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产表面活性剂石油烃降解菌降解机制研究 摘要 石油开采、运输与贮存过程中的事故性泄漏以及生产、加工过程中的废油， 对环境造成严重的污染。环境中油污染的物理、化学和生物等各种修复技术近年 来取得了很大进展，其中，生物修复技术因其成本低，无二次污染，处理彻底， 操作简单等特点而倍受重视。 本课题围绕实验室驯化分离筛选自身能产表面活性剂的石油降解菌，以扩柴 油为唯一碳源，对2 株产表面活性剂的石油降解菌的生长特性、降低液体表面张力 的能力、柴油降解动力学及表面活性物质成份进行了研究。通过正交试验对细菌 的降解条件进行优化。采用订c 法测定降解菌的脱氢酶活性，研究微生物生长过 程中，脱氢酶活性和降解特征。最后通过油污土壤整治模拟试验对这2 株细菌进行 实际降解应用试验。 研究结果表明，筛选出的2 株自身能产表面活生剂的石油降解菌，d s i 菌为 芽孢杆菌属，d s - m 为假单胞菌属。以护柴油为唯一碳源，d s - i 菌和d s 1 1 1 菌在 生长过程中均可产生糖脂类生物表面活性剂，使发酵液表面张力显著降低；d s 4 菌和d s h i 菌在1 1 d 中分别使发酵液中柴油的质量浓度从4 6 7 9 m g l 降至 1 6 。6 4 m p 班和9 。1 7 m g 儿，柴油降解速率分别为5 1 6 m g ( l - d ) 乘l5 9 6 m g ( l d ) 。这2 个菌株对柴油的降解能力与它们对以柴油为唯一碳源的培养基的适应性、菌体疏 水性、产表面潘胜剂能力呈显著的定性。d s - i i i 菌在疏水性、对油的生长适应 性、产表面活性剂能力和对柴油的降解速率等方面比d s - i 菌更好。这2 个菌株的 在水体中较优降解条件：c , q q p 为1 0 0 ：1 5 ：1 ，接种量为1 0 ，初始p h 值6 0 ，最 适培养温度3 0 。在低浓度油污染水体中( p h 5 ，t = 3 2 4 c ) ，d s - 菌根据柴油 的生物转化速率与其浓度拟合米氏方程，米氏常数k m = 1 5 9 1 6 峙几，最大反应速 度v 一- - 11 0 6 p g ( l - d ) 。脱氢酶活性比细胞生物量更能准确反映菌株对柴油的降解 性能。当土壤中含柴油量为1 0 9 1 0 0 9 土时，4 0 d 内d s i 菌的降解率达到5 7 7 0 ， 比自然条件下的降解率提高了1 8 5 8 ；d s - i i i 菌的降解率达到8 1 8 0 0 0 ，比自然条 件下的降解率提高了4 2 6 8 ，上述结果反映开发具有增溶降解等多功能的生物菌 类并寻求在实际应用中的施用技术对石油污染环境修复具有重要价值。 关键词：石油烃，微生物降解，疏水性，生物表面滑眭剂，脱氢酶 d e g r a d a t i o nm 匮c h a n i s mb y l i y d r o c a r b o nb i o d e g r a d a o no f b a c t e r l p r o d u c d i gb i o s i 瓜e a c 玑岍 a b s t r a c t a l o n gw i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n to f 胡i n d u s u y , t h ee n v e r i m r e n tc a nb e c o n t a m i n a t e db yp e l r o l e u mh y d r o c a r b o ni nm i n i n gp e t r o l e u m , t h et r a n s p o r t a t i o na n dt h e s t o r i l l gp r o c e s sa c c i d e n td i v u l g e sa sw e l la si nt h ep r o d u c t i o n ，t h ep r o c e s s i f 玛p r o c e s s i n r e c e n ty e a r st h e r ea l eg r e a tp r o 舀e s s e si nt h er e m e d i a t i o no fo i lp o l l u t i o n , i n c l u d i n g p h y s i c a l ，c h e m i c a l a n db i o l o g i c a lr e r n e d i a t