（农产品加工及贮藏工程专业论文）红茶菌优势菌的分离鉴定及代谢产物变化规律的研究.pdf

红茶菌优势菌的分离鉴定及代谢产物变化 规律的研究 中文摘要 本研究对红茶菌中优势菌的分离、菌相分析及代谢特性进行了研究。 本研究主要包括三个方面的内容： 1 红茶菌中优势菌种的分离与鉴定 本试验对来自湖南农业大学茶叶研究自然发酵的红茶菌进行了菌种分离和鉴定。 从该红茶菌中分离的优势菌种经鉴定主要有：6 株醋酸菌包括2 株液化醋杆菌“ 1 i q u e f a c i e n s ) ，1 株醋化醋杆菌( 一a c e h ) ，2 株重氮营养醋杆菌( a d i a z o t - r o p h i c u s ) , 1 株为甲醇醋杆菌似m e t h an o l i c a ) 。4 株酵母菌包括克鲁丝假丝酵母rc a n d i d a k r u s e y ，汉逊德巴利酵母f d e b a r y o m y c e sh a n s e n i i ) ，栗酒裂殖酵母 ( s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e l i n d e r 上酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r i v i s i a e ) 。 2 红茶菌菌相的研究 本试验的研究结果表明红茶菌在发酵过程中菌液中的微生物要比菌膜中的微 生物数量多。在发酵的第6 d ，菌液中的醋酸菌的数量要比菌膜中的高出7 倍左右； 酵母菌的数量要高出2 倍左右。但是，醋酸菌和酵母菌的生长曲线是相同的。同 时，从红茶菌中分离出的醋酸菌和酵母菌在各菌种单一发酵的过程中因菌种的不 同其生长的曲线是不相同的。 3 红茶菌发酵过程中主要代谢产物变化规律的研究 在糖代谢方面，在单一的醋酸菌发酵过程中，醋酸菌a 3 即甲醇醋杆菌的 乙酸产量最高，同时也是所有处理中产乙酸最高的。说明这个醋酸菌是产乙酸 的主要菌种。在单一的酵母菌发酵过程中，酵母菌y 3 即栗酒裂殖酵母的乙醇 产量是最高的，说明这个酵母菌利用糖产乙醇的能力很强。通过对红茶菌发酵 过程中儿茶素变化规律的研究可以看出发酵完成后c a f 及儿茶素总量均略有降 低，儿茶素各主要成分e g c g 、g c g 、e g c 、e c g 、d l c 、e c 变化趋势不同。 关键词：红茶菌；醋酸菌；酵母菌；菌相； 儿茶素 s t u d yo nt h e is ola tio na n did e n tific a tio no f mic r o b e sf r o mk o m b u c h aa n dt h ec h a r a c t e riz a tio n o ft h es t r a i n sm e t a b o ii t e s a b s tf a c t t h i se x p e r i m e n ts t u d i e do nt h ei s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fm i c r o b e s d i s t r i b u t i o no fb a c t e r i u m ，a n dt h ec h a r a c t e r i z a t i o nm e t a b o l i t e so fk o m b u c h a 1s t u d yo l lt h ei s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f m i c r o b e sf r o mk o m b u c h a t h i sp a p e ri n t r o d u c e dt h ei s o l a t i o na n di d e n f i f i c 撕o no fm i c r o b e sf r o mak i n do f k o m b u c h a t h e r ew e r es t l - a i l t l sb e e ni s o l a t e da n dt h e ys e p a r a t e l yw c r ca 1 i q u e f a c i e n s a a c e t i ，a d i a z o t - r o p h i c u s ，a m e t h an o l i c a , c a n d i d ak r u s e l d e b a r y o m y c e sh a n s e n i i ， s c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e l i n d e r ，s a c c h a r o m y c e sc e r i v i s i a e 2s t u d yo nt h ed i s t r i b u t i o no f b a c t e r i u mo f k o m b u c h a t 1 1 i se x p e r i m e n ts h o w e dt h a tv i a b l ee m m t so fa c