（发酵工程专业论文）微生物转化香兰素的初步研究.pdf

摘要 本文对s t r e p t o m y c e sl 1 9 3 6 转化香兰素的最佳培养基和培养条件以及发酵 液中香兰素、阿魏酸及其它副产物的检测方法等进行了初步研究，并对阿魏酸 制备进行了探索性实验。 确定了h p l c 法检测发酵液中阿魏酸、香兰素及其它副产物的条件。采用 薄层层析定性检测香兰素、阿魏酸，并建立了简便易行的分光光度法检测发酵 液中的香兰素。 运用正交设计理论确定了酶预处理黑麦麸皮的最佳条件：耐高温淀粉酶 量为4 0 干燥黑麦麸皮，1 3 9 8 蛋白酶为3 6 “堙干燥黑麦麸皮，糖化酶为4 0 0 g 干燥黑麦麸皮，缓冲液用量为3 0 0 m l 。碱水解提取阿魏酸最佳条件为：氢氧化 钠浓度为1 o ，提取温度为6 0 ，提取时问为6 h 。加入保护剂后，阿魏酸的 提取量可达3 1 1 4 m g g 黑麦麸皮。将提取物溶液进行减压浓缩后进行香兰素的 转化试验，香兰素产量达到o 1 7 4 9 l 。 对菌株s t r e p t o m y c e sl 1 9 3 6 的发酵培养基进行了优化：通过单因素试验，研 究了不同碳、氮源种类、无机盐对香兰素产量的影响。在单因素试验的基础上， 利用响应面分析法优化了培养基中影响香兰素转化的主要因素，通过分析求得 葡萄糖( x 1 ) 、酵母膏( x 2 ) 、m g s 0 4 7 h z o ( x 3 ) 的最佳浓度分别为1 0 9 l 、1 0 9 l 、 0 2 9 l 。最终确定s t r e p t o m y c e sl 1 9 3 6 的最佳发酵培养基为：葡萄糖1 o g ，酵母 膏1 0 9 ，m g s 0 4 7 h z o0 2 9 ，n a z h p 0 44 9 ，k h 2 p 0 4l g ，n a c lo 2 9 ，c a c l 2 2 h 2 0 o 0 5 9 ，水1 0 0 0 m l ，初始p h 值为7 4 。 对菌株s t r e p t o m y c e sl 1 9 3 6 的培养条件进行了优化，确定了最佳接种量为 6 ；最佳发酵温度为3 7 ；5 0 0 m l 的挡板三角瓶最佳装液量为5 0 m l ：摇床转 数为1 9 0 r m i n 。对底物阿魏酸的添加方式进行了研究，阿魏酸在菌体生长至稳 定期添加效果较好。在摇瓶条件下，确定阿魏酸的初始添加浓度以不超过6 9 l 为宜。采用分批补料转化法可解除阿魏酸对菌体生长和代谢的抑制作用。采用 最佳发酵培养基，以商品阿魏酸为底物，分别在摇瓶和7 l 发酵罐最佳转化条件 下，香兰素产量分别达到7 2 4 6 9 l 和1 0 5 1 d l 。 关键词：阿魏酸，香兰素，链霉菌，转化 a b s t r a c t t h et h e s i sf o c u s e do nd e t e r m i n a t i o no fv a n i l l i n ，f e r u l i c a c i da n do t h e r b y p r o d u c t s o ff e r m e n t a t i o nb r o t h ，t h e o p t i m a lp r o d u c t i o n m e d i u ma n dc u l t u r e c o n d i t i o n so f s t r e p t o m y c e sl 1 9 3 6f o rp r o d u c i n gv a n i l l i n t h e p a r a m e t e r s o fh p l cw e r ed e t e r m i n e d t l cw a sc a r r i e do u tf o r q u a l i t a t i v ea n a l y s i s s p e c t r o p h o t o m e t e r yw a su s e df o rq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s t h e o p t i m a lc o n d i t i o n so fe n z y m ep r e t r e a t m e n ta n de x t r a c t i n g f e r u l i ea c i df r o mr y e b r a nw e r ed e v e l o p e db yo r t h o g o n a l d e s i g nt h e o r y t h eo p t i m a l a m o u n to f e n z y m e sw a sd e t e r m i n e d ，t h a ti s 一a m y l a s e4 0 x gr a wm a t e r i a l ，1 3 9 8 一p r o t e i n a s e 3 6 i t g r a w m a t e r i a l ，a m y l o g l u c o s i d a s e4 0 0 b g r a wm a t e r i a l t h e o p t i m a l t e c h n o l o g yw a sa d o p t e dt or y eb r a na t 6 0 。