（环境工程专业论文）农业废物好氧堆肥中氨氧化菌的研究.pdf

i l i l l l li l li l l li lu1 1 111l 19 0 5 6 3 4 t h er e s e a r c ho na m m o n i a o x i d i z i n gb a c t e r i ad u r i n ga g r i c u l t u r a l w a s t ec o m p o s t i n g y u y o n g m s ( h u n a nu n i v e r s i t y ) 2 0 0 9 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fe n g i n e e r i n g m e n v i r o n m e n t a l e n g i n e e r i n g i n t h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o rz e n gg u a n g m i n g m a y ，2 0 1 1 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行 研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：謦痒 日期：弘年占月二日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文 的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 导师签名： 日期：1 1 年占月二日 坎日期：汕1 1 年 b 月二日 n 农业废物好氧堆肥中氨氧化菌的研究 摘要 堆肥化用于处理农业废物已经得到了广泛的应用，但由于堆肥化过程中氮素的损失 会产生臭气并导致堆肥产品质量的下降，研究堆肥过程中氮素的转移转化规律具有重要 的实际意义。氨氧化细菌( a m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i a ，a o b ) 能将氨氧化为亚硝酸盐， 是硝化过程的第一步，也是其中的限速步骤，在氮素循环过程中起着重要的作用。在农 业废物好氧堆肥过程中以氨氧化细菌为切入点，采用分子生物学的方法研究其群落结构 的演替及其与环境因子之间的关系，揭示堆肥中氮素转移与转化规律，可以为优化堆肥 工艺，减少氮素损失提供理论指导。 本研究利用秸秆等原料对农业废物好氧堆肥过程进行模拟，在堆肥的不同时间进行 取样，对堆体温度、p h 、含水率、n i - h + - n 、n 0 3 - n 等环境因子进行监测。结果显示， 堆肥高温期( 5 0 ) 维持了8 天，最高温度达到了5 5 6 ，满足杀灭动植物病原菌 的要求；p h 整体在6 5 9 8 7 6 范围内波动，至堆肥结束时呈碱性，有利于微生物有效 的发挥作用。堆肥前期n h 4 + - n 含量波动上升，在第6d 达到最大值l6 2 8m g k 9 4 ( 以 干样计) 之后含量呈下降趋势；而n 0 3 - n 含量在堆肥初期有短期上升，2 1 2 d 逐渐下 降，整体处于较低水平，而在堆肥中后期逐渐增加，当堆肥结束时，达到5 5 2 2m g k 9 1 ( 以干样计) 。从各个环境因子来看，实验室模拟农业废物好氧堆肥过程较为成功。 应用聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳( p c r d g g e ) 技术对农业废物好氧堆肥 过程中氨氧化细菌种群结构随时间的变化情况进行了研究，结果表明，a o b 群落的 s h a n n o n - w e a v e r 指数初始值为2 5 8 ，堆肥结束时为2 0 2 ，多样性整体呈下降趋势。通过 对部分优势条带进行克隆测序，发现n i t r o s o s p i r a 和n i t r o s o m o n a s 为堆肥中a o b 的优势 种属，其中n i t r o s o m o n a s 存在于整个堆肥过程中，是耐受性较强的种属。 使用c a n o c o4 5 软件对获得的氨氧化细菌种群数据与不同时期堆体温度、p h 、含 水率、n h 4 + - n 、n 0 3 - n 等环境因子的相关性进行冗余分析( r e d u n d a n c ya n a l y s i s ，r d a ) 。 r d a 二维排序图显示堆肥前期样点分布较为集中，后期样点分布较为分散，表明a o b 群落结构在堆肥高温期前期( 4 9d ) 变化较小，而在高温期后期( 9 1 2d ) 特别是降 温期( 1 2 2 5d ) 演替尤为剧烈。基于手动选择的r d a 分析结果表明，堆体温度、n h 4 + n 和n 0 3 - n 对a o b 群落演替有着显著的影响( p w s c c n n i - 1 4 - n 含水率 p h 环境温度，其中，堆体温度、w s c 、 n 0 3 - n 、n i - l , + - n 对细菌种群的影响极显著( 尸 5 0 ) ，并在第6d 达到最高温度5 5 6 ，高温期持续8d ， 保证了堆肥的卫生学指标和堆肥腐熟条件例。