（应用化学专业论文）微波辐射酶耦合催化（MIECC）效应的研究——MIECC中的溶剂系统及区域选择性.pdf

摘要 摘要 微波辐射一酶耦合催化( m 正c c ) 效应的研究 m 正c c 中的溶剂系统与区域选择性 硕士研究生孙诗雨导师方云专业应用化学 用微波辐射加热代替传统的加热方式应用于酶催化反应，即微波辐射一酶耦合催化( m i e c c ， m i c r o w a v ei r r a d i a t i o n - e n z y m ee o u p l i n gc a t a l y s i s ) ，会产生单独应用两者时不能观察到的效果。本文以 脂肪酶催化辛酸和丁醇、辛酸和甘油的酯化反应体系为研究对象，对m i e c c 反应的溶剂效应和微波 辐射对反应区域选择性的影响展开研究。并初步探讨了微量离子液体对酶促酯化反应的影响。另外 研究了微波辐射对爆米花中丙烯酰胺生成的影响。主要研究内容和结果如下： 1 研究了微波辐射对l i p o z y m er mi m ( 简称l r i ) 催化辛酸与丁醇酯化反应的溶剂效应。微波辐 射下的反应初速度值比常规加热下初速度值高。当以正辛烷作溶剂时，两种加热模式下，反应 初速度随底物浓度的增大呈先增大后减小的趋势；在低底物浓度下，微波辐射加快反应初速度 的效应比高底物浓度下的高。分别以直链烷烃同系物和芳烃同系物作溶剂时，两种加热模式下 反应初速度与溶剂的碳链长度有关，具有相同l o g p 值的同分异构体溶剂对酶促反应初速度的影 响并不相同。两种加热模式下酶促反应初速度并不是随着溶剂l o g p 的增大而一直增加，而是存 在一最佳范围。当用不同的溶剂化显色极性参数表征溶剂的极性时，酶促反应初速度与溶剂极 性的关系并不相同。考察了不同溶剂中l r i 经不同加热模式处理后的荧光发射光谱法的变化， 微波辐射并未改变脂肪酶l r i 的最大荧光发射波长，而在一定程度上提高了其发射强度。 2 研究了微波辐射对脂肪酶催化辛酸和甘油的酯化反应中脂肪酶1 3 - 专一性的影响。实验考察了两 种加热模式下不同脂肪酶、辛酸转化率、初始加水量，底物配比及不同溶剂条件下，产物中甘 油单酯、甘油二酯的异构体含量。不同实验条件下脂肪酶表现出不同的l ，3 专一性。实验范围内 微波辐射均削弱了脂肪酶的位置选择性，表现为产物辛酸单甘油酯中的2 - m o 和辛酸双甘油酯中 的1 , 2 - d g 的含量增加，但仍明显低于1 - m g 和1 , 3 - d g 的含量，即微波辐射削弱但并未根本改 变脂肪酶的1 , 3 专一性。且削弱程度与反应条件有关。 3 研究了离子液体对脂肪酶n o v o z y m e 4 3 5 催化辛酸与甘油酯化反应的影响。考察加入微量离子液体 对反应初速度和反应区域选择性的影响。加入微量离子液体后，反应初速度和反应转化率均比同 等加水量不加离子液体反应条件下的降低。加入离子液体之后，脂肪酶的1 ，3 专一性得到了加强。 4 采用固相萃取离心分离吸附c k 3 方法检测爆米花中致癌物质丙烯酰胺的含量。丙烯酰胺的检出 限和定量限分别为3 嵋，l 和l o 嵋几，线性相关系数詹= 0 9 9 3 8 ，试验了7 种市售爆米花，其中 微波焦糖甜昧爆米花检测样本数，= 6 时r s d = 1 9 5 。实验结果表明，无论采用哪种膨化方 式，还原糖糖份高均会导致爆米花中丙烯酰胺含量增高；而微波的低温加热特性和快速加热特性 导致微波爆米花中丙烯酰胺的含量明显低于常规加热下的。 关键词：微波辐射，酶催化，m i e c c ，溶剂，荧光光谱，1 , 3 专一性，离子液体，丙烯酰胺 摘要 a b s t r a c t i n v e s t i g a t i o no nm i c r o w a v ei r r a d i a t i o n - e n z y m ec o u p l i n gc a t a l y s i s ( m i e c c ) 一n em i z y m er e g i o s e l e c t i v i t ya n de f f e c to f s o l v e n ti nm i e c c a p p l y i n gm i c r o w a v ei r r a d i a t i o n - e n z y m ec o u p l i n gc a t a l y s i s ( m i e c c ) c a nb r i n gm a n yu n i q u ef i n d i n g s ， w h i c hw e r eq u i t ed i f f e r e n tf r o mt h o s eo b s e r v e df r o mc o n v e n t i o n a lh e a t i n ga s s i s t e de n z y m a t i cr e a c t i o n s i n t h i sp a p e r , t h ee s t e r i f i c a t i o ns y s t e mw i t hc a p r y l i ca c i da n db u t a n o l ，c a p r y l i ca r i da n dg l y c e r o lw e r es e l e c t e d 。 