e t i ca c i db a c t e r i aa n dy e a s ti nt h e b r o t ho fk o m b o c h aw e r e ng e n e r a l l yh i g h e rt h a ni nt h ep o l l i e l ep o r t i o n h o w e v e r , g r o w t hp a t t e r n sw e r ei d e n t i c a l t h es t u d ys h o w e dt h a tt h ev a r i a t i o ni ny e a s ta n da c e t i c a c i db a c t e r i as p e c i e sa n dt h e i rr e s p e c t i v en o ti n d e n t i c a ig r o w t hp a t t e r n s 3c h a n g ei nm a j o rc o m p o n e n t so f k o m b u c h am e t a b o l i t e s a m e t h an o l i c nu t i l i z e ds u g a r st og r o wa n dp r o d u c ea c e t i ca c i dw a sh i g h e rt h a n t h eo t h e r ss t r a i n sd u r i n gf e r m e n t a t i o n t h i si n d i c a t e dt h a ta m e t h an o l i c aw a st h e m a j o rs t r a i n so fb o t ha c e t i ca c i dp r o d u c e dd u r i n gf e r m e n t a t i o n s c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e l i n d e ru t i l i z e ds u g a r st op r o d u c ee t h a n o lw a sh i g h e rt h a nt h eo t h e r ss t r a i l 强 d u r i n gf e r m e n t a t i o n t h i si n d i c a t e dt h a ts c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e l i n d e rw a st h e m a j o rs t r a i n so fb r o t he t h a n o lp r o d u c e dd u r i n gf e r m e n t a t i o n ，t h r o u g hs t u d yo n c h a n g ei nc a t e c h i n so f k o m b u c h am e t a b o l i t e ss e e nt h a t t o t a lt e ac a t e c h i n sa n dc a f w e l el o w e da f t e rf e r m e n t a t i o n , b u te p i c a t e e h i ni s o m e r s ( e g c g 、e g c 、e c g 、 e c ，i n c l u d i n gg c g 、d l c ) w e r ee x a m i n e dd e m o n s t r a t e dv a r y i n gd u r i n gf e r m e n t a t i o n k e y w o r d s ：k o m b u c h a ，a c e t i ca c i db a c t e r i a ，y e a s t ，d i s t r i b u t i o no f b a c t e r i u m ， t e ac a t e c h i n s 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 戤窿尹 时间：弦9 年彳月护7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 繇压 一名：旅 警秒 衫l 时问：砷年多月刀日 时问：叼年6 月p 同 第一章绪论弟一早殖了匕 l 前言 红茶菌又名海宝，是有着悠久历史的一种民蚓传统酸性饮料，它的产生可 追溯到我国古代的秦朝。上世纪5 0 年代初的时候，红茶菌饮料曾在我国的一些 地区宣传和推广，由于没有科研单位的深入研究，未能继续发展和普遍饮用。 上世纪6 0 年代后期也曾风行一阵，但纯属民间户传家制，极不规范，所得菌 种、生产工艺、产品均无标准和检测方法。因而产品卫生质量极不稳定，营养 保健功能不突出，红茶菌又遭冷落。上世纪8 0 年代初，我国再度掀起饮用红茶 菌热，也引起了食品界、医学界和相关领域的关注，欲使其走上科学发展的轨 道，但是，当时人们普遍对红茶菌的科学认识不足，把它当成能包治百病的 “灵丹妙药”，太高的期望值与实际功效的差距使得红茶菌再度打入冷宫。