堆肥后期，温度降到环境温度，并不再发 生明显的变化。堆肥过程中p h 在6 5 9 8 7 6 范围内波动，堆肥结束时呈碱性。 p 倒 瘸 兰 辫 图2 1 堆肥过程中堆体温度及p h 的变化 温度是影响微生物活性的一个重要因素，因此也成为反应堆肥进程的一个重要标 准。按照堆体温度的不同，可以将本次模拟堆肥过程划分为四个阶段：潜伏阶段( 0 2 d ) 、中温增长阶段( 2 4d ) 、高温阶段( 4 1 2d ) 和熟化阶段( 1 2 3 5d ) 。在潜伏阶 段，微生物开始适应新的环境，也称这个过程为驯化阶段。中温增长阶段嗜温性微生物 最为活跃，在它们的参与下，堆肥中的有机物质大量的降解，由于这个生物过程是放热 过程，导致堆体温度的不断升高。当温度高于5 0 的阶段被成为高温期，这个过程中， 嗜热微生物大量的繁殖，嗜温微生物的活性受到抑制甚至是死亡。随着有机物的逐渐被 消耗，微生物由于养料受限活跃程度降低，因此，这个过程温度不会持续升高。熟化阶 段剩余的有机物大都为难降解的有机物，随着温度的下降，嗜温性微生物又重新开始起 主导作用，对难降解的有机物进行进一步的分解，使腐殖质趋于稳定化。由于硝化细菌 生长的较为缓慢，硝化反应通常是在这个阶段较多的发生，将氮素转化为硝酸盐，对于 堆肥产品质量的提高来说，是一个关键的过程。 p h 并不对堆肥化过程中有机质的降解造成直接影响，但是它却对微生物的生长有 硕士学位论文 重要影响。堆肥过程中p h 的变化与堆肥体系微生物活动以及有机氮的氨化作用和矿化 作用密切相关：堆肥初期，堆料中的有机物在微生物的作用下得到分解，这个过程会有 有机酸产生，因此，在堆肥初期，p h 呈酸性。随着有机酸逐步被降解，p h 逐渐上升， 最终达到8 9 之间。另外，在堆肥过程中，有机氮在堆肥被快速转化为n h 4 + - n 并积累 6 0 1 ，氨氮的积累同时也造成了p h 的升高。 2 3 2 环境温度与含水率 图2 2 为堆肥过程中堆体含水率和环境温度随时间的变化情况，由于定期对堆体进 行水分的补充，整个堆肥过程，含水率基本保持在4 0 6 5 范围内。基本能够保证微 生物适宜生长的水分环境，可以满足堆肥顺利的开展。堆肥过程中环境温度有一定的波 动，与堆体温度相比较，会发现堆肥最后几天，堆体温度与环境温度基本接近，这样表 明堆肥过程的完成。 堆肥初期，有机物被大量分解，微生物的活动较为频繁，大量热量的释放会导致堆 体体系中水分随蒸发而散失，因此，图中前5 天含水率急剧下降。但由于水分的补充， 含水率稳定在某一范围内。 莲 姗 * 钿 图2 2 堆肥过程中堆体含水率及环境温度的变化 2 3 3 n h 4 + - n 与n 0 3 一n 图2 3 为堆肥过程中堆体n h 4 + - n 和n 0 3 - n 随时间的变化情况，由图2 3 可知，堆 肥前期n i - 1 4 + - n 含量波动上升，在第6d 达到最大值16 2 8m g k g d ( 以干样计) 之后含 量呈下降趋势；而n 0 3 - n 含量在堆肥初期有短期上升，2 1 2 d 逐渐下降，整体处于较 低水平，而在堆肥中后期逐渐增加，当堆肥结束时，达到5 5 2 2m g k 9 1 ( 以干样计) 。 农业废物好氧堆肥中氨氧化菌的研究 磊 誓 旨 卿 钿 z + 叶 受 璺 6 d 逞 涸 妇 本 分 z 图2 3 堆肥过程中n h 4 + - n 和n 0 3 o n 的变化 这些变化主要与堆肥微生物的活性和堆肥状况有关：堆肥初期，堆料中存在有氨氮 和硝态氮，由于硝化细菌的硝化作用存在，将氨和氨化物转化为硝酸根；随着堆肥的进 行，有机氮在堆肥被快速转化为n h 4 + - n 并积累【6 l 】，氨氮的积累同时也造成了p h 的升高， 2 1 2d 对应的阶段温度较高，硝化细菌多属嗜温菌，对温度尤为敏感，当温度高于4 0 时，硝化作用将受到严重的抑制【6 2 】随着堆肥温度的降低，硝化细菌快速生长，n h 4 + - n 转化为n 0 3 - - n 。 2 4 小结 实验室模拟农业废物好氧堆肥过程，对堆体温度、p h 、含水率、水溶性n h 4 + - n 和 n 0 3 - n 等环境因子的变化情况进行了监测，来反映堆肥过程。从堆体温度来看，高温 期( 5 0 ) 维持了8 天，最高温度达到了5 5 6 ，满足杀灭动植物病原菌的要求， 堆肥进行2 5 天之后，温度逐渐降至环境温度，表示堆肥过程的结束。从p h 来看，此次 堆肥过程p h 整体在6 5 9 8 7 6 范围内波动，至堆肥结束时呈碱性，有利于微生物有效 的发挥作用。堆肥前期n i u + 一n 含量波动上升，在第6d 达到最大值16 2 8m g k g d ( 以 干样计) 之后含量呈下降趋势；而n 0 3 n 含量在堆肥初期有短期上升，2 1 2d 逐渐下 降，整体处于较低水平，而在堆肥中后期逐渐增加，当堆肥结束时，达到5 5 2 2m g k g d ( 以干样计) 。