i o n t e c h n o l o g y a m o n gt h e m , t h e b i o r e m e d i a t i o nt e c h n o l o g yi so n ek i n do f e m e r g i n gc l e a nt e c h n o l o g yw h i c hd e v e l o p si n t h e b i o d e g r a d a t i o nf o u n d a t i o n ；i t i st h et r a d i t i o n a l b i o l o g i c a l i r e a t m e n tm e t h o d d e v e l o p m e n t c o m p a r i n g w i t h p h y s i c a l a n d c h e m i c a lt e c h n o l o g y , i th a s m a n y s t r o n g p o i n t s ，i r l c l u d i r 塔t h el o wc o s t , t h es e c u r ep o l l u t a n to x i d a t i o n , 1 1 a v i r 培n os e c o n d c o n t i m e n t , t h eg o o dp r o c e s s i n ge f f e c t , t h es i m p l eo p e r a t i o na n ds oo i l t h i st o p i cc o n t e n t si n c l u d e ：s c r e e n i n gb a c t e r i as t r a i n s t h a tc a np r o d u c tb i o s u r f a c t a n t f r o md e g r a d i n gp e t r o l e u mh y d r o c a r b o nb a c t e r i as t r a i n s t w od i e s e ld e g r a d a b l eb a c t e r i a s w a i n sw e l et e s t e da b o u tt h ek i n e t i c so fo i la n ds u r f a c ea c t i v i t ya n dc o m p o s i t i o no f s u r f a c t a n tw h i c hu s e 矿d i e s e la ss o l ec a r b o ns o u r c e t h eo p t h l l a ld e g r a d a t i o nc o n d i t i o n s w e r ee s t a b l i s h e d b yo r t h o g o n a le x p e r i m e n tm e t h o d t h ed e h y d r o g e n a s ea e t i v i t yw a s m e a s u r e db yt icm e t h o d i t sd e h y d r o g e n a s ea c t i v i t ya n dd e g r a d a t i o nc a p a b i l i t yw e r e e v a l u a t e d b i o a u g m e n t a t i o n w i t h h y d r o c a r b o nd e g r a d i n g b a c t e r i a p r o d u c i n g b i o s t t f f a c t a n tw a sa p p l i c a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a td s - ib e l o n g st ob a c i l l u s ，d s - mb e l o n g st op s e u d o m o n a s t h et w ob a c t e r i as w a i n sc o u l dp r o d u c eg l y c o l i p i da sb i o s u r f a c t a n t ；i p a k et h es u r f a c e t e n s i o no