cf o r6 hw i t h1 o c o n c e n t r a t i o no f s o d i u m h y d r o x i s e t or e l e a s ef e r u l i ca c i d3 1 1 4 9 几s t r e p t o m y c e sl 1 9 3 6c o u l d b i o t r a n s f o r m a t et h ec o n c e n t r a t e de x t r a c ts o l u t i o n t h em o u n to fv a n i l l i ni nt h e b r o t hw a so 1 7 4 9 l t h eo p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nm e d i aa b o u tt h es t r a i n s t r e p t o m y c e s l 1 9 3 6w a sr e s e a r c h e d d i f f e r e n ts o r t so fc a r b o na n dn i t r o g e n r e s o u r c e s ，m e t a l i o n so f i n o r g a n i c s a l tw e r es t u d i e di nt h e s i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t s t h r e ei n g r e d i e n t s ( g l u c o s e ，y e a s te x t r a c t ，m g s 0 4 7 h 2 0 ) r a t i o o f m e d i aw a s o p t i m i z e dt h r o u g h r e s p o n s e s u r f a c e a n a l y s i s t h eo p t i m a l c o n c e n t r a t i o n so ft h ef a c t o r sw e r eo b t a i n e d ：g l u c o s e1 0 9 ly e a s te x t r a c t1 0 叽 m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 l a n d t h eo p t i m a lm e d i aw a sa s f o l l o w e d ：g l u c o s e1 0 9 l , y e a s te x t r a c t1 0 lm g s 0 4 。7 h 2 00 2 9 l , n a 2 h p 0 44 9 ，k h z p 0 4l g ，n a c lo 2 9 ， c a c l 2 2 h 2 00 0 5 9 ，h 2 01 0 0 0 m l t h ec u l t i v a t i o n c o n d i t i o n so ft h es t r a i n s t r e p t o m y c e sl 1 9 3 6 w a ss t u d ya n dt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w e d ：t h e i n o c u l a t i o ns i z e6 ，t h ef e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e3 76 c ，a5 0 0 m lf l a s kc o n t a i n i n g 5 0 m lm e d i u m t h es p e e dw a s1 9 0 r m i n n ea d d i t i o nc o n d i t i o n so ff e r u f i ca c i d w e r es t u d i e d i tw a s p r e f e r a b l et h a tf e r u l i ca c i dw a sa d d e d w h e nt h es t r a i nw a si n t h ep e r i o do fs t a b i l i z a t i o n f e d - b a t c hc u l t u r ew a sa d o p t e dt or e l i e v et h et o x i co f f e r u l i ca c i dt om i c r o o r g a n i s m t h ec o n c e n t r a t i o no fv a n i l l i n7 2 4 6 9 lw a s p r o d u c e di n f l a s ka n d1 0 5l g lv a n i l l i nw a so b t a i n e di ns t i r r e dt a n k f e r m e n t or k e y w o r d s ：f e r u l i ca c i d ，v a n i l l i n ，s t r e p t o m y c e s , b i o t r a n s f o r m a t i o n 天律科技大学硕士学位论文 1 、前言 1 1 香兰素的结构和性质 香兰素( v a n i l l i n ) ，学名4 一羟基一3 一甲氧基苯甲醛，又名香草醛、甲基原 儿茶醛“1 。