a ls e q u e n c e s ，w e s u b m i t t e d1 15e s t st 0n c b i ( f g 0 0 7 2 8 0 f g 0 0 7 3 9 4 ) 5c l o n e sa r eh o m o i o g o u st o c l l l o r o p l a s tg e i l o m es e q u e n c e s ，2 8t on u c l e 盯g e i l o m es e q u e n c e sa i l d 19t 0c d n ao r m r n aa m o n g6 5 s p e c i f i cc l o n e si ns p e m a t a i l g i 啪c e l ll i b 删嗲w l l i l e 1 1c l o n e sa r e h o m o l o g o u st oc l l l o r o p l a s tg e i l o m es e q u e n c e s ，6t om l c l e a rg e n o m es e q u e n c e sa i l d16t 0 c d n ao ri i l i 斟a 锄o n g5 0s p e c i f i cc l o n e si nn 嘣t i o nc e l ll i b r a r y n e r ca r e1 3a n d1 7 e s t s 诚c hh a v en oh o m o l o g o u ss e q u e n c e si l ls p e n i l a t a l l g i u mc e ul i b 姗眵a n dn u t r i t i o n c e l ll i b r a r ) ，r e s p e c t i v e l ya 1 1 d 、v ep r e s 啪e dt 1 1 a tt h e ym i g h tr e p r e s e n tn e wg e n e s i i 条斑紫菜性别差异基因的筛选和初步分析英文摘要 i nt l l i ss t u d y ，w ec o n s t m c t e ds s hl i b r a 搿o f 尸d ，p 缈口y e z d e 椰括s u c c e s s f u l l ya n d a i l a l y s i s e dt h ed i f f e r e n c e sb e 帆e e ns p e 肌a t a l l g i u mc e l l sa i l dn u t r i t i o nc e l l s s i n c et l e r e s e a r c h e so fs e x - d e t e m i n i n gm e c h a l l i s m so f 尸d 节协矿口a r ef e wa 1 1 dt h e 如n c t i o n so f m 句耐t ) rg e n e sa r el m k n o w n ，w eo i l l yc o u l ds p e c u l a t et 1 1 a tp r o t e i l l se 1 1 c o d e db ys o m e 舀m e sm a y b ec o u l di i l f l u e n c eo rd e c i d et 1 1 e 、糊【yo fs e xd e v e l o p m e n to f 只d 伊而哆粕t h e r e m u s tb e 允r m e rs t u d yo fm eg e n e sw b j c hp l a yac r i t i c a lr o l ei ns e xd e t e m i n a t i o n w e p r o 访d e dab a s i sr e s e a r c ho fg e n d e