其变化规律与好氧堆肥过程中微生物活动相符。 从各个监测因子的变化情况来看，实验室模拟农业废物好氧堆肥过程较为成功，可 以用于进行后续的研究。 硕十学位论文 第3 章农业废物好氧堆肥过程中氨氧化菌群落结构的研 究 氨氧化细菌( a m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i a ，a o b ) 能将氨氧化为亚硝酸盐，这一反 应是硝化过程的第一步，也是其中的限速步骤【6 2 1 ，在氮素循环过程中起着重要的作用。 由于a o b 的生长速率相当低，生物量很少，采用传统的细菌分离培养方法进行研究相 当的费时和繁琐【5 7 】，而且还有许多自然界存在的a o b 种属未能在实验室纯培养获得 d 4 1 。以变性梯度凝胶电泳技术为代表的分子生物学技术的发展可以有效地弥补传统纯培 养方法中的不足，并具有可重复性强、操作简单等优点，在复杂环境微生物群落结构动 态变化的研究中起到了重要的作用6 3 “6 1 已有研究表吲6 n 9 1 ，土壤、淡水环境中a o b 的 优势种群为n i t r o s o m o n a s 和n i t r o s o s p i r a ，海洋沉积物中主要为n i t r o s o s p i r a 1 i k e 菌。a o b 的种群结构受温度、铵浓度、酸度等环境因素的影响较大。 本实验以a o b 为研究对象，采用p c r - d g g e 技术研究其群落结构的演替，并对优 势条带进行了切胶测序，掌握了堆肥不同时段起主导作用的优势a o b 种群，对于揭示 堆肥中氮素转移与转化规律具有重要的意义。 3 1仪器设备 高速离心机：t g l 1 6 h ，h e m a ，珠海； 冷冻高速离心机：5 4 1 5 r ，e p p e n d o f , g e r m a n y ； p h 计：p b l 0 ，s a r t r i u s ，g e r m a n y ； 精密电子天平：f a 2 0 0 4 n ，精科，上海； 涡旋混合器：q l 9 0 1 ，琪特，上海； 灭菌锅：h v 5 0 ，h i r a y a m a ，j a p a m p c r 仪：m y c y c l e r ，b i o r a d ，u s a ： 琼脂糖凝胶电泳系统：e p s 6 0 2 ，晴桑电子，上海； 超纯水仪：m i l l i q ，m i l l i p o r e ，u s a ； 凝胶成像系统：g e ld o e 2 0 0 0 ，b i o r a d ，u s a ； d g g e 电泳仪：d c o d e t mu n i v e r s a ld e t e c t i o ns y s t e m ，b i o r a d ，u s a ； d g g e 电泳电源：b a s i cp o w e r p a c2 0 0 ，b i o r a d ，u s a ； 恒温水浴锅：h h 2 数显恒温水浴锅； 农业废物好氧堆肥中氨氧化菌的研究 灭菌操作台：c a 9 2 0 3 垂直层流洁净工作台； 振荡器：h y 7 大容量定时调速振荡器； 超声波仪：d i g i t a ls o n i f i e rm o d e l4 5 0 ，b r a n s o n ，u s a ； 3 2 主要试剂及其配比 c a c l 2 、t r i s h c i 、e d t a ，n a 3 p 0 4 、十六烷基三甲基溴化铵( c 吖出) 、蛋白酶k 、 溶菌酶、溶壁酶、1 2 0 m m o l lp h8 0 磷酸缓冲液、十二烷基磺酸钠( s d s ) 、氯仿、异 戊醇、异丙醇、无水乙醇、p 。巯基乙醇、核糖核酸酶、脱氧核糖核苷酸( d n t p ) 、t a qd n a 聚合酶、牛血清白蛋白( b s a ) 、过硫酸铵( a p s ) 甲基乙二胺( t e m e d ) 、硫酸铵、 丙稀酰胺，甲叉双丙稀酰胺、尿素、溴化乙啶，t a qd n a 聚合酶、1 0 x b u f f e r 、s y b rg r e e n i 核酸染料、溴酚蓝染料。以上试剂均为分析纯。 5 0 x t a e - 2 4 2 9t r i s 碱，5 7 1 m l 冰乙酸，o 5 m o l le d t a ( p h = 8 0 ) 1 0 0 m l ，加去离 子水定容至1 0 0 0 m l ，混合后高温灭菌2 0 - 3 0 m i n ，室温保存。 lx t a e ：5 0 x t a e1 4 0 m l ，加去离子水定容至7 0 0 0 m l 。 1 0 s d s ( 十二烷基硫酸钠) ：9 0 0 m l 水中溶解1 0 0 9 电泳级s d s ，加热至6 8 0 助 溶，加入几滴浓盐酸调节p h 至7 2 ，加入水定容至1l ，分装备用。 2 0 m g m l 蛋白酶k - 2 0 m g 溶于l m l 灭菌双蒸水。 0 5 me d t a ( p h = 8 0 ) ：1 8 6 1 9e d t a 溶于8 0 0 m l 灭菌双蒸水中，用n a o h 调节p h 至8 o ，定容至1 l ，高压灭菌。 