分子式：c 8 h 8 0 3 ，相对分子量1 5 2 1 5 ，沸点2 8 4 2 8 5 ，相对密 度1 0 5 6 。外观为白色至黄色针状或粉末状结晶，香兰素具有香荚兰豆特有的 香气。微溶于水( 1 9 l o o m l ，2 0 ) ，易溶于乙醇、苯甲基苯甲酸酯、冰醋酸、 二硫化碳、毗啶、脂肪和芳香酯等有机溶剂中和强碱溶液中。易受光的影响， 在空气中逐渐氧化。香兰索具有较低的气昧识别阂值，在生产和储存过程中 容易携带其它气味。无毒，对人和动物无害，但对皮肤和粘膜有局部的刺激“。1 。 h 0 0 c 卜b 图1 - 1 香兰素的分子结构 1 2 香兰素的应用 香兰素是一种世界上产量最大、用途最多的广谱型高档香料。欧美国家 己将其应用于食品、日用化工、橡胶、塑料、医药等行业，还用于烟草及酿 酒行业，目前己成为具有多种用途的有机化合物( 见表1 - 1 ) “，在我国， 香兰素的应用只限于食品、饮料等少数几个领域。1 。 1 2 1 香兰素在食品和医药行业的应用 由于香兰素具有特殊的香型，已成为各国消费者最为喜欢的一种食用香 料，有“食品香料之王”的美称，广泛用作名酒、奶油、咖啡、可可、巧克 力等高档食品的调香原料。香兰素是配置香草型香精的主要原料，在该类香 精中，香兰素的含量最多可达2 5 3 0 。1 。 从7 0 年代起，香兰素开始用于医药合成。如邻位香兰素与硫酸二甲酯作 用可生成藜芦醛，后者在医药上用来合成黄连素；香兰素经溴化、水解、甲 基化可以得到3 ，4 ，5 三甲氧基苯甲醛( t m b ) ，t m b 是磺胺增效剂甲氧苄 胺嘧啶( t m p ) 、镇咳祛痰药喘速停以及抗癫痫药3 ，4 ，5 - 三甲氧基肉桂酰异 丙胺等合成的重要中间体；香兰素与甘氨酸的酰基衍生物可合成治疗帕金森 氏病( 震颤麻痹) 的药物l - 多巴的中间体；香兰素还可用来合成治疗高血压 1 、前言 的l _ 甲基多巴，治疗上呼吸道感染和预防性病菌株传播的甲氧卞氨基嘧啶及 治疗心脏病的药物罂粟碱等”1 。香兰素具有一定的抗菌能力，常在治疗皮肤病 药物的配方中使用。此外，由香兰素合成的5 羟基汞香兰素、5 醋酸汞香兰 素和5 氯代汞香兰素具有杀菌作用。 1 2 2 香兰素在化工和农业上的应用 香兰素及其衍生物如乙基香兰素、香草酸乙酯都是重要的合成香料。香 兰素与荣莉醛及所有的麝香香味剂都能很好的进行调和，可作为香皂、牙膏、 香水及各类化妆品中的调香剂，是制备化妆品、卫生品香料不可缺少的原料。 香兰素也是较重要的化学助剂。由香兰素合成的丹宁还可用于鞣革。香兰素 可作为电镀添加剂，在镀锌等金属时，添加香兰素可加快电镀速度，增加镀 件表面的光泽。 香兰素可作为农作物的增产剂和催熟剂。还可用于制取除草剂，如由其 制取的香兰醛腙即为一种除草剂，其活性与2 ，4 二氯苯氧基乙酸相似。 表1 - 1 香兰素的用途 用途 实例 食品行业香兰素是配置香草型香精的主要原料，用于乳制品、饼干、糕点、冷饮、 糖果等食品的赋香；还可用于香精和食品添加剂的生产，如姜油酮、辣椒素、 3 - 甲氧基4 羟基- 2 - 正戊基肉桂醛：可作为含有多不饱和组分的食品的抗氧化 剂等。 医药行业邻位香兰素可用于台成藜芦醛、3 ，4 ，5 - 三甲氧基苯甲醛( t i v i b ) ；香兰 素可合成。多巴的中间体、l r 甲基多巴、甲氧卞氨基嘧啶及罂粟碱等；在哌唑、 自内停、联苯双酯利喘贝呱唑等药物的合成过程中，香兰素都是重要的中间体。 还可作为抽烟引起的口腔粗糙的防止剂。 化学工业 香兰素可用于配制香精，用作化妆品的调香剂。还可用于检验蛋白质氮 杂茚、间苯二酚及单宁酸的存在。可作为塑料制品的抗硬化助剂、防臭剂、 鞣革剂、电镀添加剂等，还用于润滑油消泡剂、印制线路板导电剂等 农业 香兰紊可作为甘蔗的增产齐和催熟剂。还可用香兰素制取除草剂和杀虫 药剂的引诱剂。 1 3 香兰素的生产方法 1 3 1 从天然植物中提取香兰素 香兰素广泛存在于自然界中，在香荚兰豆、秘鲁香膏、吐鲁香膏、苏合 香膏、安息香膏、爪哇香茅油、丁香花蕾油、丁子香芽油、香子兰的荚中等 许多精油及植物中均有发现，但在香荚兰豆中含量最高“。 香兰素是天然芳香植物香荚兰豆中的最重要成份。香荚兰豆是兰科 天津科技大学硕士学位论文 ( o r c h i d a c e a e ) 香荚兰种( v a n i l l ap l a n i f o l i aa n d r e w s ) 的果实。香英兰豆经发酵 生香工艺处理后，具有特殊香味，可直接添加于食品中，也可以用作进一步 提取高级食用香料的材料”1 。