rg e n cs t u d yi n 尸d 印缈阳弘z d p 邶括觚dc r e 砷e d c o n d i t i o n st 0g a i ng e n d e rg e n e so f 尸d 憎砂阳t oc u l t i 鹏m o n o s e x u a lp d 巾j 纱口 k e yw o r d s ：p o 嘶胛y 黝e 瑚纽；s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ( s s h ) ； g e n d e r - s p e c i f i c i i i w r i t t e nb yl iw 抽g s u p e n ，i s e db ys o n g d o n gs h e n 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文。 不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏 州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本 声明的法律责任。 研究生签名： 垂蛩 日期：盆竺金：兰：盟 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论 文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论 文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致除在保密期内的 保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的 全部或部分内容论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名： 王舀 日期：立竺趾兰：芳 导师签名：曼叟垄至圭：日期：乙超：芏：塑 条斑紫菜性别差异基因的筛选和初步分析第一章文献综述 第一章文献综述 一、紫菜的生物学性质 1 条斑紫菜的生物学特陛 条斑紫菜( p o 印 炒ay e z d e 珊括) 隶属于红藻门( 砒l o d o p h y p h y t a ) 、原红藻纲 ( p r o t o f l o 谢e o p h y c e ) 、红毛菜目( b a n g i a l e s ) 、红毛菜科( b a i l 西a c e a e ) 、紫菜属 ( 凡伊枷) 。紫菜属的种类繁多，目前已报道的种类约有1 3 0 多种【l 】，我国记录 定名的紫菜物种或变种有2 2 种【2 】。条斑紫菜为北太平洋西部特有的种类，主要分 布于我国黄、渤海和东海北部沿岸，以及日本列岛和朝鲜半岛沿岸，是中、日、 韩三国共同栽培的种类。紫菜是重要的经济海藻，目前全世界的栽培年产值为2 0 亿美元，约占整个海藻产业的2 3 。我国是紫菜栽培生产的重要国家，2 0 0 3 年度的 栽培产量按国际标准计算达1 8 2 亿枚( 每枚为3 9 ) ，其中条斑紫菜2 2 亿枚。 紫菜的藻体可分为叶片、柄和固着器三部分。紫菜叶片的大小常因种类和生 长条件的不同而有定的变异。叶片的形状、颜色、厚度也常因种类、发育阶段、 生长条件、生活环境和季节变化的不同而有所差异。 2 条斑紫菜的生活史 紫菜的生活史具有叶状体( 配子体) 和丝状体( 孢子体) 世代。不同的世代 具有不同的形态构造特性。条斑紫菜为雌雄同株，既可以进行有性生殖，也可形 成单孢子兼行无性生殖。 我国著名的藻类学家曾呈奎、张德瑞【3 】和日本的黑木宗尚几乎在同时分别完成 了紫菜生活史的研究，证实了丝状体阶段的存在，进而，从孢子囊中放出孢子， 并由它萌发成小叶状体。为了与生活史中其它的孢子相区别，曾呈奎、张德瑞【4 】 建议称这种孢子为壳孢子( c o n c h o s p o r e ) 。 