d n a 提取液：1 2 1 1 4 9 t r i s ，2 9 2 2 5 9 e d t a ，1 4 2 9 n a 2 h p 0 4 ，8 7 7 5 9 n a c l ，1 0 9 c t a b 加蒸馏水定容至1 l ，调整p h 为8 0 。 t e 缓冲液：o 1 2 2 1 9t r i s ，0 0 2 9 2 9e d t a 与灭菌超纯水混合，定容至1 0 0 m l ，用h c i 调节p h 至8 0 。 磷酸盐缓冲液：0 0 1 m o l ln a 2 h p 0 4 与o 0 1 m o l ln a h 2 p 0 4 体积比按照9 4 7 ：5 3 混合， 用n a o h 调节p h 至8 0 。 p c r 试剂：t a qd n a 聚合酶、1 0 x b u f f e r 、4 种d n t p 、模板d n a 、m ：9 2 + 1 5 m m o l l 。 4 0 a c r y l a m i d e b i s ：3 8 9 3 9a c r y l a m i d e ，1 0 7 9b i s a c r y l a m i d e ，用去离子水定容至 1 0 0 m l 。 0 变性剂：1 5 m l4 0 a c r y l a m i d e b i s3 7 5 ：1 ( 生工，上海) ，2 m l5 0 x t a e 缓冲液 ( p h = 8 3 ) ，加入m i l l i q 水( m i l l i p o r e ，u s a ) 调到体积为1 0 0 m l ，然后使用0 2 2 1 a l 滤纸过滤并脱气15 m i n ，4 0 下保存于棕色瓶中。 3 2 硕：l 学位论文 1 0 0 变性剂：1 5 m l4 0 a c r y l a m i d e b i s3 7 5 ：1 ( 生工，上海) ，2 m l5 0 x t a e 缓冲 液( p h = 8 3 ) ，4 2 9 尿素( 生工，上海) ，4 0 m l 去离子甲酰胺( f ) ，加入m i l l i q 水( m i l l i p o r e ， u s a ) 调到体积为1 0 0 m l 。然后使用o 2 2p l 滤纸过滤并在真空干燥箱中脱气1 5 m i n ，4 下保存于棕色瓶中。 上样缓冲液：0 0 5 ( w v ) 溴酚蓝( 生工，上海) ，4 0 ( w v ) 蔗糖( 生工) ， 0 1 m m o l le d t a ( 生工，上海) ，p h _ 8 0 ，0 5 ( w v ) 十二烷基硫酸钠( 生工，上海) 。 a p s ( 1 0 ) ：1 0 ( w v ) 过二硫酸铵( a m m o n i u mp e r s u l f a t e ) ( 生工，上海) ，分 装2 5 0 1 a l 每份，2 0 保存。 t e m e d n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺( 生工，上海) 。 3 3 实验方法 3 3 1 堆肥样品的预处理 堆肥样品中含有大量腐殖质会干扰d n a 的提取，因此在提取d n a 前需要对样品 进行预处理。取0 5 9 堆肥样品于5m l 离心管中，加入3m lt e n p 缓冲液( 5 0 m m o l l 1 t r i s h c i ，2 0m m o l l 1e d t a ，1 0 0m m o l l n a c i ，p h = 1 0 0 ) ，充分涡旋5m i n ，5 0 0 0r m i n 离心1 0m i n 后弃上清，重复上述操作2 3 次，直至上清液颜色较为澄清；沉淀加入3m l 1 2 0m m o l l 。1 的磷酸盐缓冲溶液( p h = 8 0 ) ，充分涡旋混合，5 0 0 0r m i n 离心1 0m i n ，洗 涤直至上清液颜色较为澄清，沉淀用于后续研究。 3 3 2 堆肥样品d n a 提取 d n a 提取采用改进的蛋白酶k c t a b 法【7 0 】进行。步骤如下： l 、在洗涤好的样品中加入1 5m ld n a 提取液( 1 0 0m m o l l t r i s h c l ，p h = 8 0 ， 1 0 0m m o l l e d t a ，p h = 8 0 ，1 0 0m m o l l 1n a 3 p 0 4 ，1 4m o l l n a c i ，2 c t a b ) ， 剧烈振荡混匀后加入溶菌酶和蛋白酶k ( 均为1 0 此，1 0m g m l 。1 ) 。 2 、将混合好的样品置于3 7 、2 2 5r m i n 摇床上摇动4 0m i n ，加入2 0 0 此( 1 0 ) s d s ，6 5 水浴2 h ，每隔1 5 2 0 m i n 轻轻上下颠倒摇动。 3 、沉淀在室温4 0 0 0r m i n 下离心1 0m i n ，取上清，转移至新的5i i l l 离心管中，再 加入o 5m ld n a 提取液和5 0l x l ( 1 0 ) 的s d s ，6 5 水浴1 0m i n ，重复操作后，合并 上清。 