植物香荚兰及其种子香荚兰豆如图1 2 所示： 图1 - 2 植物香荚兰及其种子香荚兰豆 香兰素在干香英兰豆中的含量约为1 5 2 0 9 & g 。全世界每年香兰素的消 耗量为1 2 万吨，其中约有o 2 来自于植物，主要还是从干香荚兰豆中来获 得。每年从香荚兰豆中提取的香兰素制品约有2 0 吨。 1 3 2 化学合成法 由于天然资源的限制，单靠从植物中提取香兰素已不能满足人们日益增 长的需求。自1 8 7 4 年确定香兰素的分子结构以来，随着生产的发展和研究 的深入，合成原料的多样性为制备香兰素提供了有利条件，目前具有经济价 值的方法有4 种。 1 3 2 1 以木质素磺酸盐为原料 本质素广泛存在于自然界中，主要以磺酸盐的形式存在，废木材、禾秸、 泥炭、造纸厂的纸浆废液和酒糟浓缩物中都含有木质素。1 9 3 8 年美国s a l v o 公司开始用木质素生产香兰素“。 自从kf r e u d e n b e r g “”最早提出碱硝基苯氧化木质素可生产香兰素以来 的半个世纪，在加拿大、前苏联先后建成了利用亚硫酸盐纸浆液生产香兰素 的多家工厂，该法原料成本低，香兰素得率为1 5 左右。 1 3 2 2 以黄樟素为原料 1 9 2 7 年日本高砂“”用黄樟素臭氧化合成香兰素，用此法生产香兰素，产 品香气较好，但副反应产生的异香兰素难以除去，成本高于木质素法1 0 多倍。 1 3 2 3 以丁香酚为原料 1 9 世纪末，r e im e t 和t i em a n n “”开始用此法合成香兰素，所得香兰素香 气纯正，但成本比木质素法高2 0 多倍，荷兰、英国曾用过此法。 1 3 2 4 以愈创木酚为原料 愈创木酚与亚硝基n ，n 一二甲基苯胺盐酸盐，甲醛或六次甲基四胺为原料 缩合制备香兰素。此法优点是副反应生成的香兰醇与对羟基n ，n 二甲基苯胺 3 1 、前言 盐酸作用，形成西呋喃，经分解后，参加反应的醇又可转变为香兰素，总得 率约为6 0 。该方法国外已用了9 0 多年，我国也采用此法大量生产香兰素“。 用愈创木酚与乙醛酸在碱性条件下缩合，缔合反应液回收愈刨木酚后经 铜盐催化氧化，将缩合产物取代苯乙醇酸氧化为相应的酮酸，经脱羧转化为 香兰素。此法工业生产收率可达7 0 ，是目前国外生产香兰素的主要方法“1 。 1 3 3 香兰素的生物转化 生物转化法生产香兰索是采用人工培养的香荚兰植物细胞或植物胝组 织、原核微生物、真核微生物以及分离的酶作为生物催化剂来进行。许多细 菌、霉菌和酵母菌以及其所分泌的一些酶，以木质素、酚芪、阿魏酸、( 异) 丁香酚、肉桂酸、松柏醇、香草醇、香草胺、姜黄等作为底物，都可转化生 产香兰索，但转化率非常低。利用基因工程菌和酶工程技术直接以葡萄糖为 碳源生产香兰素在实验室已经获得成功“，具有相当广阔的商业前景。 1 3 3 1 酶工程技术在香兰素生产上的应用 实验室利用微生物酶类转化香兰素的研究也有报道。例如y o s h i d a 等“” 用黑曲霉( a s p e r g i l m sn i g e r ) 胺氧化酶和大肠杆菌口c o i l ) 单胺氧化酶氧化香 草胺生产香兰素。酶促反应动力学研究表明，胺氧化酶能更有效地促进香草 胺氧化生成香兰素，2 7 i ，t g m l 的胺氧化酶液在3 0 r a i n 内可以将l m o l l 的香草 胺完全氧化，产物经高效液相色谱和气质联用检验为香兰素。y o s h i d a 等“” 还研究了用固定化胺氧化酶连续生产香兰素，预计不久的将来，黑曲酶胺氧 化酶连续生产香兰素的技术将应用于工业生产。m a g u s 等”利用脂肪氧合酶 转化丁香酚和异丁香酚生产香兰素。用异丁香酚作为底物时，转化产量约为 1 0 0 1 5 0 m g g ，丁香酚为3 5 m g , g 。 1 3 3 2 细胞工程在香兰素生产上的应用 细胞工程包括细胞融合技术、动物细胞工程和植物细胞工程等内容。植 物细胞工程主要是指植物细胞培养，基本理论依据一是细胞学说，二是细胞 具有潜在的“全能性”的理论。植物细胞培养至今已有8 0 多年的历史，利用 植物细胞培养生产具有天然组分的次级代谢物与传统的微生物发酵一样，具 有广阔的应用前景n ”。 采用植物细胞培养技术生产香兰素及其系列化合物受多种因素影响。培 养基中添加前体物质的种类和数量、培养期间的光照等对代谢物的组成和产 量都有重要影响。 除利用香英兰植物组织进行细胞培养生产香兰素夕 ，还有利用固定化辣 椒细胞生产香兰素的报道u “。 1 3 3 3 发酵工程在香兰索生产上的应用 许多细菌、霉菌和酵母菌都能以木质素、酚芪、阿魏酸、丁香酚、异丁 4 天律科技大学硕士学位论文 香酚、芳香族氨基酸等化合物为前体，转化生产香兰索。“。在这些物质中， 研究大多集中在阿魏酸、( 异) 丁香酚上，其中最受关注的是阿魏酸。 ( 1 ) 木质素的微生物转化 水质素是芳香族物质的最广泛天然来源。虽然人造香兰素是经木质素氧 化而成，但利用微生物转化木质素生成香兰素的报道却很少。“。白腐菌能降 解木质素多聚物产生香兰素、脱氢香兰素、香草酸、松柏醛、阿魏酸、对羟 基肉桂酯、乙醛、对羟基肉桂酸、愈创甘油一b 一松柏醚及愈创甘油等物质。 