t h es o l v e n te f f e c t s r e g i o s e l e c t i v i t yi nm i e c cr e a c t i o nw e r es t u d i e d t h ee 位c to fi o n i c l i q u i do n e n z y m a t i ce s t e r i f i c a f i o nw a si n v e s t i g a t e d w e l l a d d i t i o n a l l 3 , e r i e c to fm i c r o w a v er a d i a t i o no nm a i l l a r d r e a r t i o nw a sd i s c u s s e d 1 1 1 em a i nc o n t e n t sa n dr e s u i t sa f e 鹳f o l l o w s ： 1 n 壕e r i e c t so fs o l v e n ti nm 正c cr e a c t i o nw e i n v e s t e dt h r o u g he n z y m a t i ce s t e r i f i c a t i o nb e t w e e n c a p r y l i ca c i da n db a t a n 0 1 w h e nc h o s en - o c t a n ea ss o l v e n t , w i t l lt h ei n c r e a s i n go fs u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n , t h eh a i t i a lr e a c t i o nr a t e si n c r e a s e da n dt h e nd e c r e a s e du n d e rb o t hc o n v e n t i o n a lh e a t i n g a n dm i c r o w a v ei r r a d i a t i o i l 硼 m i c r o w a v ei r r a d i a t i o ni n c r e a s e dt h ei n i t i a lr e a c t i o nr a t e s a n dt h e h i g h e l m i c r o w a v ee r i e c t sa p p e a r e di nl o w e rs u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n 1 1 1 ei n i t i a lr e a c t i o nr a t e sa l t e r e d w i t ht h ea l k a n e so ra r e n e 8c a r b o nn u m b e ru n d e rb o t hh e a t i n gm o d e s t h ee f f e c t so fi s o m e r ss o l v e n t w i t ht h es a r f l el c g po nr e a c t i o nm t e sw e r ed i f f e r e n lt h ee r i e c 忸o f m i e c cc a u s e db yd i f i e r e n ts o l v e n t s w e r ed i f f e r e n t u n d e rt w oh e a t i n gm o d e s t h ei n i t i a lr e a c t i o nr a t e sd i dn o ti n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n g o fs o l v e n t sl o g p , b u tt h e r ew a sa no p t i m a mr a n g e w h e nu s i n gd i f f e r e n ts o l v a t o e h r o m i cp a r a m e t e r t o k e nt h es o l v e n t sp o l a r i t y , t h er e l a t i o n s h i pk 靠e ni n i t i a lr e a c t i o nr a t ea n ds o l v e n tp o l a r i t ) ，w a s d i f f e r e n t t h ec h a n g eo f f l u o r e s c e n c es p e c t r u mo f l l uw i t hd