4 、在获得的上清液中加入等体积氯仿异戊醇( 体积比2 4 ：1 ) ，轻轻颠倒3 0m i n 混 合。5 0 0 0r m i n 下离心5m i n ，吸取水相转移至新的5m l 离心管，加入0 6 倍体积异 3 3 农业废物好氧堆肥中氨氧化菌的研究 丙醇室温沉淀1h ，1 1 0 0 0r m i n 下离心1 0m i n ，弃上清。 5 、沉淀以lm l 冰预冷的7 0 乙醇轻微振荡洗涤，4 c 下以1 3 0 0 0r m i n 离心3m i n ： 沉淀再以0 7m l 冰预冷的无水乙醇再次轻微振荡洗涤，4 c 下以1 3 0 0 0r m i n 离心2m i n 。 6 、沉淀自然风干，加入2 5 0p l t e 缓冲液溶解d n a 。取6w e 进行电泳走样，确认 粗提效果。将粗提得到的d n a 置于2 0 * ( 2 保存。 3 3 3d n a 的纯化 根据本实验堆肥的特点，采用北京天根生化有限公司生产的普通d n a 产物纯化 试剂盒纯化d n a ，以期能够尽可能去除其中的各类杂质。由于堆肥中的杂质含量相比 其他环境样品，杂质含量更高。因此，如果d n a 纯化的方法能够有效的去除堆肥样品 d n a ，则也一定会适用于其他样品。此试剂盒采用独特的离心吸附柱纯化d n a 片段， 具有快速多样高效等优点。操作步骤如下： 1 、柱平衡步骤：向吸附柱c b 2 中( 吸附柱放入收集管中) 加入5 0 0 “l 平衡液b l ， 1 2 0 0 0r m i n 离心1 分钟，倒掉收集按照以上方法提取到的d n a 为粗提的d n a ，其中含 有大量的其他杂质，如多糖、蛋白质、r n a ，最主要的是含有酶促反应抑制剂腐殖酸类 物质，因此，粗提d n a 溶液还需要经过纯化，才能够用于p c r 、d g g e 等后续的分析。 2 、估计p c r 反应液的体积，向其中加入5 倍体积的结合液p b ，充分混匀。将所 得溶液加入一个吸附柱c b 2 中( 吸附柱放入收集管中) ，室温放置2 分钟，1 2 0 0 0r m i n 离心3 0 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱c b 2 放入收集管中。注意：吸附柱容积为 8 0 0 此，若样品体积大于8 0 0w e 可分批加入。 3 、向吸附柱c b 2 中加入7 0 0w e 漂洗液p w ( 使用前请先检查是否已加入无水乙醇) ， 1 2 0 0 0r m i n 离心3 0 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱c b 2 放入收集管中。 4 、向吸附柱c b 2 中加入5 0 0w e 漂洗液p w ，1 2 0 0 0r m i n 离心3 0 秒，倒掉废液。 5 、将吸附柱c b 2 放回收集管中，1 2 0 0 0r m i n 离心2 分钟，尽量除尽漂洗液。将吸 附柱c b 2 置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 6 、将吸附柱c b 2 放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓 冲液e b ，室温放置2 分钟。1 2 0 0 0r m i n 离心2 分钟收集d n a 溶液。 3 3 4 琼脂糖凝胶电泳检验 琼脂糖凝胶电泳是最常用的实验室p c r 效果检验的方法。该技术具有操作简单、 扩增产物用量少、结果直观可靠、分离范围较广等优点，成为了d n a 分子片段的分子 硕士学位论文 量测定、分子构象研究以及d n a 分离纯化的重要实验手段。其原理是不同大小的d n a 分子由于所带电荷不同，在琼脂糖凝胶中电泳时受到电场驱动力和凝胶的摩擦阻力不同 导致其电泳速度不同，从而实现片段的分离。d n a 分子的迁移速度与相对分子量的对 数值成反比，不同长度的d n a 在电泳槽中迁移速度不同而得到分离。具有相同长度的 双链d n a 具有几乎相等的电荷，但由于其大小和构型的不同，会导致其在凝胶中所受 的摩擦阻力不同，d n a 片段电泳速度不同，得以分离。一般情况下，琼脂糖凝胶电泳 的检出率在1 1 0n gd n a 以上，分离范围为1 0 0b p 5 0k b p 。粗提和纯化过程之后， 可以通过此方法来观察所提取d n a 的效果如何。 其操作步骤为： 1 、准确称量琼脂糖干粉0 7 5g ，置于锥形瓶中，向其中加入1m l5 0 x t a e ，再加入 5 0m l 超纯水，用玻璃棒搅拌均匀，置于电炉上加热至琼脂糖熔化。放置一边冷却，待 温度降下来，倒入带有梳齿的合适大小的模具中，厚度适中，室温冷却。 2 、待胶完全凝结后，小心拔出梳子，轻轻撕去封边胶带，将凝胶安放到电泳槽内， 加样孔一侧靠近阴极。 3 、向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1m i l l 。 