综合目前的资料，依据孢子的特点，可将紫菜生活史分为三个主要类型：有 单孢子型生活史、无单孢子型生活史、无壳孢子型生活史。条斑紫菜属于有单孢 子型生活史【2 】。 条斑紫菜( p 烨d p 脚括沈砌) 从幼小叶状体开始，从叶梢部细胞，不断转化 条斑紫菜性别差异基因的筛选和初步分析 第一章文献综述 为单孢子囊，形成、放散单孢子。单孢子为单倍体，所萌发生成的叶状体仍为单 倍体。雌雄同株，精子囊器淡黄色，呈条纹状混夹在深红色的果孢子囊中，整个 生殖器官在叶的末梢端形成明显的深紫色和淡黄色相间的条斑状。丝状体为二倍 体阶段，成熟发生的壳孢子仍为二倍体，壳孢子萌发时经减数分裂形成叶状体， 染色体数目n = 3 ( 图1 ) 【2 1 。 量瓶挚 | 镥露黑飘擎奠 图1 条斑紫菜生活史 关于紫菜属的减数分裂：紫菜属减数分裂的发生与否，发生的部位和时期， 一直是藻类学家关心的话题，这一讨论已延续了8 0 多年。近2 0 年来的一些重要 研究发现基本揭示了紫菜属减数分裂的过程与规律，这对认识紫菜生物的遗传规 律有重要意义。马家海和三浦【5 1 、b u r z y c l l i 等【6 】观察研究证实，减数分裂发生在壳 孢子萌发之时；m aa n dm i u r a 【5 】对条斑紫菜壳孢子核相的观察发现：减数分裂发生 在壳孢子萌发时期。其他作者在研究中观察到同样的结果( b u r z y c k i 【6 】；孙爱淑、 曾呈奎【7 】；b u r z y c k ia j l dw a a l a n d 8 】；o h m ea n dm i u r a 【6 】；t s e n ga 1 1 ds u l l 【9 】；m i t m a na n d v a nd e rm e e r 【1 0 】) 。具体研究结果如下：条斑紫菜的壳孢子囊细胞、壳孢子和单孢 子及其萌发体的核，染色体的形态和数目，都与m 画t a j 、鬼头报道相同，即壳 2 _ 争怠蠢 条斑紫菜性别差异基因的筛选和初步分析第一章文献综述 孢子囊细胞内具一核，有6 条染色体，从丝状体放出的壳孢子9 9 9 为单核，壳孢 子的细胞核可观察到染色颗粒的聚集。b u r z y c l ( i 和w 如l a n d 【1 2 1 在只幻，细的生活史 中也观察到萌发的壳孢子中减数分裂的染色体。孙爱淑和曾呈奎【1 3 1 描述了减数分 裂i i 期：第一次分裂后，经过一个较短的间隔，进行第二次分裂。顶端细胞和假 根细胞各分裂1 次。减数分裂期是一次正常的有丝分裂，但是两个细胞并不一 定同步分裂。 3 紫菜的生殖方式 生物为了繁衍下一代，各自以不同的繁殖方式完成自身的遗传功能。生物的 多样性形成了生殖方式的多样性，主要可以划分为有性生殖和无性生殖两大类， 而单性生殖则是一种特殊的有性生殖方式。无性生殖不经过生殖细胞的结合，由 母体直接产生出新个体。高等植物的无性繁殖比较普遍，而高等动物的无性繁殖 则比较困难。有性生殖经过两性生殖细胞的结合，成为合子，由合子发育成新个 体，因此有性生殖与无性生殖相比具有更大的生活力和变异性。从进化的观点看 生物的生殖方式是由无性生殖向有性生殖的过渡。由于紫菜进化原始、种类多样， 必然表现出生殖对策的多样性，以提高适应环境的能力。紫菜生殖方式的多样性 不仅仅表现在不同的物种采用不同的生殖方式，而且表现在同一物种可以采用多 种生殖方式繁衍后代。 3 1 无性生殖 无性生殖只需要通过一个细胞或者组织进行繁殖，所以其繁殖速度极快，并 且保持了生物体原本的遗传性状，在自然界的选择中可以以数量优势来与之抗衡。 紫菜则是通过营养细胞或者是单孢子完成无性生殖。 近年来紫菜酶法育苗技术的创建使得传统的育苗法从5 6 月缩短到5 天，并在 生产上取得了重大突破，被认为是2 1 世纪的紫菜产业栽培的新方向【1 4 】。 紫菜叶片的边缘细胞可变成单孢子进行无性生殖，叶状体放散单孢子的时间、 藻体大小则因种而异。单孢子的产生对增加个体数量、延长栽培收获期和提高产 量具有重要意义。