i f f e r e n tt r e a t i n gm e t h o d sw a si n v e s t i g a t e d t h e 托s u l t ss h o w nt h a tm i c r o w a v ei r r a d i a t i o nc o u l d n t c h a n g et h em a x i m u mw a v e l e n g t ho f f l u o r e s c e n c e ，b u tc h a n g e dt h ei n t e n s i t y 2 t h ee s t e r i f i c a t i o ns y s t e mw i t hc a p r y l i ca r i da n d # y c e r o lw a ss e l e c t e df o ri n v e s t i g a t i n gt h ee f f e c to f h e a t i n gm o d e so nt h er e g i o m e l e c t i v i t yu n d e rd i f f e r e n tr e a c t i o nc o n d i t i o n s 1 , 3 - s p e c i f i c i t yo f n o v o z y m e 4 3 5v a r i e dw i t hc o n v e r s i o no f c a p r y l i ca c i d ，w a t e rd o s a g e ，r a t i oo f s u b s t r a t e sa n ds o l v e n t s t h ec o n t e n t s o f 2 - m o n o g l y c e r i d ea n d1 , 2 - d i g l y c e r i d ei nt h em i c r o w a v e dr e a c t i o nn l i x n l r ew e f eh i g l l e rt h a nt h a ti nt h e c o n v e n t i o n a lh e a t e dr e a c t i o nm i x t u r e i na l lm e a n sm i c r o w a v ei r r a d i a t i o nw e a k e nt h e1 1 3 s p e c i f i c i t y d e p e n d i n go nt h er e a c t i o nc o n d i t i o n $ 3 t h ee f f e c t so fi o m cl i q u i d ( b m i m l p f 6 ) o ne n z y m a t i cr e a c t i o nr a t ea n d r e g i o s e l e c t i v i t y o f e s t e r i f i c a t i o ni n i t i a lw c l - es t u d i e dt h r o u g hr e a c t i o ns y s t e mo f c a p r y l i ca c i da n dg l y c e r 0 1 i tw a sf o u n d t h a tt h ei n i t i a lr e a c t i o nr a t e sa n dt h ec o n v e r s i o no fc a p r y l i ca c i dw c r ed e c l i n e d ，b u t1 , 3 一s p e c i f i c i t yo f n o v o z ”n e4 3 5w e r es t r e n g t h e n e d 4 am e t h o do fe x a m i n i n gs c r y l a m i d ei nc o o k e dp o p c o r nb ys o l mp t u l s ee x t r a c t i o n g a sc h r o m a t o g r a p h y ( s p e g c ) w a se s t a b l i s h e d t h ed e t e c t i o nl i m i ta n dt h eq u a n t i f i c a t i o n1 i m i tw c r ee s t i m a t e d 砒3 雌几a n d l oi l g lr e s p e c t i v e l y ；a n dt h el i n e a rc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tw a s0 9 9 3 8 s e v e nc o m m e r c i a lp o p c o r n s a m p l e sw i t hd i f f e r e n tf l a v o