4 、向d n a 样中加入溴酚蓝和s y b rg r e e ni 核酸染料，混匀后，加入样孔中。具 体添加剂量见表3 1 。 表3 1 琼脂糖凝胶电泳加样量 5 、加样完毕后，关上电泳槽盖，接好电极插头。d n a 应向阳极( 红色插头) 侧泳动。 给予l 5v c m 的电压，其中距离以阳极至阴极之间的测量为准。若电极插头连接正确， 阳极和阴极由于电解作用将产生气泡。 6 、电泳时间2 0m i n 后取出凝胶，然后用b i o r a dg e ld o e2 0 0 0 凝胶成像系统观察 结果并拍照。 3 3 5p c r d g g e 3 3 5 1巢式p c r 农业废物好氧堆肥中氨氧化菌的研究 c t 0 1 8 9 f a b c 和c t 0 6 5 4 r 是针对氨氧化菌1 6 sr d n a 上一段特异性片段c t o 的引 物，是p - p r o t e o b a c t e r i a 的特异性引物对。已有研究表呼7 1 1 ，这对引物的特异性较强， 但敏感性较低。加之堆肥环境中j b - a o b 的丰度可能很低，单用此引物对扩增，可能导 致1 6 sr r n a 基因无法成功扩增，因此，采用基于1 6 sr d n a 的巢式p c r 。 第一轮p c r 选用f l - p r o t e o b a c t e r i a 的特异性引物对，正向引物为c t 0 1 8 9 f a b 与 c t 0 1 8 9 f c 的混合物，反向引物为c t 0 6 5 4 r 7 2 1 ，建立5 0 此的p c r 反应体系：2 x p o w e r t a qp c rm a s t e r m i x ( 北京b i o t e k e ) 2 5 此，引物c t 0 1 8 9 f a b0 6 此， c t 0 1 8 9 f c0 3 此7 3 1 ，c t 0 6 5 4 r0 9l x l ，d n a 模板2i l l ，无菌m i l i q 水补足5 0 肛l 。p c r 反应在m y c y c l e r ( b i o r a d ，u s a ) 上进行，扩增条件为：9 4 预变性4m i n ；9 4 变性4 5s ，5 6 退火4 5s ，7 2 延伸4 5s ，3 5 个循环；7 2 延伸7m i n ，停止于4 。 第二轮p c r 选用细菌1 6 sr d n a v 3 可变区特异性引物对g c 3 3 8 f 和5 1 8 r 1 7 4 1 ，以第 一轮p c r 产物为模板，5 0 此体系：2 p o w e rt a qp c r m a s t e r m i x2 5 此，引物各l 此， 模板0 8 “l ，无菌m i l i q 水补足5 0 此。扩增条件为：9 4 预变性4m i n ；9 4 变性 4 0s ，5 5 退火4 0s ，7 2 延伸lm i n ，3 5 个循环；7 2 延伸1 0m i n ，停止于4 。 两轮p c r 所使用的引物序列见表3 2 ，p c r 产物采用l 琼脂糖凝胶电泳检测。 表3 2 两轮p c r 所用引物 引物名称 引物序列( 5 3 ) c t 0 1 8 9 f a b c t i o l 8 9 c c t 0 6 5 4 r g c 3 3 8 f 5 1 8 r g g ag r a a a gc a gg g ga t cg g g a g g a a a g t a g g g g a t c g c t a g c y l n gt a g1 1 t c a a a c gc c g c c c gc c gc g cg c gg c g g g cg g gg c gg g g g c gg g g g c a c g gg g g g c ct a cg g g a g g c a g c a g a t t a c c g c g g c t g c t g g 3 3 5 2d g g e 采用美国b i o r a d 公司的d c o d e t m 基因突变检测系统对p c r 扩增产物进行电泳分 离，其电泳条件如下：以l t a e 作为电泳缓冲液，电泳所用变性胶浓度为8 ，变性 梯度范围在3 0 7 5 ，电泳温度为6 0 ，1 2 0v 电压下运行1 2h 。电泳结束后，采 用s y b rg r e e ni 对d g g e 凝胶染色3 0m i n ，在g e ld o e2 0 0 0 ( b i o r a d ，u s a ) 凝胶 成像系统下观察结果并拍照。 3 3 6 切胶测序 选择d g g e 胶上部分优势条带，在紫外灯下进行切割，置于1 5m l 离心管中编号， 硕学位论文 用7 0 的乙醇溶液洗涤，加入3 0 此的灭菌m i l i q 水溶解。将其放于4 c 冰箱中2 4 h ， 使条带中的d n a 得到充分的释放。采用不带g c 夹的3 3 8 f 和5 1 8 r 为引物对，进行p c r 扩增，扩增程序与巢式p c r 的第二轮扩增相同。