然而，在所有真菌降解木质素的报道中，香兰素的生成量都很低。 ( 2 ) 以丁香酚、异丁香酚为底物生产香兰素 丁香酚是丁香树丁香油的主要成分。它是利用微生物转化法生产香兰素 素中一种较为经济、可再生且容易获得的原料。据报道“，1 9 7 7 年发现棒杆 菌( c o r y n e b a c t e r i u ms p ) 能降解丁香酚生成阿魏酸、香兰素、香草酸、原儿 茶酸等一系列产物。假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p ) 的丁香酚代谢是以丁香酚氧 化形成环氧化物作为最初反应，能够检测到松柏醇、松柏醛等代谢中间体， 而且松柏醛可被进一步氧化为阿魏酸。f u s a r i u ms o l a n i 也可将丁香酚转化为 香兰素和愈创木酚，阿魏酸是其代谢的中间体。 第一次生物转化异丁香酚生成香兰素的菌株为黑曲霉( a s p e r g i l l u sa t c c 9 t 4 2 ) 。由于香兰素可被进一步降解为香草醇和香草酸，香兰素的产量相当低， 转化率为1 0 。克雷伯氏菌( k l e b s i e l l a ) 、肠杆菌( e n t e r o b a c t e r ) 、沙雷氏菌 ( s e r r a t i a ) 也可转化丁香酚、异丁香酚生成香兰素。1 。 由于丁香酚对微生物有毒性，可抑制菌体生长，因此该法生产香兰素的 关键是筛选丁香酚耐受性强的微生物。 ( 3 ) 以阿魏酸为底物生产香兰素 许多细菌、酵母菌和霉菌都可利用阿魏酸为底物生产香兰素。在香兰素 的转化生产中，阿魏酸是一个十分重要的底物。当以阿魏酸作为香兰素转化 的底物时，阿魏酸的降解速度较快，其添加量很容易达到l g l 以上，在转化 过程中还产生香草醇、香草酸、原儿茶酸等。 1 3 4 香兰素生产方法的比较 如前所述，香兰素主要有三种生产方法，一是从天然植物中提取，二是 化学合成法，三是生物转化法。 从天然植物中提取香兰素的成本较高，种植香荚兰劳动强度大，难以大 规模栽种，特别是由于气候原因会引起产量的浮动，并且香荚兰豆中香兰素 5 1 、前言 的含量不高，香荚兰的后期生香处理非常复杂。此外，香子兰植物的主要种 植国家和地区的种植面积有限，因此单靠增加香荚兰豆的产量，从植物中提 取香兰素已不能满足日益增长的市场需要。 目前，市场上绝大部分香兰素是采用化学法合成，虽然方法简单，但存 在很多弊端。如合成的香兰素香型单一，且在合成过程中易掺杂而影响其香 味与色泽。采用有毒原料一愈创木酚合成香兰素还容易造成环境污染。随着 世界各国对食品安全的重视，注重食品及组分的天然性已成为趋势。在这 种背景下，以生物转化法选择其它天然原料来生产香兰素越来越具有吸引力， 并受到广泛关注。利用生物转化法转化天然前体物生产的香兰素，称为“天 然香兰素”，可以代替从香荚兰豆中提取的价格昂贵的天然香兰素。随着对生 物转化法研究的深入，其生产成本会不断更低。因此，生物转化法生产的香 兰素无论是在其经济性还是安全性方面更具有吸引力。 表1 - 2 香兰素生产方法比较。” 1 4 阿魏酸为底物转化香兰素的机理 香兰素是微生物降解阿魏酸的一种中间产物。依据阿魏酸降解时最初反 应的不同，又将其降解途径分为四种：非氧化脱羧作用、侧链还原作用、独 立于辅酶a 的脱乙酰化作用、依赖于辅酶a 的脱乙酰化作用“1 。 1 4 1 阿魏酸的非氧化脱羧作用 在这种机制中，阿魏酸代谢的第一步是在脱羧酶的作用下形成4 乙基愈 创木酚( 4 一羟基- 3 一甲氧基苯乙烯) 。这一脱羧作用在许多真菌( 如酵母菌) 及 细菌中都存在。“。由阿魏酸脱羧酶所催化的阿魏酸脱羧作用的第一步反应是 酶促的阿魏酸异构化，生成醌式中间体，它随后脱羧。这种机制与脱羧过程 一样都需要一个对位羟基基团存在。洋葱伯克霍尔德氏菌( b u r k h o l d e r i a c e p a c i a ) 和酿酒酵母( 墨c e r e v i s i a e ) 作用于阿魏酸，除了生成4 一乙烯愈创木 天律科技大学硕士学位论文 酚外，还可观察到二氢阿魏酸的生成。凝结芽孢杆菌( b a c i l l u sc o a g u l a n s ) 降 解阿魏酸时，4 乙烯愈创木酚进一步代谢生成香兰索、香草酸和原儿茶酸。 1 4 2 阿魏酸的侧链还原作用 在这种机制中，阿魏酸的侧链被还原生成二羟阿魏酸( 4 羟基3 一甲氧基 苯丙酸) 。对于阿魏酸的厌氧降解这一机制很典型。在厌氧条件下，洋葱伯克 霍尔德氏菌、产琥珀酸沃林氏菌( w o l l n e l l as u c c i n o g e n e s ) 、酿酒酵母、植物 乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ) 可观察到这一反应”1 。在能够脱羧的微生 物中，如果在氢的受体如硝酸盐、延胡索酸等或是氧存在的条件下，其还原 途径受到限制。产琥珀酸沃林氏菌降解阿魏酸时，二氢阿魏酸被进一步代谢 为高香酸、对羟甲基酚和香草酸。荧光假单胞菌( p s e u d o m o n a s 月u o f d s c e n s ) 作用阿魏酸时，二氢阿魏酸被进一步代谢生成香草酸、原儿茶酸。 