r sw e r ec o l l e c t e da n dt e s t e di nt h i sp a p e r t h e 脚o f a c r y l a m i d el e v e lo f c a r a m e ls w e e tp o p c o r nm i c r o w a v e dw a s1 9 5 ( n56 ) i tw a so b v i o u st h a tn l eh i g l lc o n t e n to f r e d u c e d s u g a rl e a c ht oh i g ha r r y l a m i d ec o n t e n ti nb o t hh e a t e dm a l l q e r s ，a n dt h el o wt e m p e r a t u r ea n dq u i c k h e a t i n gc h a r a c t e ro f m i c r o w a v el e a d sl o w e rc o n t e n to f a c r y l a m i d ei nm i c r o w a v e dp o w o m 江南大学硕士学位论文 k e y w o r d s ：m i c r o w a v ei r r a d i a t i o n , e n z y m a t i cr e a c t i o n , m i e c c ，s o l v e n t , f l u o r e s c e n c es p e c t r u m , 1 , 3 - s p e c i f i c i t y , i o n i c q n i d , a c r y l a m i d e i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所傲的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 、 签名：丑尘盘壹导师签名；二勉 日期：砷年f 月7 尹日 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 自1 9 8 6 年g e d y e 等”1 利用微波辐射有效地加速有机反应以来，微波促进有机化学反应的研究已 逐渐深入。微波辐射不仅能加快反应速度，减少催化剂用量，有时而且还改变反应选择性 2 - 4 1 。1 9 9 0 年以来，微波辐射被应用于生物催化反应尤其是非水相酶催化反应中。过度的微波辐射自然会损伤 酶的催化活性甚至使酶蛋白消解，但对很多具体酶促反应而言，适当的微波辐射与常规加热相比已 表现出明显的优势p ”j 。微波辐射已不仅仅是一种加热手段，微波对生物催化反应的非热效应虽然至 今无法明确解释，但是已被接受认可，于是微波辐射酶耦合催化( m i n c e ，m i c r o w a v e i r r a d i a t i o n - e n z y m ec o u p l i n gc a t a l y s i s ) 技术开始被越来越多地应用。目前在这一方面的研究工作主要集 中在研究微波的加热特性b 1 2 0 1 及其对酶的影响口”、微波辐射对酶催化反应动力学的影响 2 3 3 5 1 及微 波辐射对酶催化反应选择性的影响p “”等方面。 另一方面，自瑞典国家食品局( n f a ) 和斯德哥尔摩大学( s t o c l 【i l o l mu n i v e r s i t y ) 的科学家首次公布 某些谷类食品经烘烤或油炸后产生丙烯酰胺1 4 1 】以来，食品中丙烯酰胺的含量问题在世界各国食品业 界的广泛关注j 。微波食品以其快捷、方便及卫生等优点，成为近年来广大市民消费的一个热点。 但2 0 0 3 年美国麻省理工学院r a y m o n df r a n c i s 教授 4 5 1 在相关网站上发表了家用微波炉有害论的观 点，指出微波炉对血液制品和食品等的三大潜在危害，随后关于微波食品安全性的研究成为食晶界 的一个新课题”6 “。 1 2 微波的致热效应和非热效应 微波是一种频率在3 0 0 m h z 3 0 0 g h z ( 波长在im 1m m ) 范围内的电磁波，位于电磁波谱的红 外辐射( 光波) 和无线电波之间。目前用于微波反应研究的微波主要是民用微波，频率一般固定在2 4 5 g l - - i z ( 波长为1 2 2c m ) 。微波辐射对化学反应的影响可以主要归结为致热效应和非热效应 1 1 】。 致热效应是指微波辐射使反应物温度升高，从而改变反应速度的现象8 2 1 。微波加热主要有极化 和传导两种机制1 ”。与常规加热相比，微波加热具有其特殊性【1 1 13 】：一是微波对被加热物质的所 有部位具有同时加热功能，可将能量直接传至反应物的官能团部位，从而引起底物的活化。二是微 波加热的效率与被加热物质的极性有关，物质的介电常数愈大，对微波的耦合作用愈强，对非均相 体系而言微观上表现为点加热特征并会伴有过热现象。 非热效应是指除加热使温度升高带来的影响以外。