近 些年来，除了中国、日本、韩国等东南亚国家，红茶菌在欧洲中部和东部各国 也一直广为流传，那里的人们把酸茶酒( 即红茶菌) 当清凉饮料来治疗消化不良 和动脉硬化等疾病。在德国、美国和加拿大等西方国家也颇受欢迎。它是以糖 茶水为原料，经醋酸菌、酵母菌和乳酸菌等多种微生物共同自然发酵而成的。 红茶菌菌液中含有一部分茶叶的浸出物、活的微生物及其代谢产物，这些 物质主要包括葡萄糖酸、醋酸、葡萄糖、果塘、蛋白质、氨基酸、维生素、微 量元素、茶多酚、咖啡因、乙醇和二氧化碳等。红茶菌一直被饮用它的人们认 为是一种对人体有多种保健作用的健康饮品。它的保健作用包括：清理肠胃， 预防和治疗便秘和痔疮；帮助消化；对高血压、高血脂、动脉硬化等心血管疾 病和糖尿病有预防和治疗作用；避免各种结石的发生；帮助身体及时排除毒 素，防癌、抗癌以及增强机体免疫力等等。可以说它是一种良好的健身饮料【l 。 5 1 。 红茶菌虽然在我国有悠久的历史，但对它的科学研究却起步较晚。我国著 名微生物学家方心芳先生于1 9 5 1 年在黄海杂志第1 2 卷第5 期刊登了海 宝是什么一文，这是我国关于红茶菌的首篇科学论文。文中认为红茶菌的微 生物种类主要是醋酸菌和酵母，同时指出红茶菌中的醋酸菌不只一种，但以膜 醋菌为主【6 】。2 0 世纪7 0 年代末期n 8 0 年代初期，红茶菌饮料在我国非常流 行，一些介绍红茶菌效果及制作方法的文章大量涌现。近些年来，我国对红茶 菌的抗菌作用进行了一些研究【7 l ，但对菌种及作用机理的研究仍是寥寥无几。 国外对红茶菌的研究大约始于2 0 世纪初。从2 0 世纪初期到中期，一些 医生和学者纷纷报道了红茶菌在治疗各种疾病中的效果和作用【8 】。从2 0 世纪 中期丌始一直到现在，有关红茶菌的微生物组成及相互作用、发酵条件、菌液 成分、作用机理等方面的研究陆续有文献报道。 2 国内外的研究动态 2 1 微生物分离纯化的研究 国内的研究主要在中德江西食品研究所和中国农业大学两个单位进行了研 究。吴薇唧等人从北京某研究所提供的样品中分离得到了几个微生物菌株，即巴 斯德酵母( s a c c h a r o m y c e sp a s t e u r i a n u si - i a n s e n ) 、栗酒裂殖酵母 ( s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp r o m b el i n d e r ) 、木醋酸菌似c e t o b a c t e rx y l i n u m ) 、甲醇酸 单胞菌口c 肋舢，娜m e t h n o l i c a ) 、乳酸杆菌属但4 “d 施c 讲淞e 力。吕爱掣1 0 1 等人从 丰县采集的红茶菌中分离得到木醋酸菌、乳球菌和裂殖酵母菌。a il e n g t e o h 川对红茶发酵饮料中的微生物进行了详细的研究，利用氧四环素作为抑制 细菌生长的物质，对红茶菌发酵中的菌膜和液体基质中的酵母菌分离，得到了 布鲁克丝假丝酵母( c a n d i d a c r u s e i ) 、栗酒裂殖酵母( s c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e ) 、克勒克酵母( k l o e c k e r a ) 、拜耳结合酵母( z y g o s a c c h a r o m y c e sb a i l i i ) 。 s a f a k ，s 【1 2 1 等从发酵红茶菌中分离得到1 1 种酵母菌，其中八株得到确认为酿酒 酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，两株为克鲁假丝酵母( c a n d i d ac r u s e i ) ，一株 为k l u y v e r o m y c e sa f r i c a n u s 已经得到鉴定。c l e t u sp k u r t z m a n1 1 3 等对红茶菌 发酵液中分离得到了一种裂殖酵母菌。到目前为止，人们从各种红茶菌中分 离到的醋酸菌有：木醋杆菌o c e t o b a c t e rx y l i n u m ) 、拟木醋杆菌 “c e t o b a c t e r x y l i n o i d e s ) 、葡萄糖酸杆菌( b a c t e r i u mg l u c o n i c u m ) 、产酮醋杆菌 似c e t o b a c t e rk e t o g e n u m ) 、弱氧化醋酸菌u c e t o b a c t e rs u b o x y d a n s ) 、葡萄糖醋酸 菌( g l u c o n o b a c t e rl i q u e f a c i e n s ) 、醋化醋杆菌叫c e t o b a c t e r a c e t i ) 和巴氏醋杆菌 似c e t o b a c t e rp a s t e u r i a n u s ) ，其中最主要的是木醋杆菌。