坛紫菜( p 施f 缸玎e 脚西) 是我国特有的栽培品种，其生活史中 是否存在单孢子，多年来意见不一。近年来有研究报道在坛紫菜上发现单孢子的 存在，并可培养成苗15 1 ，而王素娟掣1 6 1 研究认为坛紫菜幼苗阶段不能产生单孢子。 一般来说，产生单孢子的物种都具单层细胞，且藻体较薄，至今未见有双层或双 色素体的物种能够自然形成单孢子的记录【1 7 - 1 羽。严兴洪等【1 9 】用m n n g 诱变得到两 条斑紫菜性别差异基因的筛选和初步分析 第一章文献综述 个高产单孢子的条斑紫菜( 尸y 韶d p 珊括) 色素突变体，且认为控制产生单孢子的 基因与突变体色素基因是紧密连锁的。唐延林【2 0 】在圆紫菜( p j 幻d 厂6 缸“肠胁) 原 生质体的分离培养中发现细胞团转化成孢子囊，然后放散出其中的孢子，孢子发 育成正常的紫菜叶状体。这种由营养细胞分裂形成数个细胞的孢子囊，所放散的 孢子发育成正常叶状体的发育方式，同样在条斑紫菜和坛紫菜的原生质体培养中 得到证实。无性生殖对丝状体的增殖也发挥了重要作用。蹦g h t 【z 1 】认为，紫菜丝状 体有以下几种无性生殖方式：丝状体可以通过粉碎成小的藻丝段，然后不断大 量增殖；有些紫菜种类的丝状体可以产生丝状体单孢子，萌发成新的丝状体来 进行增殖；部分紫菜的丝状体形成孢子囊枝后，可放散出单孢子进一步萌发形 成丝状体。t 锄g 等【2 2 】在坛紫菜中也发现了同种现象。黑木宗尚等【2 3 1 研究认为，染 色体数目与无性生殖方式有一定的关系，染色体n _ 4 以上的都没有无性生殖，而有 无性生殖的种类皆为n - 3 和n = 2 的紫菜种类。不过由于此方面的研究较少，还不能 得出确切的结论，有待于进一步的研究证实。 3 2 有性生殖 有性生殖是指经过两性生殖细胞雌雄配子的结合产生合子，再发育成新 个体的生殖方式。有性生殖产生的后代具有双亲的遗传特性，在进化过程中产生 了新的基因，提供了广泛的重组机会，有更大的生活力和变异性，从而有利于提 高在变化环境下的生存能力，对生物的进化具有重大意义。紫菜属的有性生殖很 久以前就是藻类学家讨论的话题。b e n h o l d 在1 8 8 2 年首次报：i 首妒e “c d s 咖幻发生有 性生殖，后来许多研究者观察到其它种也存在有性生殖现象【2 4 】。目前认为有性生 殖是紫菜属大多数种类的主要繁殖方式。 紫菜的性别表现依据分类学描述可基本分为：雌雄同株型，如条斑紫菜，其 精母细胞分裂成熟后形成条带状精子囊器区域，镶嵌在果孢子囊群中，成为该种 的鲜明特征；雌雄异株型，如拟线形紫菜( 尸筇p “面砌p 卯洒) 和狭叶紫菜( p 口馏淞幻) ；雌雄同株兼有雌雄异株( 或雌雄异株兼雌雄同株) 类型，如半叶紫菜 华北变种( p 勋幻如fv 识办口朋勿训肠) 和坛紫菜( p 办口f 幼绾凇西) 。这些紫菜的叶 状体除0 0 1 0 1 是雌雄同体外，其余均为雌雄异体，因而杂交对于这种类型 而言极为普遍，从进化角度看，这种生殖方式也是紫菜属中最高级的有性生殖方式。 3 3 单性生殖 陆地植物的单性生殖分为孤雌生殖和孤雄生殖。孤雌生殖是指母体的卵细胞 4 条斑紫菜性别差异基因的筛选和初步分析第一章文献综述 不经过受精或胚囊细胞直接发育成为个体的生殖方式。孤雄生殖是指花粉的精核 尚未与卵核结合时，卵核即退化解体，雄核取代了卵核而发育成具有父本染色体 的胚。孤雄生殖发生概率极低，罕有研究，植物的单性生殖主要是孤雌生殖【2 5 1 。 传统的观点认为，单性生殖失去了基因重组的机会，因而必然难以适应变化的环 境，加上有害基因的暴露，似乎步入了进化的歧途，在生物演化历程中只能短期 存在【2 6 j 。但是，人们发现近5 0 种单性动物不仅没有因失去基因的重组和交换而灭 绝，反而表现出强大的生命力【27 】。在紫菜的单性生殖中是否存在类似现象是值得 关注的问题。国内外对红藻门的单性生殖现象几乎没有报道过。