微波辐射对某些反应具有提高平衡转化率、 减少副产物、改变产物立体选择性或位置选择性等无法用单纯的致热效应来解释的其它效应 1 4 - 1 9 , 2 q ， 比如用微波辐射可以从嘧啶选择性合成6 取代蝶呤，而用常规加热则得到的产物中以7 取代蝶呤为 主( 图1 - 1 ) 【l ”。微波非热效应影响化学反应的可能性可以归结为；( 1 ) 微波电磁场对极性( 非极性) 分子的作用，即极化现象；非极性分子被极化后，其性质应有所变化。( 2 ) 电磁波与分子振动( 或转动) 的关系；即微波可引起分子的振动或转动，就可对化学键的断裂做出贡献。( 3 ) 微波对物质的选择性 加熟而使部分物质的活性增加。 心砖o ：嚣血y 只 图i - i 微波辅助选择性合成6 - 取代蝶呤1 1 q f i g1 1m i c r o w a v e - a s s i s t e dr c g i o s p e c i f i cs y n t h e s i so f 6 s u b s t i t u t e dp t e r i n s 【1 q m i e c c 中的微波非热效应已被很多实验事实所证实，集中表现在相同反应温度和其它条件下， 排除升温初速度的影响后，m i e c c 可明显改变反应的初速度。比如，本实验室发现微波辐射下辛酸 和烷醇酯化反应的m i e c c 效应不能用单纯的微波热效应来解释mo 】。关于m i e c c 中微波的非热效 江南大学硕士学位论文 应将在本文相关部分中具体阐述。 1 3 微波辐射对酶的结构和活性的影响 在最初关于微波辐射对生物体影响的报道中。可以零星地见到微波辐射对酶各级结构的构象研 究m l 。随着m i e c c 的研究进展，关于微波辐射对在反应系统中酶的影响的报道亦逐渐增多，主要 表现在微波辐射对酶的结构及活性的影响【1 6 芦“。 1 3 1 微波辐射对酶结构的影响 由于酶的催化活性与酶的结构密切相关，因此研究微波辐射下酶构象的变化对研究m i e c c 反应 具有重要意义。p r o c e t l i 等【l q 研究了微波辐射对s 腺苷高半胱氨酸水解酶 ( s a d e n o s y l h o m o c y s t e i n e ( a d o h c ”h y d r o l a s e ) 结构的影响，分别检测了微波辐射前后的a d o h c y h y d r o l a s e 的荧光发射光谱。发现微波辐射后酶在2 8 0n m 和3 4 0n m 激发波长处的荧光发射强度均有 增强。2 8 0n m 激发波长下的荧光发射主要是由蛋白质内部的荧光团( 如色氨酸和酪氨酸) 引起的，而 3 4 0h i l l 激发波长下的荧光发射是与脂肪酶相连的辅酶n a d h 荧光团有关。由此认为微波辐射引起了 蛋白质结构的重排。由于a d o h c y h y d r o l a s e 在实验条件下是热稳定性酶，p r o c e l l i 把蛋白质结构的改 变归结为微波辐射的非热效应。 v u k o v a 等1 研究了微波辐射对乙酰胆碱酯酶( a c e i y l c h 0 1 m e s t e r e ) 活性和对肌肉蛋白质结构的 影响。发现微波辐射导致蛋白质二级结构发生变化，其中口- 折叠的含量增加，萨螺旋结构亦变得混 乱，使蛋白质的有序结构无序化。 本l 对比了同样温度下经微波辐射预处理过的酶液和经常规热处理的酶液的荧光强度。结果表 明：经微波辐射或者常规加热预处理过的酶，波峰的位置未变，而其荧光波峰的强度发生了变化。 波峰的位置未变说明微波辐射或者常规加热并没有导致酶结构中发色基团结构的改变，荧光强度变 化是因为发色基团含量的变化，由此可推测酶的蛋白部分经微波辐射后更加裸露”。这在一定程度 上也可以解释微波辐射后酶活增加的原因之一可能是由于“裸露”的酶蛋白能更好地与底物接触。 1 3 2 微波辐射对酶活性的影响 p r o c e l l i 等口唧为了区分微波加熟的“致熟效应”和“非熟效应”，研究了微波辐射和常规加热对两种 嗜热酶s 一腺苷高半胱氨酸水解酶( s ，a d e n o s y l h o m o c y s t e i n e ( a d o h c y ) h y d r o l a s e ) 和5 ，- 甲硫腺苷磷酸化 酶( 5 ，- m e t h l t h i o a d e n o s i n e ( m t a ) p h o s p h o r y l a s e ) 的活性及其结构的影响。将酶溶于t r i s - h c l 缓冲液后 分别考察微波辐射和常规加热下酶活随加热时间的变化。发现两种加热方式均造成酶的不可逆失活； 微波辐射下酶的失活初速度较常规加热下大，且微波效应不依赖于样品浓度( o o 卜一o 3m g m 1 ) 的变 化。由于两种方式下加热温度相同，作者把这种现象归因于微波辐射的非热效应。他们也研究了微 波辐射下无机盐对酶活性的影响：对于a d o h c yh y d r o l a s e ，加入k c i 和k i - - 1 2 s 0 4 并未改变微波辐射 对酶活性的影响；对于m t ap h o s p h o r y l a s e ，加入k c i 和n a c i 加速酶的失活，而加入k h 2 s 0 4 和 n a s 0 4 可减缓酶的失活。 