酵母菌有酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，不显酵母( s a c c h a r o m y c e si n c o n s p i c m s ) 路德类酵母 ( s a c c h a r o m y c o d e sl u d w i g i o 、粟酒裂殖酵母( s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e ) 。热带 假丝酵母( c a n d i d at r o p i c a n s ) 、克鲁斯假丝酵母( c a n d i d a c r u s e o 、汉逊德巴利酵 母f d e b a r y o m y c e sh a n s e n i 0 、酒香酵母( b r e t t a n y o m y c e s ) 、克勒克酵母 ( k l o e c k e r a ) 、拜耳接合酵母( z y g o s a c c h a r o m y c e sb a i l i o 等【“】。用于发酵培养红茶 菌的菌种主要是醋酸菌和酵母菌，有的红茶菌有少量乳酸菌，主要是保加利亚 乳杆菌( l a c t o b a c t e r i u mb u l a g r i c u m ) 。 2 2 红茶菌发酵机理的研究 国内专门研究红茶菌代谢方面的不多，一般是将红茶菌的主要微生物进行 初步g i f t 离和鉴定的基础上对微生物的基本特性进行研究。吴薇 1 5 - 1 6 1 等人得了 一些结论：第一，醋酸菌m 对葡萄糖，果糖，蔗糖的利用程度上，对葡萄糖的 利用能力最强，对蔗糖的同化能力弱。第二，菌种a 2 2 具有很强的氧化葡萄糖 的能力，具体途径为：葡萄糖葡萄糖酸葡萄糖醛酸葡萄糖二酸一 一葡萄糖二酸1 ，4 内酯，其中间产物均为解毒，抗癌的功能因子；菌种y l l 生 成乙醇的能力强，菌种y 1 3 的发酵能力弱。s i e v e r s ，m 【1 7 1 等对采用菌膜作为发 酵剂的红茶菌发酵过程中的微生物学和发酵过程中物质利用情况进行了分析 研究发现酵母菌将蔗糖转化为葡萄糖和果糖，果糖发酵速度比葡萄糖快，发酵期 间p h 从3 7 5 降为2 4 2 发酵中间产物有蔗糖，果糖，葡萄糖，乙醇，乙酸，葡萄糖酸， 二氧化碳等。s a m - p i nl e e 1 8 1 等研究红茶菌发酵过程中酸度与菌膜形成的影响 因子发现，利用白糖，棕色糖，红糖发酵比较中，发现棕色糖能够使发酵可滴定酸 度和菌膜的产量最高增加乙酸和5 0 9 6 内的乙醇对促进膜的生成有帮助，但柠檬 酸对此作用相反。h a n - s u ps o b 【1 9 1 等也研究了发酵过程中酸度的变化和膜形成 的影响。采用菌膜和发酵液作为发酵剂，加入1 的乙醇，发现膜的产量和酸度均 有增加。 m i - a e c h o i ( 1 9 9 4 ) 等人对不同温度( 5 4 5 ) 和碳源( 蔗糖、葡萄糖、果 糖和玉米糖浆) 对红茶菌的p h 和总酸的影响进行了研究，结果表明，发酵产酸 的最适温度是3 0 ，蔗糖和果糖、葡萄糖和玉米糖浆产生的有机酸的种类相 似。果糖比葡萄糖代谢的速度快得多，而果糖和葡萄糖都比蔗糖的代谢速度快 2 0 1 。j t l r g e nr e i s s ( 1 9 9 3 ) 在2 0 2 2 c 的发酵温度条件下，用不同浓度的不同 碳源( 蔗糖、果糖、乳糖和葡萄糖) 对红茶菌( 菌种组成为木醋杆菌、拟木醋杆 菌、葡萄糖酸杆菌、粟酒裂殖酵母、路德类酵母及其它酵母菌种) 代谢产物( 乙 醇和乳酸) 和p h 的影响做了研究，结果显示，蔗糖和果糖能产生较多的乙醇， 3 葡萄搪则产生少量的乙醇。蔗糖能提高乳酸的产出而其它糖类产生的乳酸则很 少【2 ”。m a r t i ns i e v e r s 等( 1 9 9 5 ) 对两种菌种来源( 含不同酵母菌种) 的红茶菌 的发酵进行了研究，他们将红茶菌于室温条件( 2 0 2 2 。c ) 下培养了6 0 d ，检测 它们的发酵过程。结果不同的酵母菌对葡萄糖和果糖的利用速率不同，代谢的 过程也不相同。酵母菌在糖的利用上起了决定作用，且不同的酵母菌的利用方 式是不同的。m a t i ns i e v e r s 等还指出他们所用的木醋杆菌能代谢乳酸，因此 他们没有象j o r g e nr e i s s 那样检测到乳酸【2 z j 。 2 3 红茶菌抑菌作用的研究 有关国内在红茶菌抑菌特性方面也有研究报道，吕爱掣圳等人对红茶菌 菌膜发酵制得的无菌滤液进行了抑菌实验的研究。采用未发酵的调酸糖茶水为 对照，发现发酵滤液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有一定的抑 制作用。黄国清 2 3 1 等人在研究红茶菌发酵饮料生产条件的同时发现其发酵液 对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、致病性大肠杆菌( 4 4 3 3 6 ) 、 产毒性大肠杆菌( 4 4 3 5 0 ) 有明显的抑菌作用。同时，谢俊杰【z 4 1 等人进行了更 深入的研究。研究发现红茶菌菌液对革兰氏阳性和阴性菌均有抑制作用，并且 与剂量成正相关。同时还基本确定抗菌的物质是小分子的蛋白质。 