严兴洪【2 8 】等对坛 紫菜的单性生殖的研究表明：由单雌或单雄生殖产生的丝状体，其生长发育正常， 由它们释放的壳孢子发育成形态和颜色很一致的可育正常叶状体，其性别全为单 性，即由单雌生殖产生的丝状体的后代叶状体全部为雌性，而由单雄生殖产生的 丝状体的后代叶状体全部为雄性。 4 紫菜的性别研究 作为分类学的重要依据，雌雄生殖细胞在藻体上的分布状况是紫菜属种类的 特征。在雌雄同株类型中，有的种类分裂为小区域间生或混生，而有的种类雌雄 细胞( 或组织) 分别位于同株藻体的两侧或上下两部分。条斑紫菜精母细胞分裂 成熟后形成条带状精子囊器区域，镶嵌在果孢子囊群中，成为该种的鲜明特征。 然而同为生殖细胞小区域混生的种类，有的则精子囊器区域较小、且较分散，而 少精紫菜( 只d ，f g ( 印p 删口幼彬姗z 融咄) 成熟藻体的外型更像全雌个体，雄性细 胞分裂区域极小，精子囊器区呈很小的点状出现于果孢子囊群中。半叶紫菜藻体 在尚未成熟的时期就可区分出雌雄区域，两性区域之间有明显的界线，分生于藻 体的两侧。雌雄同株的坛紫菜在早期生长阶段难以分辨两性区域，当藻体成熟时， 果孢子囊群和精子囊器常以直线或曲线分别分布于藻体的一定区域上。雌雄异株 的藻体，生殖细胞多沿藻体的前端和两侧边缘形成。今井丈夫对紫菜生殖细胞分 布类型做了一个近似的归纳总结：雌雄异株，即藻株只产生单一生殖细胞而有 雌、雄性别之分；雌雄同株，同一藻体上发生雌、雄生殖细胞，但两性生殖组 织区域分生明显；雌雄同株，两性生殖细胞分裂成小区域混生在一起；雌雄 同株，雄性生殖区域极小或不明显【2 9 1 。 迄今为止，对于紫菜属物种的性别研究主要为描述性的，由于紫菜性别呈现 出多样性，即使对于雌雄异株藻体，研究者也一直尽量避免使用雌配子体和雄配 条斑紫菜性别差异基因的筛选和初步分析第一章文献综述 子体这样的术语。紫菜的性别发生有什么规律，为什么会出现如此多样的性别发 育类型，它们是性决定还是性分化? 随着紫菜减数分裂是发生在壳孢子萌发时期 的新证据的出现1 5 ，3 0 刁1 1 ，遗传学研究者认为性别遗传机制可以阐明这一现象。上世 纪9 0 年代初，加拿大藻类遗传学家v e nd e rm e e r 和他的学生m i t m a n 对一种生长 分布在北美地区的紫菜尸p “仞”愆口开展了性别遗传机制研究分析工作。他们的主 要研究结果包括：只p 坼7 枷阳减数分裂发生在壳孢子萌发之时，被色素突变体标记 的萌发细胞发育历程表明，户p 唧讹口藻体上生成的两性生殖细胞区域起源于壳孢 子最初的分裂细胞，一个细胞仅对应于一种性别的细胞组织区域；pp ”印甜陀口藻体 两性生殖区域分生特征是由减数分裂第一次分裂后，处于项端位置细胞第二次分 裂所作横向分裂所致，即这一雌雄同株型藻体表现出分界明晰的左右性别，是由 早期细胞分裂生长模式所决定；对野外生长和实验培养的藻体所作的性别比例分 析，其结果均符合1 ：1 的分离规律【9 】。这一研究结果说明，月矽z 叩z 胛口的性别发生 受到一对等位基因控制，在壳孢子初始萌发分裂时，性等位基因随减数分裂分离， 表现两性的初始细胞在同一个体上各自分别生长发育，长成雌雄组织的嵌合体， 表现为雌雄同株、两性区域分生的藻体。 关于尸p “印删口性决定的研究，是首次也是至今为止唯一对紫菜性别机制的 研究工作。由于紫菜属海藻在性别发生上的多样性，仅由性决定机制解释显然是 不够的，还有一些重要问题需要进一步研究探索。 ( 1 ) 紫菜性别决定机制与减数分裂发生是否具有必然的联系。在很长一段时 间里，认为紫菜减数分裂发生在壳孢子形成之时或之前。假如，这在紫菜属物种 中是普遍现象的话，那么，产生的壳孢子如果具有两性的性质，就必然萌发成雌、 雄配子体；而壳孢子不具有性别特征，其藻体的性别显然只能是后分化形成的。 显然，对pp “印”理口研究获得的结果不支持这样的假说，新近的细胞学和遗传学 研究进展同样不支持上述假说。根据现有研究资料分析得到的逻辑性结论是：紫 菜属物种的性别类型和决定机制与减数分裂发生时期有关，即使是雌雄异株的种 类，只要减数分裂不发生在壳孢子形成之时或之前，其性别发生及决定机制只能 在同一藻体上，在性别上表现为雌雄异株型、雌雄异株兼雌雄同株( 或雌雄同株 兼雌雄异株) 型以及雌雄同株但两性生殖细胞区域分生型，均属性决定种类。