1 4 3 依赖于辅酶a 的脱乙酰作用 依赖于辅酶a 的机制类似于脂肪酸的b 氧化途径。刺假诺卡氏菌的肉桂 酸取代物就以这种机制降解的。在这种机制中，4 一羟基一3 一甲氧基丙酮酸c o b 在b 一酮硫酶催化下分解生成乙酰c o a 和3 一甲基一4 一羟基c o a 。最近，在荧 光假单胞菌中发现一条新的依赖于c o a 、非氧化的阿魏酸降解途径，阿魏 酸在f e r u i o y l c o a 合成酶作用下被活化生成c o a 硫酯。 1 4 4 独立于辅酶a 的脱乙酰作用 在该机制中，降解是从阿魏酸的不饱和侧链去掉一个乙酸基团，直接生 成香兰素。这一机制在假单胞菌，洋葱伯克霍尔德氏菌，枯草芽孢杆菌 ( b a c i l l u ss u b t l i s ) 、谷氨酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m ) 、大肠杆菌 ( e s c h e r i c h i a c o l i ) 、链霉菌( s t r e p t o m y c e s ) 、黑曲霉中都存在。这种机制涉 及到阿魏酸反式双键的羟化作用，并生成4 一羟基3 甲氧基苯p 一羟丙酸这一 中间体，然后在醛缩酶的作用下将其分解为香兰素和乙酸。 微生物转化阿魏酸的主要途径如图1 - 3 所示。在微生物转化阿魏酸的过 程中，阿魏酸可被还原形成侧链饱和的醛和醇；阿魏酸不饱和侧链上的乙基 基团断裂，经过香兰素这一重要的分枝点，生成其他的氧化还原产物；香兰 素氧化生成香草酸这中心代谢产物，香草酸通过脱羧作用生成愈创木酚、 通过脱烷基作用生成原儿茶酸、通过氧化脱羧生成氢醌；阿魏酸直接去烷基 生成咖啡酸；非氧化脱羧形成酚芪，这可能是一种最为古老的降解反应。阿 魏酸或其代谢物的进一步氧化降解通常都以原儿茶酸为中间产物。 1 、前言 图1 - 3 微生物转化阿魏酸的主要途径 1 阿魏酸，3 a 咖啡酸，5 香兰素，6 香草醇，7 香草酸，8 氢琨，9 愈创木酚1 0 原儿 茶酸，1 1 儿茶酚，1 2 酚芪，1 3 4 - 羟基3 一甲氧基苯丙酸，1 4 4 - 羟基3 甲氧基苯乙烯 0 h 到目前为止，研究的几乎所有微生物降解阿魏酸时，香兰素的积累量都 较少。这是由于香兰索具有较强的活性，总是被快速转化成相对稳定的香草 酸或是香草醇，而且香兰素的转化速度要比阿魏酸的转化速度快得多”1 。阿 魏酸降解所生成的香兰素会氧化生成香草酸，香草酸进一步去甲基化生成原 儿茶酸，或是脱羧基生成愈创木酚。愈创木酚继续去甲基化生成儿茶酚。所 以在阿魏酸降解过程中只有少最香兰素生成。 链霉菌以阿魏酸为前体合成香兰素的代谢途径是独立于辅酶a 的脱乙酰 化作用。本论文采用的菌种s t r e p t o m y c e sl 1 9 3 6 它是一种耐高温的降解酚和木 质素的放线菌，能耐受较高浓度的香兰素，在发酵过程中可以积累较大量的 香兰素。链霉菌转化阿魏酸台成香兰素的途径如图1 - 4 所示啪1 。 由图1 4 可知：阿魏酸侧链上的两个碳由脱乙酰化作用以乙酸的形式被 去掉，生成了相应的醛( 香兰素) 。然后香兰素被氧化成香草酸，这可能是被 一种需氧的芳香醛氧化酶所催化。当最初的底物不同时，进一步降解的产物 天津科技大学硕士学位论文 不同。链霉菌以阿魏酸作为最初底物时，它去乙酰化生成香草酸盐并进一步 生成原儿茶酸。当它以香兰素为最初底物时，香草酸盐脱羧生成愈创木酚， 愈创木酚去甲基化生成儿茶酚。原儿茶酸和儿茶酚分别在可诱导的酶原儿 茶酸3 , 4 双氧化酶( e c1 1 3 1 1 3 ) 和儿茶酚1 , 2 一双氧化酶( e c1 1 3 1 1 1 ) 作 用下生成苯环团断裂物。 阿魏酸香兰素香草酸原儿茶酸 h c - c h - c o o n q ”一q o h ，q o h 。 香革醇 愈刨木酚 图1 - 4 链霉菌s t r e p t o m y c e s 以阿魏酸为底物合成香兰素的代谢途径 链霉菌s t r e p t o m y c e sl 1 9 3 6 与其它菌株相比，代谢的一个最大特点就是存 在一个完全不同的代谢模式，其它菌株以香草酸作为主要代谢产物，而链霉 菌s t r e p t o m y c e sl 1 9 3 6 却能大量积累中间代谢产物香兰素。链霉菌 s t r e p t o m y c e sl 1 9 3 6 在以阿魏酸为底物进行代谢时，当阿魏酸的浓度较低时， 香兰素和香草酸都有生成，但当阿魏酸浓度较高时，在香兰素氧化成香草酸 的代谢中存在着代谢瓶颈，香草酸只积累到一定量，然后将香兰素作为主要 代谢产物，导致香兰素的大量积累。在发酵液中只有少量的香草酸、香草 醇生成，香草酸的代谢产物原儿茶酸、愈创木酚的量更微小。 1 5 香兰素的检测 香兰素的测定方法有色谱法( 液相色谱、气相色谱) 、荧光法、离子选择 电极法、紫外分光光度法等。“。在微生物转化法生产香兰素的发酵液中，由 于有底物阿魏酸及其副产物香草酸、香兰醇等物质的存在，除液相色谱法外， 其它方法具有一定局限性，都不能较为准确地检测发酵液中的香兰素。因此， 建立简单、有效地检测方法来监测香兰素的转化过程尤为重要。 