c j g r e e n w a l t 2 5 1 等利用发酵红茶菌做抗菌实验，发现对革兰氏阴性菌和阳性病 原菌均有抑制作用，但确认起抑菌作用的物质并不是红茶菌本身，而是来源于乙 酸。s r e e r a m u l u g 闭等采用0 5 的茶、l o 的蔗糖、2 5 的葡萄糖配方接种 红茶菌后，检测其具有抗菌活性，另外通过发酵过程的代谢产物分析。乙酸和葡萄 糖酸在发酵过程中是增加的。但未检测到乳酸。系统说明了发酵液中具有除酸， 蛋白质以外的其它抗菌物质。s t e i n k r a u s ，k 俨刀等在研究报告中对4 3 6 9 l 的 茶叶提取物与1 0 的蔗糖发酵液中存在的对病原微生物的抑制作用完全是乙酸 的功劳没有其它的抗生活性物质的出现。s t e i n k r a u s1 2 川的一项研究报道表明 红茶菌对幽门螺杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和根瘤脓杆菌的抗生活性 主要来自于发酵过程中产生的乙酸。g r e e n w a l t 阎等研究红茶菌对猪霍乱沙 门氏杆菌、蜡状芽孢杆菌等有抑制作用。 2 4 红茶菌的成分分析【1 4 1 一些学者对红茶菌菌液中所含成分进行了分析，由于所采用的菌种、培养 条件、分析方法、分析的侧重点等方向都小尽相同，因此不同的资料其结果也 不同。德国的g u n t h e rw f r a n k ( 1 9 9 1 ) 认为红茶菌中含有葡萄糖醛酸、葡萄 糖酸、醋酸、酒精、乳酸、氨基酸、蛋白质、叶酸、地衣酸、v c 和多种b 族 维生素等。c - h l i u 等人( 1 9 9 5 ) 对来自台湾的两种红茶菌用h p l c 进行分析， 显示该红茶菌中含有甘油、乙酸和乙醇。美国的m i c h a e lr r o u s s i n ( 1 9 9 6 ) 报 道了用h p l c m s p d a d ( 高效液相色谱质谱光电扫描) 方法对来自美国和世界其 他地方的1 9 个红茶菌试样进行了化学成分分析，结果没有找到以前几乎是公 认的功能因子一葡萄糖醛酸，而且各种维生素的含量很少，不过检出了许多前 人没有检出的物质。他们从这1 9 种红茶菌中检出了4 0 多种化学物质。而这些 物质进入人体后如何起作用还需进一步的科学研究。b i l j a n ab a u e r p e t r o v s k a ( 1 9 9 8 ) 用原子吸收色谱法和薄层色谱法对红茶菌中的矿物质和可溶 性维生素进行了分析，结果表明对人体有益的微量元素锌、铜、铁、锰、镍和 钴的含量比不经发酵的茶水中的要高，对人体有害的元素铅和铬的含量都很 少，且比茶水中的含量减少了许多。这说明经微生物作用，可以增加有益元素 而减少有害元素。 2 5 红茶菌保健机理和安全性的研究 有关红茶菌有益人体健康的作用机理到目前为止还没有完全搞清楚，但国 内外的专家学者通过研究，从红茶菌的性质和成分出发初步阐述了其作用机 理。 2 5 1 清理肠胃，帮助消化，抑制有害菌，防治胃肠道疾病，预防结肠癌 的发生。红茶菌能降低胃的p h ，而胃肠道上部的酸化作用对健康很有益处，对 胃肠道中的有害菌如与胃炎、胃溃疡和胃癌有密切关系的幽门螺杆菌等有拮抗 作用，还可以预防结肠癌的发生【3 0 】。k i m 等人( 1 9 9 4 ) 在对肠道细菌的葡萄糖苷 酶和葡萄糖苷酸酶的特性的研究中发现，这两种酶的活性随着p h 的升高而增 强，在p h 7 时的活性是p h 6 时的5 1 0 倍，他们认为高p h 环境可以诱导这两 种酶的活性，从而导致结肠癌的发生i ”j 。 2 5 2 饮用红茶菌可以维持血液正常的p h 值。医学研究表明癌症患者血 液p h 值为7 5 6 ，而正常肌体的血液p h 值为7 5 以下。静脉血的血清学检测表明红 茶菌饮料可以显著地使血液保持正常的p h 值，这一发现对研究红茶菌预防和治 疗早期癌症的原因有重要的意义【”。 2 5 3 红茶菌中的主要成分一醋酸，是对健康非常有益的物质。现代医学 证明，醋酸具有消除疲劳、增强食欲、帮助消化、防治高血压和动脉硬化的作 用，还具有一定的抗肿瘤、防肥胖，使钙易于被人体吸收、保持骨骼的柔韧以 及润肌嫩肤的作用【3 2 】。 2 5 4 许多人认为红茶菌的解毒抗癌功能因子之一是葡萄糖醛酸，它是人 体肝脏中最主要的解毒物质之一。葡萄糖醛酸可与外源的毒素或人体代谢产生 的内源有毒物质相结合，变成水溶性的葡萄糖苷酸，并一起排出体外，从而使 可能引起身体各种病变的或已经发生病变的毒素被及时清除，起到防病和治病 的良好效果【4 】。 2 5 5 红茶菌中存在的葡萄糖二酸1 ，4 内酯可使肝素、透明质酸、硫酸粘 多糖以及葡萄糖醛酸的破坏大大减少，帮助身体更有效地排出毒素，防癌抗 癌，并缓解关节炎、痛风、气喘和相关组织功能下降所引起的其它不适【3 3 l 。陈 暄【3 4 1 等人在茶叶和红茶菌中的有效成分对人体肠道生态平衡的作用这篇文章中 有些红茶菌功能性成分报道。红茶菌中醋酸菌，酵母菌，乳酸菌的共生发酵作 用，能够产生一些中间产物，如葡萄糖二酸1 ，4 内酯及葡萄糖酸对人体有抑 菌，解毒，抗癌的作用。 2 5 6 红茶菌中的葡萄糖酸能与重金属结合形成水溶性复合物，帮助人体 排出有害的重金属元素。有研究表明新的红茶菌饮用者尿中的重金属含量增加 【3 5 1 。 