其 性别表现的多样性或差异性与壳孢子萌发时减数分裂细胞生长发育模式有关，而 与发育细胞的性分化机制无关。然而要证实性决定必然与减数分裂发生联系在一 6 条斑紫菜性别差异基因的筛选和初步分析第一章文献综述 起，必须有更多的种类研究验证，而且这不仅需在与pp “伊 陀口具有相似性别特 征的种类中验证，例如半叶紫菜，还特别需在雌雄异株( 包括兼有雌雄同株) 的 种类中研究证明，例如坛紫菜。 ( 2 ) 叶状体生长发育方式是否与性别表现有关。0 1 1 l e 等以条斑紫菜的突变 色素体作为标记，观察其杂交后代叶状体的发生过程，发现色素嵌合体的每一嵌 合块仅与壳孢子减数分裂4 个细胞中的一个相对应。进一步研究证明，当壳孢子 分裂为2 细胞，基部细胞不再分裂时( 相当于其中对应的一个子细胞停止进行减 数分裂第二次分裂) ，这一个体仅长成2 个色块的嵌合体，而此时恰属减数分裂第 一次分裂分离，其萌发个体只能生成一种色型的藻体【9 】。对紫菜四分子分析研究的 结果表明，与基部细胞停止分裂有关的四分子缺失是普遍现象【3 2 3 3 】。在对户 p z 印”阳口性别比例分析中，观察到约有3 6 的藻体为单一性别，m i 仃n 觚等认为这 并不完全是由性等位基因第一次分裂分离产生的，如四分子嵌合体上部细胞中的 一个出现死亡、停止分裂或生长分裂较慢等情况，也是造成单性性别藻体的重要 因素【l l 】。在我国所产紫菜中，华北半叶紫菜在性别表现上与只p 甜仞“陀口很相似， 分类学对其性别描述是，雌雄同株兼少量雄株，但汤晓荣等【3 4 。3 5 】观察到与雄株比 例相似的雌株藻体同样存在；坛紫菜的性别被描述为雌雄异株兼少量雌雄同株， 但在野生和栽培生长群体很难发现雌雄同株藻体，有些学者怀疑它是否应属雌雄 异株种类。 在紫菜属中，与坛紫菜相似的一些种类，其性别表现是有其特殊性的。与条 斑紫菜为代表的种类比较，其叶状体早期生长方式都呈现线性发育特征，性别表 现只有在出现生殖细胞时才被观察到。不同的是，条斑紫菜等两性生殖细胞几乎 同时出现，分裂成小区域间生或混生，主要分布于藻体的前端和周缘部分，在藻 体成熟过程中始终可观察到两性生殖细胞的存在，一般不出现单性表现。而坛紫 菜开始成熟时，先期在藻体前端部位形成的生殖细胞仅表现雌或雄一种性别，随 着藻体的充分成熟，少量藻体可识别出两性生殖细胞同时存在，但两种生殖细胞 不混生，具有明显的性别区域，这样的性别表现特点符合以往对坛紫菜的性别描 述。另一方面，pp 泖讹口表现特征是，早期发育模式具两侧生长性，性别区域主 要由壳孢子减数分裂第二次分裂形成的上端2 细胞发育而来，其雌、雄同株的性 质，是由很高的第二次分裂分离频率( 9 6 4 ) 决定的。虽然同属雌雄性别组织分 生性质，由于pp 甜伊讹口的营养组织可以识别雌雄性别，这样明晰的组织区域标 条斑紫菜性别差异基因的筛选和初步分析第一章文献综述 记使其生长发育特点以及性别决定机制被直观地表现出来，而坛紫菜在藻体营养 生长过程中无组织区域标记可识别，仅以藻体成熟部位的生殖细胞区分藻株性别， 容易在观察中得到雌雄异株的结果。根据现有研究资料分析，紫菜叶状体是四分 子特殊的发育类型，由等位基因决定的性别表现，受减数分裂分离频率、四分子 缺失、发育模式以及生长特点等影响，紫菜性别呈现出的多样性或差异性，更多 的可能与发育模式和生长特点有关。 ( 3 ) 雌雄同株型藻体可能存在不同的性别决定机制。性决定机制可以解释像 户p “甲“陀口这样雌雄组织嵌合的性别类型。但是，另一类群的紫菜种类，例如条斑 紫菜，其藻体只在成熟时期才显示出两性生殖细胞小区域间生的现象。更重要的 证据是，在对条斑紫菜色素突变型嵌合个体生长的观察中，由颜色标记的同一组 织中无一例外地会同时形成两性生殖细胞。显然，这表明条斑紫菜的性别发生与 只p “印“陀口的性决定机制不同，具有性分化的特征。