ff e r m e n t a t i o nl i q u o rd e c r e a s e t h e 矿d i e s e li nf e r m e n t a t i o nl i q u o rc o u l db e d 昭硼e d t o1 6 6 4 m g 几a n d9 1 7 m g l r e s p e c t i v e l yb yd s - ia n dd s 4 i if o re l e v e nd a y s 1 1 1 w h e nt h ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o nw a s4 6 7 9 m g l , t h ed e g r a d a t i o nr a t eo fd s - ia n dd s - m v c e r e5 1 6 m g ( l d 、a n d5 9 6 m g ( l d ) r e s p e c t i v e l y t h e i ro ud e g r a d a t i o na b i l i t yw a s r e l a t e dd e f i n i t e l yw i l hd e c r e a s i n gs u r f a c ee n e r g y t h ed e g r a d a t i o nr a t eb yd s mw i t h m 曲h y d r o p h o b i c i t yw a sq u i c k e rt h a nt h a tb yd s 1w i t hl o wh y d r o p h o b i c i t y t h em o s t s u i t a b l ee x p e r i m e n tc o n d i t i o n sa l e ：c n pb e i n g1 0 0 ：1 5 ：1 ，i n i t i a lp hb e i n g6 0 ， i n o c u l a t i o n 1 0 0 , 6 ，t e m p e r a t u r ei s 她3 0 。c a n o t h e re x p e r i m e n tw i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so f p o l l u t a n ti n d i c a t e dt h a tt h er e a c t i o na c c o r dw i t hm i c h a e l i se q u a t i o nb y d s 一a n dm i c h a e l i sc o n s t a n tk 。l 一1 5 9 j 6 v g l ，v r c - 11 0 6 p g ( l d ) d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y i sm o r ea c c u r a t et h a nb i o m a s st o 剐；s e s sd e g r a d a t i o n c a p a b d i t yd u r i n g d e g r a d a t i o n w h e nt h es o i lw a sc o n t a m i n a t e dw i t h10 0 m g g 矿d i e s e l , d u r i n gt h ep r o c e s s o f4 0 - d a yb i o a u g m e n t a t i o n , t h ed e g r a d a t i o nr a t eo fd s 4a n dd s - mi m p r o v e d r e s p e c t i v e l y b y1 8 5 5 a n d 4 2 6 8 c o m p a r e d w i t h t h a t i n l l a l l i r e c o n d i t i o i l k e y w o r d s ：h y d r o c a r b o n ，m i c r o b i a ld e g r a d a t i o l l ，h y d r o p h o b i c i t y ，b i o s u r f a c t a n t ， d e h y d r o g e n a 产表面活性剂石油烃降解菌降解机制研究 原创性声明及关于学位论文使用授权的声明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行 研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任 由本人承担。 