2 5 7 红茶菌中含有不少茶叶的浸出物，这些浸出物的保健作用是不容忽 视的。据古今研究，茶的保健功能多达3 0 余项，其中主要的有兴奋神经、强心 扩管、兴奋呼吸、抗凝血、降血脂、预防冠心病、利尿、助消化、解毒与抗 菌、防癌、抗辐射等。茶多酚具有抗突变功能，是一种天然抗氧化剂，能延缓 人体衰老；茶中的绿原酸、儿茶素、v c 、v e 等都有保护皮肤的功能【3 6 1 。 c d u f r e s n e 研究总结了红茶菌饮料具有抵抗癌症，抵抗心血疾病，提高消化能力， 刺激免役系统，减少发炎问题等有很大的作用【3 7 1 。p a u l i n et 等采用不同剂量即 正常5 倍、1 0 倍喂养老鼠时发现红茶菌发酵液具有抗疲劳，保护肝脏的功能删。 p d i p t i 等研究采用铅诱导氧化压力法分析，红茶菌发酵液有抗氧化和提高免役 的能力【捌。 红茶菌中还有许多有益健康的已知或未知成分，它有益健康的缘凶小是其 中某种物质的单独作用而是多种有益成分共同作用的结果，它对人体的保健作 用也是多方面的。近些年来，欧美一些国家在红茶菌的i 临床应用效果上有了进 一步的研究。比如，美国的y o r a ma z r a d 在1 9 9 8 年报道了艾滋病病人饮用红茶 菌6 个月的临床效果，结果表明病人的临床状况有了很大的改善，而且在此期间 没有发生可能的各种感染m o 。a n i t a h a r t m a n 等利用小鼠长期饮用红茶菌对生 长寿命，食欲变化。器官等进行跟踪比较发现对照组的各个方面均比长期饮用的数 据差些但是对人体的效果有待检验【4 1 1 。r v i j y a r a g h a v a n 等研究了红茶菌饮料 的毒性利用不同的剂量喂养健康的老鼠连续9 0 天，结果没发现中毒的现象嘲。 2 6 红茶菌产品的开发嗍 红茶菌饮料是家庭式培养而成的，其工业化放大生产比较困难，目前尚无 红茶菌的工业化生产。l i u c h i - h s e i n 等人在1 9 9 9 年提出利用二次发酵法进行 红茶菌工业化生产，并研究了二次发酵过程中发酵参数的调控嗍。其研究结果 表明，二次发酵法进行红茶菌工业化放大生产是可行的，这为红茶菌饮料工业 化生产提供了研究思路。 2 7 发展的趋势 从目前国内红茶菌的研究报道来看，我们的研究水平仍然是处于一个起步 的阶段。大量的研究表明，红茶菌饮料的研究开发是一个新兴的课题，采用通 过对传统微生物发酵的红茶菌的各方面研究为基础是值得继续发展的途径。综 合过去取得的成绩以及在研究中存在的问题，在研究过程中要注重以下几个方 面：一、加强适合红茶菌发酵的微生物菌种筛选；二、加强功能性红茶菌饮料 的研究与开发；三、加强红茶菌发酵理论和动力学研究，使红茶菌发酵有具体 的发酵模型和准确发酵参数等作为应用指导。四、拓展红茶菌的研究领域及应 用领域，为红茶菌在食品与其它行业的发展做出贡献。 3 本论文研究的目的和意义 近十年来，红茶菌在欧美一些国家和地区甚为流行。红茶菌保健功能研 旧业是方心未艾，特别是它的解毒抗癌和增强机体免疫能力等功能倍受关注， 越来越多的资料表明红茶菌是一种很有利用价值的天然微生物发酵产品【4 5 】。 但是，自古以来红茶菌一直以泡好的茶汁加入一定比例的糖将容器用纱布盖好 放在空气流通条件好的环境中自然发酵，得到一种表面形成菌膜而糖茶水变成 一种酸甜可口的饮料，然后将发酵液倒出，利用菌膜作为新的菌种发酵新茶汁 的家庭培养方式为主，由于受到环境中微生物较多且受季节影响很大等条件的 影响，容易受到杂菌的污染，同时很难控制产品的质量，以至于影响对它的开 发和利用。红茶菌虽然有多种保健作用，但由于它一直都是以混合菌种家庭培 养的方式被应用和流传的，而这样的方式存在许多的不利因素，从而限制了它 的应用和发展。比如，受到接种条件的影响，容易造成杂菌的污染；室温过低 不仅要延长培养时间，也容易造成污染；混合菌种的保存也存在问题，如保存 时间短，菌种活力下降，杂菌污染等等。为避免以上不利因素的影响，应在深 入研究的基础上，实现工业化生产，生产出卫生优质，功能性成分含量高，适 合各种人群需要的系列产品，充分发挥它的保健作用。 要研究开发功能性茶菌饮料，实现工业化生产，首先要从现有的红茶菌中 分离得到各个纯菌种并了解菌种的分类地位，并且将传统红茶菌中优势微生物 分离出来。只有得到了纯菌种和优势微生物，才能解决菌种保存时间、接种量 的控制、杂菌控制、保持菌种活力和控制产品质量等多方面的问题，才有可能 对每一个菌种以及它们的各种组合的各种代谢特征、培养条件、培养液成分和 可能的功能效果进行深入细致的研究。 本课题鉴于上述存在的问题，希望通过对提供的红茶菌菌源的菌种的分 离，鉴定以及红茶菌的菌相，代谢产物尤其是儿茶素的研究，为红茶菌的应用 奠定良好的理论基础。 4 本论文的研究内容 本试验的研究工作主要包括以下几个方面： ( 1 ) 红茶菌中优势菌种的分离与鉴定。 ( 2 ) 红茶菌菌相的研究。 ( 3 ) 红茶菌发酵过程中主要代谢产物变化规律的研究。 一8 - 第二章红茶菌优势菌种的分离与鉴定 引言 红茶菌饮料是以糖茶水为原料，经醋酸菌、酵母菌和乳酸菌等多种微生物 自然发酵而成的，可直接饮用，也可再添加其它辅料饮用，人们俗称“红茶 菌”【9 】，又称之为“海宝”。但也有研究报告报道用于发酵培养红茶菌的微生 物主要是醋酸菌和酵母菌，没有发现乳酸菌。