进一步看，即使可能同属性分 化的物种，分化的表现形式也有差异：条斑紫菜两性生殖细胞区域作较有规律的 分布，而少精紫菜雄性细胞区域极小，只在雌性生殖细胞群中作点状分布。生殖 细胞区域的大小，可以由两性生殖母细胞分化的早晚、分裂次数以及生殖细胞的 结构与形状特征决定，但生殖母细胞的形成看来是相同体细胞分裂的结果，性别 分化一定与调控基因的规律变化有关。 ( 4 ) 紫菜的性别机制和染色体数量类型以及是否有无性生殖行为有关。根据 现有紫菜染色体研究资料，可以将紫菜属分为两个主要类群，即n = 3 种类和n _ 5 ( 拟含n 一4 ) 种类。黑木等( 1 9 7 1 ) 对紫菜无性生殖行为的研究结果表明，在他们 所观察的1 8 种紫菜中，有无性生殖的种类皆为n _ 3 染色体类型，而具5 条染色体 的种类( 含n 4 的种类) 一般没有无性生殖行为，即是否具有无性生殖行为与染 色体数量类型密切相关【3 6 】。从已知种类的性质分析，如果是性决定，依据性决定 的理论，紫菜叶状体为嵌合型的个体，那么无性生殖( 单孢子) 将导致紫菜藻体 性别性状的分离。但是，最可能具有性决定的种类，如pp 甜憎伽口、华北半叶紫菜 和坛紫菜等，并没有无性生殖行为，其染色体数目皆为n _ 5 。因此，无性生殖会导 致性别性状的分离的假说无法得到证实。如果是性分化，则单孢子生成的藻体是 壳孢子生成藻体的组织细胞系的延续，它们应显示同源细胞的性别，即无性别性 状分离，例如条斑紫菜等。如果这一分析得到研究证实，这一性别决定机制将成 为分类学研究的重要依据之一。 8 条斑紫菜性别差异基因的筛选和初步分析第一章文献综述 ( 5 ) 探索以基因组学方法研究性别表达及决定机制。一直以来，分类学研究 以生殖细胞在藻体上的分布状况作为主要依据来描述紫菜属种类的性别特征，但 形态学研究方法很难揭示紫菜性别发生的本质与规律。m i t m a i l 等以遗传学方法进 行pp 甜仞甜陀口的性别及其决定机制的研究，首次揭示了紫菜性决定的重要机制及 规律，这是一次很关键研究进步。尽管在实验生态学、细胞学和遗传学等方面还 有很多重要的工作需要进行，但是，从深入认识紫菜性别发生、表达以及决定的 机制与本质这些要求来看，例如性决定与性分化表达基因的差异及功能、性分化 基因调控机制以及性决定中的性别转化问题等，都必须尽快在核酸水平上开展工 作。以基因组学研究方法探寻与紫菜性别相关的差异基因是这方面研究工作的重 要开端之一。 参考文献 【1 】y 0 s l l i d at e ta 1 c a ：t a l o g l l so fs p e c i e so fp d 仞j l y mi nt l l ew o d d ，、析t 1 1s p e c i a lr e f e r e n c e t 0t h et ) ，p el o c a l h ya n db i b l i o g r a p h y 【j 】n a th i s tr e ss p e c i a li s s u e ，19 9 7 ，3 ：5 - 8 2 】张学成，马家海，秦松，等编著海藻遗传学中国农业出版社：北京2 0 0 5 ， 2 0 0 5 ，1 8 5 - 1 8 6 3 】曾呈奎，张德瑞紫菜的研究i 甘紫菜的生活史明植物学报，1 9 5 4 ，3 ( 3 ) ： 2 8 7 3 0 2 4 】曾呈奎，张德瑞紫菜的研究i i 甘紫菜的丝状体阶段及其壳孢子【j 】植物学报， 1 9 5 5 ，4 ( 1 ) ：2 7 - 4 6 5 】马家海，三浦昭雄灭廿匕l j 觳胞子己圣。发芽体l ：扫汁否核分裂。