目前香兰素的检测方法主要有三种：一是薄层层析法，通过比较试样与 样品的r f 值是否相同进行定性检测，根据其斑点的相对大小来进行半定量检 9 1 、前言 测。”。二是根据香兰素在强酸介质中与硫代巴比妥酸反应生成黄绿色化合物， 应用可见光分光光度法测定香兰素，其操作相对简单，对仪器和设备要求不 高。三是高压液相色谱法，通过反相c 。色谱柱进行分离，用二极管阵列式检 测器进行检测，它是一种现代化的检测手段，其检测准确，不受杂质干扰， 但设备较昂贵。3 。 1 6 微生物转化条件的控制 1 6 1 营养条件的控制 培养基的组成是微生物生长的重要条件，对微生物的生长繁殖、酶的活 性与代谢产物的产量都有直接影响。微生物在吸取营养方面具有多样性，不 同微生物对营养要求不同，但它们所需的基本营养物质大体相似。其中尤以 碳源、氮源、无机盐、生长素和金属离子等最为重要。不同类型的微生物所 需要的培养基成分与浓度配比并不完全相同，提高代谢产物的产量是选择培 养基的一个重要标准，但同时还应当要求培养基成分简单、来源丰富、价格 低廉、取材方便等o “。发酵培养成分的数量( 即原料配比) 还需根据不同的 培养目的进行确定，只有培养基各成分的关系选得比较恰当，才能最大限度 地发挥菌种的特性，提高代谢产物的产量。 当链霉菌以葡萄糖进行生长时，存在分解代谢物阻遏作用。葡萄糖的分 解代谢物能一定程度上抑制香兰素氧化酶的合成，这就促进了香兰素的积累。 链霉菌( s t r e p t o m y c e s ) l 1 9 3 6 能够以阿魏酸为碳源进行生长。据报道【2 0 ， 链霉菌去乙酰化反应所需的酶一乙酸激酶为一种诱导酶，肉桂酸通常可诱导 香兰素的生成，本论文采用阿魏酸作为诱导剂。 1 6 2 环境条件的控制 1 6 2 1 温度 对于微生物来说，温度直接影响其生长和胞内酶的合成。由于生物体的 生命活动可以看作是相互连续进行的酶反应过程，由于任何酶反应都与温度 有关，因此温度会直接影响细胞内部酶反应的速率。发酵过程中最大的酶活 性，一般仅能在很小的温度范围内维持，因而需要有效的控制温度，使其适 于细胞生长。”。对于同一微生物来说，其不同的生理生化过程有着不同的最 适温度，这同样适用于链霉菌s t r e p t o m y c e sl 1 9 3 6 ，在斜面培养活化时，采用 培养温度为3 0 6 c ，此温度下有利于孢子的生成，而转化香兰素是在3 7 的条 件下进行，此温度更利于参与转化反应的各种酶活性的发挥。链霉菌能够在 较高的温度下进行生长、繁殖，减少了污染杂菌的机会和夏季培养所需降温 的辅助设备和费用，对工业生产有很大好处。 1 6 2 2p h 培养基的氢离子浓度对微生物的生命活动有显著影响。各种微生物都有 天津科技大学硕士学位论文 自己生长和酶作用的最适p h 。同一种微生物的酶系组成及酶的活性随p h 的 改变而变化。培养基p h 在发酵过程中会发生改变，阴离子( 如醋酸根、磷酸 根) 和氮源被利用后产生n h 3 ，则p h 上升；阳离子( n h 4 + 、心) 被吸收或 有机酸的积累，则p h 下降。 微生物发酵过程中，发酵液p h 变化表明了微生物细胞生长及产物或副产 物生成的情况，因此发酵过程中p h 的控制极为重要。为达到微生物的充分繁 殖和酶合成的目的，培养基必须保持适当的p h 。调节培养基p h 的方法有3 种，即使用酸碱溶液、缓冲溶液以及各种生理性缓冲剂( 如生理酸性和生理 碱性的盐类) 。链霉菌的种子培养及转化过程的p h 可通过磷酸盐缓冲溶液来 调节。 1 6 2 3 溶解氧 好氧菌和兼性厌氧菌的生长和酶的合成，都需要氧气的供给。不同微生 物生长所要求的溶解氧也不同，即使同一菌株，在不同的生理时期对溶解氧 的要求也有差异，因此，在控制溶解氧时必须考虑到既能满足菌体生长与胞 内酶合成的要求，又要节省电耗，提高经济效益。挡板式三角瓶有助于提高 溶解氧浓度。链霉菌转化阿魏酸时，独立于辅酶a 的脱乙酰化作用的关键酶 一乙酸激酶是需氧酶，必须供氧充足，才能促使香兰素的过量转化。 1 6 3 补料分批培养 补料分批培养( f e d b a t c h ) 又称半分批( s e m i 曲a t c h ) 或半连续培养，俗称 “流加”，是一种介于分批发酵和连续发酵之间的特殊培养方式。它是在微生 物的分批培养过程中向生物反应器中间接或连续地补给一种或一种以上特定 限制性底物，直到反应结束后才排出培养液的一种操作方式。工业微生物反 应多数采用这种方式操作。在培养的不同时间不断补加一定的养料，可以延 长微生物的对数生长期和平衡期的持续时间，增加生物量的积累和平衡期细 胞代谢产物的增加。 补料分批培养可分为两种类型：单一补料分批发酵；重复补料分批 发酵。补料分批培养技术兼有分批培养和连续培养的优点，又克服了两者的 缺点。同传统的分批培养相比，补料分批培养的优越性很明显，它可以解除 底物的抑制、产物反馈抑制，最终产物浓度较高，有利于产物的分离，比连 续发酵应用更为广泛。 链霉菌能将阿魏酸转化为香兰素，但芳香族化合物阿魏酸即使在较低浓 度下也会对微生物的生长产生抑制作用。采用补料培养法，使这些基质浓度 保持在较低水平，可减少其对菌体生长的抑制作用。“。香兰素转化的补料可 在产物形成阶段进行，分批加入底物阿魏酸。