本试验拟对湖南农业大学茶叶 研究所提供的含菌膜的红茶菌发酵液进行了其优势菌种的分离纯化及菌种的鉴 定。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 菌源 含菌膜的红茶菌发酵液；由湖南农业大学茶叶研究所提供 1 1 2 菌源活化培养基 绿茶6 9 ，蔗糖l o o g ，自来水1 0 0 0 m l 。配制方法是：将沸水冷却至8 5 c 9 0 c 时，加入绿茶，保持2 0 m i n ，滤去茶渣，然后在茶液中加入蔗糖混匀，分装至 5 0 0 m l 三角瓶中，每瓶装液量3 0 0 r a l ，牛皮纸包扎后，进行巴氏灭菌，冷却至室 温备用。 1 1 3 菌种分离用培养基【4 7 。5 0 l 1 1 3 1 醋酸菌培养基 a 培养基：葡萄糖2 0 9 ，酵母膏l o g ，碳酸钙2 0 9 ，琼脂2 0 9 ，蒸 馏水9 6 5 m lp h6 8 ，分装于容器为5 0 0 m l 的三角瓶内( 每瓶装4 0 0 r a l ) 和2 0 2 0 o m 的试管中( 每管5 m 1 ) 。1 2 1 灭菌2 0 r a i n ，冷却至5 0 1 2 左右时，加入 3 5 m l9 5 无水乙醇。上述培养基中不加琼脂即为液体培养基。 a 2 培养基：葡萄糖l o o g ，酵母浸出物l o g ，碳酸钙2 0 9 ，琼j 指2 0 9 ， 蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 6 8 ，分装于容器为5 0 0 m l 的三角瓶内( 每瓶装4 0 0 m 1 ) 和 2 o 2 0 o m 的试管中( 每管5 m 1 ) 。1 2 1 c 灭菌2 0 m i n 。上述培养基中不加琼脂 即为液体培养基。 g y c 培养基( 醋酸菌产色素判断用) ：葡萄糖5 0 9 ，酵母膏l o o g ，碳酸钙3 0 9 ， 琼脂2 5 9 ，自来水1 0 0 0 m l ，充分溶解后分装于容器为5 0 0 r a l 的三角瓶内( 每瓶装 4 0 0 m 1 ) 和2 0 2 0 o c m 的试管中( 每管5 m 1 ) 。1 2 1 灭菌3 0 m i n 。 1 1 3 2 酵母菌培养基 y 培养基：马铃薯( 去皮) 2 0 0 9 ，蔗糖( 葡萄糖) 2 0 9 ，自来水 1 0 0 0 m l ，琼脂2 0 9 。制法：将市售马铃薯洗净去皮称取2 0 0 9 ，切成小块，加水1 l ，煮沸3 0m i n ，自来水定容至1 0 0 0 m l ，用双层纱布过滤得到汁液，按蔗糖2 和 琼脂2 加入滤液中，煮沸溶解补加蒸发水分后分装于容器为5 0 0 r a l 的三角瓶内 ( 每瓶装4 0 0 m 1 ) 和2 0 x 2 0 锄的试管中( 每管5 m 1 ) 。于1 2 1 灭菌3 0 r a i n ，经过 无菌检查后备用。上述培养基中不加琼脂即为液体培养基。 y 2 培养基：麦芽膏2 0 9 ，琼脂2 0 9 ，自来水1 0 0 0 m l ，加热充分溶解后分装 于容器为5 0 0 m 的三角瓶内( 每瓶装4 0 0 r a l ) 和2 0 2 0 o 伽的试管中( 每管 5 m 1 ) 。1 2 1 灭菌3 0 r a i n 。上述培养基中不加琼脂即为液体培养基。 y 3 酵母一葡萄糖一蛋白胨培养基：用5 9 干酵母粉，l o g 蛋白胨，2 0 9 葡萄糖与 1 0 0 0 m l 水制成液体培养基，不调p h 值，加琼脂2 0 9 制成平板培养基和斜面培养 基。1 2 1 灭菌1 5 m i n 。 y 4 麦芽汁培养基：l k g 大麦芽粉与2 6l ；c k 混合在4 5 c 下进行搅拌保持3 d , 时，然后温度升到6 3 保持l 小时。过滤后，1 2 1 灭菌1 5 m i n ，再过滤并加水稀 释到1 5 波林，值调整约为5 4 。对于麦芽汁琼脂，将麦芽汁调至1 0 波林，再加入 2 的琼脂( w v ) ，该培养基在11 0 高压灭菌1 5 m i n 。 1 1 3 3 乳酸菌培养基 l 1 号( 番茄汁聚胨培养基分离乳杆菌) 培养基：聚蛋白胨5 9 ，葡萄糖 l o g ，酵母浸膏5 9 ，罐头番茄汁1 5 0 m l ，溴甲酚绿0 0 3 9 ，山梨酸1 2 9 ， c a c l z 2 h 2 00 1 2 9 ，n a c l0 1 2 9 ，k h z p 0 40 5 9 ，k c l0 1 2 9 ，m g s 0 4 7 h z o 0 1 2 9 ，m n s 0 4 4 1 h o0 1 2 9 ，琼脂1 5 9 ，蒸馏水8 5 0 m l ，分装于容器为5 0 0 r a l 的三角瓶内( 每瓶装4 0 0 m 1 ) 和2 0 2 0 o a n 的试管中( 每管5 m 1 ) 。1 2 1 灭 菌2 0 r a i n 。p h 5 0 ，1 2 1 灭菌3 0 r a i n 。上述培养基中不加琼脂即为液体培养 基。 k 号( g y p 培养基分离芽孢乳杆菌) 培养基：葡萄糖2 0 9 ，酵母提取物 5 9 ，蛋白胨5 9 ，琼脂1 5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 1 1 ，分装于容器为5 0 0 1 1 的三角瓶内 ( 每瓶装4 0 0 r a l ) 和2 0 2 0 o c m 的试管中( 每管5 m 1 ) 。