c a r a 等幽1 研究了微波辐射和常规加热对卢半乳糖苷酶伊一g a l a 咖s i d 鹅e ) 活性的影响。将酶的磷酸 钾溶液分别通过微波辐射和常规加热一定时间后测定酶活。分别保持恒温ll l ( 7 0 ) 后，微波辐射下 的酶活仅是常规加热下的2 0 。作者对微波辐射促使酶失活的解释为：微波辐射下，由于蛋白质呈 现一定的偶极性而引起共振，这种共振会对酶造成机械的拉伸从而造成酶的失活。值得注意的是在 一定浓度范围内( 1 0 5 0 峙，m l ) ，微波效应依赖于浓度而变化，当浓度大于5 0 峙 n l 时，微波效应 将消失。而作者并未对微波辐射下的浓度效应作出解释。我们认为这可能与体系的熵变有关：低浓 度范围内，不同酶浓度体系经微波辐射后的熵变及熵变的差异较大。微波效应的显现较为明显；当 浓度高到一定程度时，微波辐射后体系的熵变不明显。致使微波效应消失。 2 第一章绪论 c h e n 口1 等用微波辐射和h e - n e 激光处理植物种子子叶中的淀粉酶( a m y l a s e ) 、转氨酶 ( r r a m a m i n a s e ) 、蛋白酶口r 0 埘n e ) ，处理后各种酶的酶活均明显增强 $ o y s a l 等8 6 1 发现胡萝h 过氧化物酶在微波辐射下较常规加热下失活更快，且其失活程度与微波 功率有关 脂肪酶n o v o z y m 4 3 5 在有机介质中的稳定性也会受到微波辐射的影响】。以丁酸乙酯和丁醇的 酯交换反应为模型，在酶促反应前( 储存条件下) 和反应中( 反应条件下) 分别施行微波辐射和常规加 热。两种情况下微波辐射下酶的稳定性均高于常规加热模式下的。其中不同底物( 丁酸乙酯或丁醇) 中微波辐射对酶稳定性的影响并不相同，在强极性底物( 丁醇) 中微波效应更为明显，微波辐射下酶的 稳定性是常规加热下的6 倍。作者认为极性溶剂能更好地耦合微波能量，改变了酶与其微环境的相 互作用，增加了酶的稳定性。而在无底物条件下，微波辐射和常规加热对酶稳定性的影响基本相同。 本实验室口3 】发现脂肪酶l i p o l a s e1 0 0 l 酶液经2 0 0w 的微波辐射后，酶活先增加后减小，微波辐 射6 分钟后酶活达最大值。 以上结果均表明微波辐射对酶结构和酶活性的影响与微波辐射的时间、功率及酶所处的具体环 境有关。这是因为，一定范围内的温度升高或高频电磁场的作用，可以调整酶分子的表面构象使其 活性部位更好地与底物结合，表现出酶活升高。但过长的微波辐射或者长时间的加热可能导致蛋白 质的二级结构发生变化，甚至引起肽键断裂。另一方面，热效应达到一定程度时，酶分子动能( 位移 能) 增大的同时基团的震动能扩大，以致超过氢键及其它正常键能水平，酶的立体构象不能维持在常 规状态，氢键被破坏，酶蛋白的毋螺旋体无规则地散开，有序的分子结构变成无序，为熵增过程。 熵增过程中，酶分子的三维结构部分易被破坏，酶活下降。 1 4 微波辐射对酶催化反应动力学的影响 研究酶反应动力学对了解酶作用机制、确定最有效的反应系统、反应条件等都十分重要。在 m i e c c 的研究中，微波辐射对酶催化动力学的影响也是重要研究内容之一。 1 4 1 微波辐射对酶催化反应初速度的影响 p a r k e r 等”考察了c u t h m s e 在微波辐射和常规加热下催化丁醇与丁酸乙酯的酯交换反应。结果显 示微波加热对酶催化反应初速度的影响与酶所处的微环境有关。在不同温度下，初始水活度为0 5 8 和0 6 9 时，微波辐射增加反应初速度2 3 倍；而在初始水活度为o 9 7 时，微波辐射条件下的反应 初速度却相应低于常规加热条件；这种微波辐射导致较低反应初速度的效应是可逆的。 将枯草杆菌蛋白酶( s u b t i l i s i n ) 和m 胰凝乳蛋白酶( 口c h y m o 仃y p s 蛐置于六种不同溶剂中在不同温 度下催化酯交换和酯化反应【，微波辐射可使得反应初速度增大2 1 4 7 倍。两种加热模式下的反 应初速度均随溶剂的1 0 9 p 的增加而增大( 苯为溶剂时例外) ，但不同溶剂中两种加热模式的反应初速 度比( v 以) 不同，且v ，v c 与溶剂的l o g ，无明显相关关系。作者将微波辐射与p h 调节和盐活化等方 法结合来探讨其综合效应。结果显示这三种方法结合的反应初速度最大，大于单纯p i - i 调节和单纯 微波辐射等方式所得的初速度。 与常规加热相比，微波辐射下固定化脂肪酶n o v o z y r n4 3 5 催化有机相中合成脂肪酸酯的反应初 速度提高了2 6 3 倍o ”。两种加热模式下反应活化能并未改变，作者将微波促进反应归结为微波辐射 下分子间的有效碰撞增加。 z h u 等o 1 1 分别用微波预辐射、微波预辐射同时结合碱处理以及碱处理后微波预辐射三种处理 方式来水解稻杆。发现第二种处理方式提高稻杆水解初速度最为明显，而水解产率并未改变。高功 率短时间辐射和低功率长时间辐射对其水解初速度的影响基本相同。 