扩增产物经l 琼脂糖凝胶电泳检验后 纯化，送交上海美吉基因技术公司进行克隆测序。测序结果提交g e n b a n k ，使用n c b i 网站中的b l a s t 将测序结果与数据库中已知序列进行同源性分析。 3 4 数据处理 采用q u a n i t i t yo n e ( v e r s i o n4 6 2 ，b i o r a d ，u s a ) 软件对d g g e 图谱进行分析， 去除背景值干扰后建立高斯模型对图像信息进行处理，可得到条带相对位置、相对亮度 值等条带信息。通过条带数目和亮度来评估农业废物好氧堆肥过程中a o b 群落多样性 和不同时期a o b 间的相似性。 a o b 群落多样性用s h a n n o n - w e a v e r 指数i t s 】来表示，表达式为： 胙, ( n i l n ) i n ( n i l n ) ，式中m 为第f 种的个体数，为种群中总的个体数，个体数用波 峰面积表示。a o b 指纹图谱的相似性用相似性系数( c s ) 来表示【7 6 】，表达式为： g = 2 j ( a + b ) x 1 0 0 ，其中：a ，b 分别代表堆肥高温阶段不同天数清晰的d g g e 条带数 目，j 指a ，b 中共有的条带数引7 7 1 。 3 5 结果与讨论 3 5 1 堆肥总d n a 提取结果 取堆肥第1 、2 、3 、4 、6 、9 、1 2 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 和3 5 天的样品，对其总d n a 进行提取，提取结果经1 琼脂糖凝胶电泳检验，在g e ld o e 2 0 0 0 凝胶成像系统( b i o r a d ， u s a ) 下对提取结果进行拍照分析，结果见图3 1 。 图3 1 样品总d n a 提取电泳图 检测结果显示d n a 无拖尾或降解现象发生，条带清晰、亮度均匀，表明所提取的 3 7 农业废物好氧堆肥中氨氧化菌的研究 总d n a 杂质较少，效果较好。蛋白酶k 法可以很好的对堆肥样品总d n a 片段进行提 取，提取前的预处理步骤十分关键，反复洗涤后，样品中大量干扰d n a 提取的腐殖质 等物质可以被有效的去除。 由于粗提得到的d n a 中仍然会存在一些蛋白质以及多糖类物质，d n a 浓度较低。 这些杂质会影响p c r 扩增时酶的活性，因此，还需经过进一步的纯化，获得纯度较高 的d n a 。本试验采用普通d n a 纯化试剂盒对所提d n a 进行纯化。纯化结果再次经1 琼脂糖凝胶电泳检验。 3 5 2p c r 产物检验 第一轮p c r 是基于氨氧化菌1 6 sr d n a 上一段特异性片段c t o 进行的，目的片段 长度大概在4 6 5 b p ，p c r 产物经过l 琼脂糖凝胶电泳检验，g e ld o c 2 0 0 0 凝胶成像系统 ( b i o r a d ，u s a ) 下拍照，结果见图3 2 。 图3 2 第一轮p c r 产物电泳结果 第一轮p c r 产物的条带亮度较弱，而且部分样品未看到条带，扩增效果不好。引 物c t o l 8 9 f a b c 和c t 0 6 5 4 r 是针对氨氧化菌1 6 sr d n a 上一段特异性片段c t o 的引物， 是 j - p r o t e o b a c t e r i a 的特异性引物对。已有研究表明，这对引物的特异性较强，但敏感 性较低。由于堆肥环境中i b - a o b 的丰度可能很低，单用此引物对扩增，可能导致1 6 s r r n a 基因无法成功扩增。因此，需要采用巢式p c r ，即在以c t 0 1 8 9 f a b c 和c t 0 6 5 4 r 为引物对的第一轮扩增后，以第一轮扩增产物为模板，增加以1 6 sr d n av 3 可变区特异 性引物g c 3 3 8 f 和5 1 8 r 为引物对的第二轮p c r ，可以有效的防止上述情况出现。 第二轮p c r 是基于1 6 sr d n av 3 可变区进行的，目的片段长度大概在2 5 0 b p ，p c r 产物经过1 琼脂糖凝胶电泳检验，g e ld o c 2 0 0 0 凝胶成像系统( b i o r a d ，u s a ) 下拍照， 结果见图3 3 硕士学位论文 图3 3 第二轮p c r 产物电泳结果 第二轮p c r 的扩增结果显示，各个样品均有亮带，且亮度较高，无拖尾和非特异 性扩增现象。表明p c r 扩增获得到了高产量和高特异性的p c r 产物，通过与m a k e ri 比较后，确定片段长度约为2 5 0 b p ，为目标片段长度。由于第二轮扩增采用的引物中加 入了g c 夹，其产物可以直接用于进行d g g e 电泳。 3 5 3d g g e 指纹图谱分析 3 5 3 1d g g e 图谱 堆肥过程中不同时期a o b 种群结构的d g g e 分析结果如图3 4 所示，其中数字和 字母分别代表取样天数和条带编号，每条泳道上不同位置的条带代表着不同的氨氧化细 菌种群，条带越多，说明种群越丰富；条带越亮，表示该条带所代表的相应的氨氧化细 菌的数量越多7 8 , 7 9 1 。