1 2 1 灭菌2 0 r a i n 。上 述培养基中小加琼脂即为液体培养基。 l 3 号( h p 培养基分离明串珠菌) 培养基：植物蛋白胨2 0 0 9 ，酵母提取物 6 o g ，肉浸膏1 0 o gf e s o ，7 h ：00 0 4 9 ，m g s o 。7 h 。00 2 9 ，葡萄糖1 0 9 ， 吐温8 00 5 9 ，m n s 0 4 4 h z 00 0 5 9 ，柠檬酸铵5 o g ，琼脂2 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ， 分装于容器为5 0 0 m l 的三角瓶内( 每瓶装4 0 0 m 1 ) 和2 o x 2 0 o m 的试管中( 每管 5 m 1 ) 。1 2 1 灭菌3 0 m i n 。上述培养基中不加琼脂即为液体培养基。 l 4 号( m r s 培养基分离乳杆菌) 培养基：蛋白胨1 0 o g ，酵母提取物 5 0 9 ，肉浸膏1 0 o g 吐温8 0l m l ，葡萄糖2 0 o g ，k , h p o , 2 0 9l i g s 0 4 7 2 0 0 5 8 9 ，m n s o 。4 1 2 00 2 5 9 ，乙酸钠5 o g ，柠檬酸二铵2 o g ，琼脂2 0 9 ，蒸 馏水1 0 0 0 m l ，p h 6 2 6 4 分装于容器为5 0 0 r a l 的三角瓶内( 每瓶装4 0 0 r a l ) 和 2 o x 2 0 o e m 的试管中( 每管5 m 1 ) 。1 2 1 灭菌3 0 r a i n 。上述培养基中不加琼脂 即为液体培养基。 1 1 4 鉴定用培养基 糖发酵基础培养基，同化碳源基础培养基，乙醇氧化基础培养基，同化 氮源基础培养基，产淀粉类化合物培养基，产酯培养基，产酸培养基，无维生 素基础培养基，明胶培养基，g o r o d k o w a 琼脂培养基均参照文献【5 1 4 】制备。 1 2 主要仪器设备 洁净工作台h d 一9 2 0 型哈尔滨市东联电子技术有限公司北京分公司 振荡器h z q q中国哈尔滨东联电子技术开发公司 血球计数板x b k - 2 5国营上海医用光学仪器厂 显微镜 o l y m p u sc x 4 1日本奥林巴斯株式会社 电子天平1 0 c 3 0 c s w i t z e r l a n d 离心机l d 5 2 h 北京医用离心机厂 显微镜测微尺 国营上海医用光学仪器厂 1 3 主要药品与试剂 马铃薯市售 胡萝卜市售 绿茶市售 葡萄糖分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂厂 蔗糖分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂厂 乳糖分析纯上海恒信化学试剂有限公司 麦芽糖 分析纯上海恒信化学试剂有限公司 棉子糖分析纯上海恒信化学试剂有限公司 酵母膏分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂厂 d - 半乳糖分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂厂 纤维二糖分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂厂 碳酸钙分析纯 n a c l分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂厂 n a o h分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂厂 氯化铁分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂厂 蛋白胨生化纯中国医药( 集团) 上海化学试剂厂 9 5 无水乙醇分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂厂 美兰染色剂湖南湘中地质实验研究所 溴酚兰指示剂天津市科密欧化学试剂开发中心 1 4 菌种的分离与纯化方法 1 4 1 菌源活化方法 在备好的菌源活化培养基中2 h a 5 ( v v ) 的红茶菌菌液，并央取- - 4 , 块菌 膜同时放入该活化培养基中摇匀，4 层无菌纱布封1 ：2 ，2 8 c 静止培养。制备成未 经再加工的红茶菌发酵液。 1 4 2 红茶菌发酵液中菌种的分离和纯化方法 将已活化的红茶菌发酵液振荡均匀，在无菌操作条件下，吸取l o m l 的菌液 并夹- - d , 块菌膜放入带玻璃珠的9 0 m l 的无菌生理盐水中，充分振荡使溶液混匀 后，吸取5 m l 放入到4 5 m l 的无菌生理盐水中，依次稀释成l o 2 、l o - 3 、 l 酽、lo - 5 、l 酽。分别吸取1 0 4 、1 0 。5 、l 驴等3 个浓度的菌液各0 1 m l 至不同的分离培养基 的平板上，用玻璃涂布器将菌悬液涂布均匀后进行培养，醋酸菌3 0 1 2 培养3 d 5 d ，酵母菌2 8 c 培养2 d 3 d ，乳酸