3 江南大学硕士学位论文 多聚半乳糖醛酸、木聚糖、羧甲基纤维素经微波预辐射后，其反应初速度分别提高了1 5 2 3 倍【3 3 】。对微波辐射前后底物的电镜分析表明：微波辐射促使底物的形态发生很大改变，可能更有利 于酶与底物的结合，从而提高了反应初速度 1 4 2 微波辐射对酶催化反应产率的影响 在许多m i e c c 的反应中，微波辐射并非单纯提高反应初速度或是增加反应产率，而往往是两种 正效应同时存在。p u j i c 等o o 】研究了用中性氧化铝作载体时酶催化苷化的m i e c c 反应。相对于常规 加热方式，微波辐射下反应所得产率明显高于常规加热模式。 本实验室田】以戊醇的同分异构体与辛酸为底物，比较了常规加热、在线微波辐射和微波辐射预 处理酶等三种模式下的非水相酶催化酯化反应。发现m i e c c 不仅在提高酯化反应初速度方面表现出 明显的耦合效应，加快了反应初速度2 5 4 5 倍，同时也使得反应产率有所改善。 l i n p 3 i 等报道微波辐射可促进蛋白质在不同溶剂中的酶消化。微波辐射后，肌红蛋白，细胞色素 c ，溶菌蛋白和u b i q u i t i n 在水、5 0 甲醇和3 0 乙腈中的酶消化产率均不同程度地提高。 k h o b r a g a d e 等阻 研究了微波辐射和常规加热下蔗塘的酶催化水解反应分g q 选水、异丙醇水、 聚乙二醇水作为反应介质，结果表明在有机溶剂中微波辐射对反应初速度和转化率的提高较水溶液 中更为明显。 然而，微波辐射并不一定总是促进反应，比如脂肪酶n o v o z y m4 3 5 催化丁酸和丁醇合成丁酸丁 酯的反应口“，微波辐射和常规加热两种模式下反应初速度、反应平衡常数和反应产率均相近。 综上所述，微波辐射对酶催化反应速度和反应产率的影响尚无明确规律可循，这与微波功率， 微波辐射时间、反应体系、酶的种类及酶所处的环境等因素有关，有待于进一步深入研究。 1 4 3 微波辐射对酶催化反应动力学机制的影晌 y a d 扩q 等研究了微波辐射和常规加热下脂肪酶n o v o z y m e 4 3 5 催化乙酰乙酸甲酯和丁醇的酯交 换的反应动力学。分别固定一种底物和加酶量考察两种加热模式下另一底物浓度变化对反应初速度 的影响，发现两种加热模式下反应均遵循p i n g - p o n gb i - b i 机制，即微波辐射并未改变酶催化反应的 动力学机制。在他们近期的另一研究中，也发现了类似的现象”。 apb e ( e a 刍弓e 乍) e 毋生弓e q ) e a ，b ：s u b s t r a t e ；p ，q ；p r o d u c t ；e ：豇因m ： e ：日l z y m es p e c i e s ；e a e b ：d l z y n l e s u b s m | t ec o m p l e x e s 图1 2 酶催化反应的p i n g - p o n gb i - b i 机制p 1 f i g 1 2s c h e m a t i cp i n g - p o n gb i - b im e c h a n i s m ”州 本实验室9 5 1 研究了m i e c c 对脂肪酶l i p o z y m er m 讧催化辛酸与丁醇酯化反应动力学的影响。 常规加热条件下，其动力学特征遵循p i n g - p o n gb i - b i 机制。微波辐射条件下，反应的动力学特征受 到微波辐射的徽扰，但并未从根本上改变酶催化反应的p i n g - p o n g b i - b i 机制，只是在某一范围内即 高底物( 醇) 浓度时使反应偏离该机制。 4 q i 第一章绪论 1 5 微波辐射对酶催化反应选择性的影响 酶催化选择性是酶促反应的一个重要特点，对于有机合成具有极高的价值。它包括对映选择性、 底物专一性、前手性选择性和区域选择性。在研究m i e c c 机制的过程中，微波辐射对酶催化反应选 择性的影响研究也同样重要。 1 5 1 微波辐射对酶催化反应对映选择性的影响 l i n 等。6 1 通过研究微波辐射条件下脂肪酶p o r c i n ep a n c r e a t i cl i p a s e l ) 催化1 , 2 ，3 ，4 一四氢化1 萘 酚和1 - 茚满醇( r - 3 ) 的酰化反应。发现微波辐射下的对映选择性分别提高了3 9 和7 1 4 倍，同时 反应初速度和反应转化率也有所改变。同样，微波辐射下薄荷醇的酶促酰化反应的对映选择性也很 茼( f ! f l1 - 3 ) i “。 5 h 3 1 c o o hp p l ( c 1 5 心1 c o b + m w 9 0 1 0 图1 3 微波辐射下酶促合成薄荷醇酯【6 】 f i g 1 - 3l i p a s e - c a t a l y z e da c y l a t i o no f m e n t h o lb ym i c r o w a v ei r r a d i a t i o n i q c a r r i l o - m u n o z 等研究了微波辐射下的脂肪酶催化1 苯基乙醇的手性拆分。