论文作者签名：次数日期：2 q q2 整旦 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解陕西科技大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅和借阅；本人授权陕西科技大学可以将本学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他 复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：度筮导师签名：、笺杰龈日期： 产表面活性剂石油烃降解菌降解机制研究 1 文献综述 1 1 前言 被称为“工业血液”的石油是重要的工业原料和燃料，也是国民经济建设的重要支 柱。随着经济、工业的不断发展，石油的需求量大幅度增加，使得开采面积不断扩大。 但在石油的开采和使用过程中。由于种种原因，造成石油及其制品对环境的污染日益严 重。在开采、运输、贮藏、加工过程中，由于意外事故或管理不当，导致石油排放到农 田、地下水、海洋，使环境遭受污染，直接危害人类生产与生活。鉴于石油污染的严重 危害，已引起许多发达国家高度重视，不断采取措施治理石油污染。荷兰在8 0 年代已花 费了约1 5 亿美元进行土壤的恢复工作，德国在1 9 9 5 年投资约6 0 亿美元用于净化土壤， 美国9 0 年代准备在土壤恢复方面的投资约有数百亿到上千亿美元忆 生物修复技术，其中主要是微生物修复技术，被国内外学者定为最可行和最有效的 方法，与物理、化学修复方法相比，具有费用低、效果好、无二次污染等优势，在石油 污染水体和土壤环境发挥了越来越广泛的作用。经过多年的研究生物修复技术得到很大 发展，并在实际应用中证明，生物修复技术应用于石油污染的治理是可行有效的，是治 理大面积污染区域的一种有价值的方法。1 9 8 9 年美国应用投加营养和高效降解菌消除阿 拉斯加e x x o nv a l d e z 王子海湾油轮泄漏石油的污染闭；阿根廷1 9 9 2 年1 0 月曾在p u e r t o r o s a l e s 集散地施用肥料，靠土著微生物清除了7 0 0 【油罐的泄漏；科威特科学家采用微生 物技术成功地对污染地的石油进行了降解【3 】。我国作为世界十大产油国之一，石油污染日 益严重，利用生物降解石油烃在国内进行了大量的研究，但环境修复技术应用相对滞后。 目前，国内许多学者【4 胡1 针对石油污染以及含油污泥排放对水造成污染等环境问题，对筛 选高效微生物菌种、优化可能影响石油生物降解的环境因素、污染物的物理与化学性质 分析等方面进行了深入研究，以加快石油污染物的迅速降解，研究成果显著。 1 2 国内石油烃污染现状 全世界大规模开采石油是从2 0 世纪初开始的，当今世界上石油的总产量每年约有2 2 x1 0 h 。在石油产量激增的同时，每年全世界就有8 1 0 h 进入环境，污染土壤、地下水、 河流和海洋 9 - l l 】。据报道。近5 0 年来因油类污染已有1 0 0 0 多种海洋生物灭绝，海洋生物 己减少了4 0 。近2 0 年来，随着我国油田开发、海运等事业的发展，各港口、近岸水域 少量溢油事故也不断发生，石油污染水体面积也不断扩大。此外。石油在勘探、开采、 冶炼、使用、运输以及储存过程中的污染和遗漏事故，以及含油废水的排放、污水灌溉， 各种石油制品的挥发、不完全燃烧物飘落等引起一系列石油污染问题。特别是石油开采 陕西科技大学硕士学位论文 过程产生的落地原油，已成为土壤矿物油污染的重要来源，甚至引起地下水的污染。 我国自1 9 7 9 年原油产量突破1x1 0 、大关以来，勘察开发的油气田和油气藏已有4 0 0 多个。有关主要污染物的调查统计报告显示，1 9 9 8 年各石油、炼化企业工业固体废物生 产量为4 2 8 9 8 x i 0 4 t ，利用率低于5 0 ，年产石油污染土壤近1 0 5 t ，累计堆放量近5 0 x 1 0 4 t 。 以上数据只是对国有石油企业的污染排放调查统计，若考虑油田地区的相关地方企业排 污量以及突发事故造成的污染和泄漏，情况将更加严重【1 2 3 1 。在土壤石油污染方面，我 国华北油田周围的很多农田由于原油污染而无法耕种，每年都要支付大量资金作为对农 民的赔偿。据统计，我国现有的1 0 8 h m 2 耕地中，近2 1 07 h m 2 受到不同程度的污染。