香兰素转化速率下降时，分批 发酵就宣告结束。 1 、前言 1 7 阿魏酸制备的研究及其应用 阿魏酸是肉桂酸的衍生物，大量存在于木本植物、草本植物的细胞壁中 与碳水化合物以共价键联结“。部分农副产品中阿魏酸的含量见表1 3 。 表1 - 3 部分农副产品中阿魏酸的含量”1 农副产品种类麦麸玉米糠大米胚乳甜菜糖浆大麦麦糟 堕鍪墼鱼量! 啦g ! 二! q! ；! 二! ! ：! 阿魏酸的制备方法较多，主要可以用化学有机合成，生物工程转化，从 中药材如当归、川芎中提取，从谷类油脂中提取，或直接以谷维素为原料制 取以及从农副产品如米糠、黑麦麸皮、小麦麸皮中提取等m ”。我国是黑麦、 小麦种植大国，并且黑麦麸皮、小麦麸皮作为制粉厂的大宗副产品，来源充 足，价格低廉，若能对麸皮等农副产品进行深加工，生产高附加值的阿魏酸， 会给农业生产、食品生产带来可观的经济和社会效益“。许多科学工作者试 图用阿魏酸酯酶、肉桂酸水解酶将阿魏酸释放出来，如将黑曲霉培养在谷物 衍生物上诱导其产生肉桂酯酶，并与木聚糖酶协同作用从麸皮中释放出阿魏 酸。此外，从黑曲霉中获取的肉桂酯酶与阿拉伯糖酶l 阿拉伯呋喃糖酶共 同作用也能够从甜菜糖浆中释放出阿魏酸。从假单胞菌中获得的肉桂酯酶在 木聚糖酶存在下，水解麸皮和大麦麦糟释放出单体和二聚体阿魏酸“。 阿魏酸具有很高的药用价值，在医药方面有着广泛的应用1 。目前已知 阿魏酸及其衍生物有抗氧化、抗血栓形成、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗菌 消炎、抗突变防癌的作用“。此外，阿魏酸还能有效降低人体血液粘度，清 除血管壁血脂的沉积，促进血液微循环、使皮肤得到滋养，有效调节内分泌， 降低皮肤色素的沉积，有助于皮肤抗衰老。阿魏酸还具有调节人体免疫功能 的作用。阿魏酸在食品行业、农药、饲料添加剂等领域都有着广泛的用途3 。 在日本还将阿魏酸用于液晶的开发。 1 8 国内外微生物转化法生产香兰素的研究现状 国外微生物转化法生产香兰素的相关研究，最早始于二十世纪八十年代 末。阿魏酸是目前最理想的香兰素转化底物，多种细菌、酵母菌和霉菌都可 以利用阿魏酸为底物生产香兰素1 。p e r n o d - r i c a r d 公司和k r a f t g e n e r a lf o o d s 公司的专利都有相关报道，最近的欧洲专利介绍，利用两株a m y c o l a t o p s i s 属 菌株转化阿魏酸，香兰素在发酵液中的积累浓度可达1 1 + 5 彰l ；美国专利表明， 利用链霉菌转化阿魏酸为香兰素，1 7 h 后，香兰素在发酵液中的积累浓度可达 到1 3 9g l ，摩尔转化率为7 5 ”1 。 1 2 天津科技大学硕士学位论文 表1 4 不同微生物转化法生产香兰素的研究“”1 削 黥鬻参教献 e n t e r o b a t a r ( 1 9 9 0 )发酵1 3 d p y c n o p o r u s c i n n a b a r i n u s 阿魏酸o 3 e m 0 0 4 6 9 l p s e u d o m o n a s a m y c o l a t o p s i s a s p e r g i l l u sn i g r s e r r a t i am a r c e s c e n s 如c n o p o r u s c i n n a b a r i n n s 确a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m s w t o n i i1 9 9 6 a m y c o l a t o p s i ss p s s e t o n i l z y g o r h y n c h u s m o e l l e r i 懈c f o t n u c o ri s a b e l l i n u s a s p e r g i l l u s 扣m g 口加5 p s e u d o m o n a s p u t i d a 陕变株) p c i n n a b a r i n u s n i d u l a n i v e o - t o m e n t o s a p p u t t i a s a c c h a r o m y c e s c e l p 括i a e p s e u d o m o n a s1 9 9 3 发酵6 d 阿魏酸1 班 阿魏酸 异丁香酚 异丁香酚 发酵9 d 阿魏酸0 3 9 a 香革酸o ，8 3 8 9 l 发酵6 d 阿魏酸 菌体固定在褐 藻酸钙上 阿魏酸1 9 9 2 扎 在1 0 l 发酵罐 中发酵3 2 h 阿魏酸2 2 5 虮。 在1 0 l 发酵罐 中发酵1 7 h 香草酸8 班 发酵5 d 香革酸2 8 7 9 l 发酵2 6 h 香革酸1 6 8 9 l 发酵1 1 2 h 阿魏酸 发酵4 3 h 香草酸o 9 4 1 9 a _ 发酵7 d 香草酸1 2 5 2 9 l 发酵8 d 阿魏酸0 1 发酵5 4 异丁香酚2 9 几 发酵2 0 h 丁香酚0 3 v v 发酵7 2 h 0 2 8 9 l 1 1 5 9 ，l 转化率1