观察 j 】 j a pjp h y c o l ，1 9 8 4 ，3 2 ( 4 ) ：3 7 3 3 7 8 6 】b u r z y c l 【ig 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c o l ，1 9 9 4 ，3 0 ：1 4 7 一1 5 9 【12 】m 远i t as c ”o l o g i c a ls t u d i e so np d 印细阳烨玎s 括7 叠出【j 】b u l lf a cf i s h n a g a s a l 【iu i l i v ，19 6 7 ，2 4 ：5 5 - 6 4 1 3 】孙爱淑，曾呈奎紫菜属的细胞学研究膨大细胞和壳孢子萌发核分裂的观 察【j 海洋与湖沼，1 9 8 7 ，1 8 ( 4 ) ：3 2 8 3 3 2 【1 4 】戴继勋用细胞工程技术发展我国的紫菜养殖业叨生物工程进展，2 0 0 0 ，2 0 ( 6 ) ：3 4 ，8 【1 5 】李世英坛紫菜叶状体形成放散单孢子的初步研究 j 】海洋与湖沼，1 9 8 8 ，1 9 ( 6 ) ：5 9 4 5 9 7 【1 6 】王素娟，马凌波坛紫菜幼苗无性繁殖的再研究 j 】上海水产大学学报，1 9 9 4 ， 3 ( 1 2 ) ：8 1 5 【17 】k o i i u l l 锄p l i 诧l l i s t o r i e so fm o n o s t r o m a t i c 勘伊砂ms p e c i e sa sab 戚s 内r t a x o n o m ya n dc l a s s i f i c a t i o n 【j 】1 mjp h y c o l ，19 9 4 ，2 9 ：6 9 71 【18 】妯西m c o 疵0 n st o 纰s y s t e m a t i c so f b e n t l l i cm 撕n ea l g o ft h en 0 m 1 p a c i f i c j 】k d b ej a p a n e s es o c i e t ) ，o fp h y c o l o g ) r ，19 7 2 ，l6 7 191 【19 】y a l l ，刑n ay ，a m g ay h i 曲m o n o s p o r e - p r o d u c i n gm u t a n t so b t a i n e db y t r e a h i l e n t 砌m n n gi i lp d 印矗妙口妒z d p 凇括阮如( b a n g i a l e s ，r h o d o p h y t a ) 【j 】 h y d r o b i o l o 百a ，2 0 0 4 ，5 1 2 ( 1 3 ) ：1 3 3 - 1 4 0 【2 0 】唐延林紫菜营养细胞和原生质体的分离与培养 j 】山东海洋学院学报，1 9 8 2 ， 1 2 ( 4 ) ：3 7 4 4 【21 】k n i 蛳g a ，n c l s o nw a a ne v a l 吼t i o no fc l 姗c t e r so b 蛐e d 舶ml i f eh i s t 叫 s 砌i e sf o rd i s t i n g u i s h i n gn e w z e a l a i l d 凡，p 枷s p e c i e s j 】ja p p lp h y c o l ，19 9 9 ， 1 1 ：4 1 1 4 1 9 2 2 】t a l l gx ，f c ix d e v e l o p m e mo fs u s p e n d e dc o n c h o c e l i so f 尸d p 砂朋办口妇船p 珊捃 j 】 c h i n0 c e a nl i i n n ，1 9 9 8 ，1 6 ( 4 ) ：3 3 9 3 4 5 1 0 奎斑紫菜性别差异基因的筛选和初步分析 第一章文献综述 【2 3 】黑木宗尚，岩崎英雄浅海善殖的造步l j 乃生物擘研究 m 】柬京：恒星 社厚生闼，1 9 7 1 ，1 9 【2 4 】t s e n gck ，s u na s t u d i e so nt l l ea l t e m a t i o no ft l l en u c l e a rp h a s ec h r o m