每 年由于土壤污染造成的粮食减产约2 5 i o s t 。在水体石油污染方面，黄河水系年平均含油 最高可达4 8 2 m g l ，辽河水系年平均含油最高可达7 6 8 m g l ，明显地超过了国家三级地 面水的标准( o 1 m g l ) ，有的甚至污染到地下水资源，全国各地的储油场所也开始渗漏 到地下水，严重污染了地下水资源的水质。此外，在近2 0 年中，我国百吨以上油污事故 已发生数十起，出现多次港口、近岸水域被石油严重污染的事件。石油污染是1 9 9 8 年发 生在渤海赤潮的主要原因之一h 川习。 1 2 1 石油污染环境的特征及危害 石油从气体、液体到固体，各种物质组分的物理化学性质相差很远。同时，不同的 物质的生物可降解性也相差很大，有的物质具有很好的可生物降解性，但有的则很难降 解进入环境中可残留很长时间。造成一种长期的污染与无机污染物相比，石油类有机 污染具有如下特征：( 1 ) 亏染物种类多，涉及范围广；( 2 ) 毒性大，有“三致”效应( 致畸、致 癌、致突变) ，危害巨大；( 3 ) 降解缓慢，中间产物复杂。 油类可以相互聚成油湿团块或黏附在水体中固体悬浮物上，形成油团，聚集在沿岸、 码头、风景区，形成大片黑褐色的固体块，破坏自然景观。研究发现石油污染会干扰 污染环境生物群落的正常生理生化活动，破坏化学信息联系，使生物的生长和繁殖受到 严重损害。人类直接摄取各种石油蒸馏物可发生各种中毒症状，影响肺、肠胃、肾、中 枢神经系统和造血系统，石油物质中的苯和多环芳烃类有致癌和致畸作用。溢油污染能 够存在1 0 年以上，使自然生态长期受到危害。油田区落地石油对土壤的污染多集中于 2 0 c m 左右的表层，由于粘着力强且乳化能力低，所以黏附在土壤表层的石油大部分不会 随土壤水上下移动。土壤表层常常是农作物根系最发达的区域，所以石油对土壤的污染 程度直接影响羁农作物的生长情况，使农作物遭受两方面的危害：其一。石油粘着在植 物的根表面，形成粘膜，阻碍根系的呼吸与吸收，引起根系腐烂，造成植物的死亡；其 二，由于对土壤的污染，会导致石油的某些成分在粮食中形成积累，影响粮食质量，并 进入食物链，进而危急人类健康i l ”。 可见，大量的石油污染物进入环境，不仅破坏生态平衡，制约了经济的发展，而且 2 产表面活性剂石油烃降解菌降解机制研究 影响到人类的健康和生存。 1 2 2 石油的基本性质及生物降解性 石油是地球在其形成的不同历史时期，由植物或动物等有机物的残骸生成的，属于 可燃矿物质【l ”0 j 。由于生成条件不同，其物理化学性质存在很大差异。石油中含有数百 种化合物，主要由烷烃、环烷烃及芳香烃组成，约占石油含量的5 0 8 0 ，简称石油烃， 其余为非烃类含氮、硫及氧等元素的有机化合物。石油烃类相对分子质量变化范围很大， 从甲烷( c h 4 ) 到相对分子质量为1 5 0 0 2 0 0 0 的烃类( 如c 1 2 5 h 2 4 3 ) 。石油烃类化合物可 分为4 类：饱和烃、芳香组烃类化合物、沥青质( 苯酚类、脂肪酸类、酮类、酯类、扑 啉类) 、树脂( 吡啶类、喹啉类、卡巴胂类、亚砜类和酰胺类) 。非烃组分可分为6 类： 含硫化合物( 如硫醇，硫醚，二硫化物，环硫化物，噻吩等) ，含氯化合物( 如吡啶、喹 啉、吡咯等) ，含氧化合物( 如酚类、羧酸类、酮类等) ，卟啉，沥青烯和痕量金属。在 痕量金属中，钒和镍的含量有时每升可达几毫克。石油元素组成变化范围不大。在大部 分石油中，碳含量为8 3 8 7 ，氢含量为1 1 1 4 ，硫、氮、氧等元素一般在1 4 。除上述5 种元素外，石油中还含有钒( v ) 、镍( n i ) 、铜( c u ) 、铁( f e ) 、铅饵b ) 、 钙( c a ) 、镁( m 曲、钠( n a ) 、钴( c o ) 、锌( z n ) 等金属元素和氯( c 1 ) 、硅( s i ) 、磷( p ) 、砷( 舳) 等 非金属元素，它们的含量都很少。石油不同程度的气味主要来源于少量的硫化物。石油 中胶质物质属于含氧化物( 脂肪酸类) ，它们含量少，但对石油加工过程影响很大。 烷烃是组成石油的主要成分，虽相对分子质量的增加。烷烃分别以气、液、固三种 状态存在于石油中。在常温下。从甲烷到丁烷是气态，是天然气和油制气的主要成分。 常温下c 5 c 1 5 的烷烃为液态。其中，含5 1 2 个碳原子的烷烃为汽油，其沸点在1 0 0 1 8 0 ；而9 2 2 个碳原子的烷烃为煤油、柴油和机油，其中煤油沸点在2 3 5 2 8 5 ， 柴油沸点在2 7 0 2 8 0 ，机油沸点在4 1 0 4 8 0 。c 1 6 以上的烷烃为固态，一般多 以溶解态存在于石油中，当温度降低时，就有结晶体析出，工业上称这种固体烃类为蜡。 