相对于传统加热方 式，微波辐射提高了脂肪酶在酯化和酯交换反应中对底物的亲和性和反应选择性，产物的e 值分别 提高了2 6 和4 9 倍。 本实验室1 2 3 】用酵母水相催化* 羰基苯丁酸乙酯还原制各岛口羟基苯丁酸乙酯。结果表明微波辐 射和常规加热下反应的e e 发生了变化，微波辐射使其选择性提高5 8 8 5 。 对微波辐射提高酶催化反应的对跌选择性这一行为可初步解释为i s , 目：微波辐射可以改善酶的 “微环境”从而可能提高酶催化的专一性。酶催化体系经过微波辐射后，增强活性中心的立体结构与 相关底物基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团与酶活性中心更加相互接近，并严 格定位，使酶催化反应具有更高效率和专一性。而且微波同时也是一种电磁波。其交变电场对蛋白 质等极性分子的洛仑兹力作用，会强迫其按照外加电磁场作用的方式运动，从而迫使反应向生成某 一构型产物方向进行；另一方面，微波辐射降低了某些反应的活化能或熵函数，从而改变了酶的催 化专一性和立体选择性。 1 5 2 微波辐射对酶催化反应底物选择性的影响 b r a d o o 等9 8 1 发现对不同脂肪酶催化甘油酯的水解反应而言，微波辐射较常规加热下反应初速度 提高7 1 2 倍。用b a c i l l u ss m a r o t h e r m o p h i l u sl i p a s e ( b s l ) f ib u r k h o l d e r i ac e p a c i al i p a s e ( b c l ) 催化 不同甘油酯和不同甲酯的水解反应以及不同脂肪酸和甲醇的酪化反应时，微波辐射和常规加热下脂 肪酶表现出相同的底物选择性。 v a c e k 等p 9 用四种固定化酶( l i p o 巧m e ，m m i e h e i , c c y l i n d r a c e a , p c e 蹿动催化丁醇和不同脂肪酸 的酯化反应，发现微波辐射条件下反应产率高于常规加热下的，另外微波辐射条件下四种酶的底物选 择性与常规加热下的并无明显差别。 江南大学硕士学位论文 1 5 3 微波辐射对酶催化反应区域选择性的影响 z a r e v 妇 【柚】在微波辐射条件下通过葡( 萄糖) 基转移作用和反向水解法，用酶催化选择性合成 了烷基毋d 一吡喃葡萄糖苷和烷基j 伊m 毗哺半乳葡萄糖苷发现微波辐射可以提高酶催化的区域选择 性。 本实验室以 辛酸与甘油为底物，利用1 , 3 专一性的脂肪酶( n o v o z y m e4 3 5 ) 在无溶剂条件下催化 甘油和十辛酸的酯化反应。通过考察不同水含量、不同配比以及不同加热方式下各产物量的变化来 探讨微波对该反应的区域选择性影响。发现实验范围内各种条传下微波辐射均削弱了n o v o z y m e4 3 5 的1 , 3 专一性。 1 6 食品中丙烯酰胺问题的研究 1 6 1 丙烯酰胺 丙烯酰胺( r y l m i d c ) 是一种无色、无臭透明片状晶体；溶于水、醇、丙酮、醚和三氯甲烷， 不溶于苯和庚烷等。其聚合物聚丙烯酰胺是在水处理剂、油田化学品及造纸助剂等产品中常用的一 类高分子材料。 0 r e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h t ：7 1 0 9 s t r u c t u r a lf o r m u l a ：c h 2 c h c o n h 2 f u s i o np o i n t ：8 7 5o c b o i l i n gp o i n t ：1 2 5 0 c h 2 n 图1 - 4 丙烯酰胺的分子结构和物理性质 f i g 1 4m o l e c u l a rs t r u c t u r ea n dp h y s i c a lc h a r a e t e mo f a e r y l a m i d e 丙烯酰胺可通过未破损的皮肤、粘膜、肺和消化道吸收入人体，分布于体液中。丙烯酰胺可引 起动物致畸、致癌。丙烯酰胺单体毒性强，对老鼠的l d s 0 致死量是1 7 0 m g k g ( 腹腔内) ，从皮肤中 也可被吸收、从而引发中枢神经麻痹症状。丙烯酰胺可引起人体神经损害甚至使人瘫痪，1 9 9 4 年国 际癌症研究协会认为丙烯酰胺可能使人致癌 柏l 。世界卫生组织的食用水导引( 1 9 9 3 年版) 指出，每 公升食用水含丙烯酰胺限定值为o 1 5 p g ( o 1 5 心l ) ，欧盟的标准为o 1 1 i _ t g l t 4 9 1 。 1 6 2 食品中的丙烯酰胺及其形成机制 2 0 0 2 年4 月，瑞典国家食品局( n i 强) 和斯德哥尔摩大学( s t o c k h o l mu n i v e r s i t y ) t 寸科学家首次公布 某些谷类食品经烘烤或油炸后产生丙烯酰胺【4 1 】，随即引起了世界各国食品业界的广泛关注。随后许 多国家和国际性机构对食品中丙毒的形成机理、危害评估和检测方法等方面进行了广泛而深入的研 究。目前由天i 3 - 冬酰胺与还原糖在高温加热过程中通过美拉德( m a i l l a r d ) 反应生成丙烯酰胺的机理已