各时期氨氧化细菌1 6 sr d n a 序列得n - ；较好的分离，条带位置清 晰，亮度明显。1 2 个泳道上共识别出2 0 条不同的条带，堆肥前期和高温期样品条带的 差异较小，后期相对较高，说明氨氧化细菌的群落结构随着堆肥的进行发生较为明显的 变化。这些变化与温度、p h 、氨氮和硝态氮浓度等细菌外界环境因素有着密切的联系【8 0 1 。 堆肥的不同阶段存在不同的氨氧化细菌优势种群，如堆肥的高温期主要有a 、b 、d 、g 和o ，堆肥后期主要有g 、k 、m 和n 。而部分条带( 如条带g ) 在堆肥过程的不同时期 均有出现5 说呀这些氨氧化细菌对环境条件变化的适应能力较强，可能在堆肥体系氨氮 的氧化过程中发挥着重要的作用。整体来看，堆肥前期，a o b 的条带数量较多，但亮 度不足，堆肥后期的条带数量较少，但亮度相对较高。 3 9 农业废物好氧堆肥中氨氧化菌的研究 飞 、 。静 鄂 。 冀 b a 3 j l 三：一：? _ 磁芝 。 c 。前d _ 一7 嘞孥昏驾删懈 矿，”帮簟一一馐基，爱篙薏是 矿一p ”鲫毋蛐哪。信眨崎_ _ 翎曩l ； 。 ；p ff 一4 一唾 。_ 。- 。_ ，：未：e 孳号i 叠 一一 雌 乍 磷f 静r _ 量 睁 叫 -_o _ 三 ， 苛亍? 零鬟乏彝 、 ： ， i ，摹螺心 _ “， 。 _。 一 图3 4 堆肥样品氨氧化细菌的d g g e 图谱( 数字和字母分别代表取样天数和条带编号) 3 5 3 2 名样性指数分析 l234 691 21 52 0 2 5 3 03 5 堆肥时闻d 图3 5 堆肥过程中氨氧化细菌多样性指数分布图 采用s h a n n o n - w e a v e r 公式，计算得到不同时期a o b 群落的多样性指数分布如图3 5 所示。从中可以看出，堆肥初期为2 5 8 ，堆肥结束的时候为2 0 2 。a o b 种群多样性在 堆肥的不同时段存在一定差异性，虽然第2 0 天的多样性指数较高，但从统计学意义上 来说，这个过程多样性指数整体呈下降趋势。 氨氧化细菌是严格的好氧自养型细菌，堆肥初期由于有机物含量相对比较丰富，氨 氧化细菌生长良好。随着堆肥过程的进行，堆体温度逐渐升高，不同种属的氨氧化细菌 对环境因子的敏感程度不剐8 1 1 ，对高温耐受性较强的种属得以保留，耐受性差的种属活 性降低甚至被淘汰，种群的多样性“减少。在堆肥二次发酵阶段，温度下降，受高温 影响活性降低的种属又表现出一定的活性【8 2 】。然而随着作为电子供体的n h 4 + 浓度降低， 易分解的有机物大部分分解，只剩下部分较难分解的有机物和新形成的腐殖质，微生物 的活性整体下降8 3 1 。 3 5 3 3c s 值分析 o 5 o 5 3 2 2 l 每赣帮掣棼蝓 硕上学位论文 采用q u a n t i t r o n e2 0 软件对d g g e 电泳图谱相似性( c s ) ( 表3 3 和图3 6 ) 进行分 析，结果显示，整体上图谱c s 不高，说明堆肥过程中氨氧化细菌经历了比较明显的时 序动态和更替。堆肥原料经过6 d 的升温后种群结构的c s 值为5 7 9 ，第4 天与随后堆肥 阶段的种群结构c s 值相对来说比较高。通过温度筛选的耐高温的细菌成为高温期的优 势种群。第1 2 天种群结构的c s 值明显下降为4 0 3 ，大量菌群在高温阶段被淘汰。到第 2 5 、3 0 天温度下降后种群结构的c s 值仅为2 0 8 和3 0 3 。这说明经过堆肥处理后微生态 结构的功能与组成都与堆肥原料之间存在很大的差异。 表3 3d g g e 图谱相似性c s 值的分析 图3 6 是由d g g e 电泳图得到的聚类分析结果，由图可以看出，可以将1 2 天的样 品分为六类，第1 3 天为一类，第4 天为一类，第6 天、第9 天为一类，第1 5 天、第 2 0 天为一类，第1 2 天、第3 0 天为一类，第2 5 天和第3 5 天为一类。堆肥前3 天的样品 相似度较高，说明在堆肥初期a o b 的组成及结构变化较小，从第6 天开始，出现较为 明显的变化。而第1 2 天的样品与堆肥后期的样品a o b 群落结构的相似度较高，也就是 在这个时候开始，出现较为剧烈的演替过程。 4 1 图3 7 切胶回收d n a 的p c r 重新扩增结果 由图3 7 所示，切胶后d n a 回收较为成功，经过重新一轮的p c r 扩增，条带单一、 清晰，亮度适中。与m a r k e r 相比较，确定扩增片段的长度约为2 5 0 b p 左右，为要扩增 4 2 硕：上学位论文 的目的片段。p c r 产物可以用于进行下一步的分析。 p c r 产物经上海美吉基因技术公司克隆测序，获得测序结果后，将结果录入n c b i 网站中进行比对，序列比对结果见表3 4 。经分析，条带d 可能代表n i t r o s o s p i r am u l t i f o r m i s a t c c2 5 1 9 6 ，仅在堆肥前期出现；条带g 可能代表n i t r o s o m o n a se u t r o p h ac 9 1