机油、重燃油润滑剂和润滑脂含碳原子在2 9 3 6 之间。石油中正构烷烃中碳数一般达到 4 0 ，除主要含直链烷烃外，还含有支链烷烃。支链烷烃中最重要的是异戊二烯类化合物， 它以姥鲛烷和植烷为代表。支链烷烃无毒，可被多数微生物降解，但分支链越多越难于 生物降解。石油中环烷烃一般含5 6 个碳原子，环状排列，占石油含量的3 0 6 0 ， 除环戊烷和环己烷外，还有二环和多环烷烃。很重要的少量组分为甾烷、萜环类。环烷 烃含量高时，油品黏度大。环烷烃是润滑油的主要成分，微生物很难降解环烷烃。芳香 烃占石油含量的2 4 ，有单环芳烃( 如苯、甲苯、二甲苯) ，还含有双环芳烃( 主要 是萘) 、三环芳烃( 如葸和菲) 和三环以上的多环芳烃( 如苯并芘、苯并蒽多核芳烃) 。 芳香烃对生物的毒性最大，特别是多环芳烃，难以生物降解。 石油产品的可降解性随其组分的种类和分子量大小的不同而改变。从研究石油的生 陕西科技大学硕士学位论文 物降解角度出发，通常把石油分成四大类：饱和烃、芳香烃、沥青质和非烃类物质。微 生物对它们发生作用的敏感度不同，一般其敏感度由大到小依次为正构烷烃、异构烷烃、 低分子量的芳香烃和环烷烃【2 ”。由于“空间效应”支链烷烃比直链烷烃难以降解，因为分 支结构产生三碳和四碳原子，阻碍了b 氧化。环烃的生物降解一般需要两种或两种以 上的微生物的协同作用，而且c 1 0 以下的环烷烃对生物膜具有很高的毒性【矧。二环和三环 化合物较容易被降解，而含有5 个或更多环的芳香烃难于被微生物所降解【2 4 1 。胶质和沥 青则极难被微生物所降解，这些物质大量残留在生物降解的最终产物中，形成了降解后 的主要残留物质“矿化物”四1 。 石油烃的浓度直接影响微生物的活性和毒性。油浓度高会抑制微生物的活性。但不 同化合物发生抑制的浓度不同。通常，土壤中油浓度为l l o o o u g g 不会对普通异样菌产 生毒性【托翊。在有些情况下，污染物浓度相对高时，缩短了微生物适应时间，使微生物 耱群快速增加，从而规快污染物的降解；另一方面，某些易降解的化合物在高浓度下会 由于其毒性而抑制微生物的活性【圳。此外高浓度的烃通常会导致难分散的厚油层的产生， 从而导致营养物和氧的缺乏而抑制烃的生物降解【2 9 】。 l 。3 石油烃的微生物降解机制 1 3 1 石油烃降解微生物类型 动物、植物、微生物都具有降解污染物的能力，但微生物在污染物降解中的作用最 大。这是因为微生物具有种类多、分布广、个体小、繁殖快、比表面积大、容易变异的 特点。微生物的降解酶系具有氧化还原作用、脱羧作用、脱氨作用、水解作用、脱水作 用等各种化学作用能力，所以对能量的利用比高等生物体更加有效。微生物高速度的繁 殖和遗传变异性使它的酶体系能够以最快的速度适应外界环境的变化。从而显示出其在 环境治理上的高效性和多样性。 可以降解石油的微生物种类繁多，主要有细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等，此外蓝 细菌和绿藻也能降解石油中的多种芳香烃。土壤中最常见的石油降解细菌，数量由高到 低分别为假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、节细菌属( a r t h r o b a c t e r ) 、产碱杆菌属( a t c a l i g e n e s ) 、 棒状杆菌属( c o r y n e b a c t e r i u m ) 、黄杆菌属( f l a v o b a c t e r i u m ) 、无色细菌属( a c h r o m o b a c t e r ) 、 微球菌属( m i c r o c o c c u s ) 、诺卡氏菌属( n o c a r d i a ) 和分枝杆菌属( m y c o b a c t e r i u m ) 等。 最常见的石浊降鳃真菌，数量由高到低分烈为木霉属( t r i c h o d e r m a ) 、毒霉屡( p e n i c i t l i u m ) 、 曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 、森天属( m o r t i e l l a ) 等。很显然，细菌和真菌是土壤石油生物降解 的最基本的菌群。产孢子菌通常在生物降解中扮演了一个易被忽略的角色。虽然芽孢杆 菌从污染土壤中已经被分离出但是这可能归结于它在土壤中的很强的存活力和随后富 集分离过程中孢子的萌发，许多放线菌也表现出烷烃降解能力，但是它们很难在污染土 4 产表面活性剂石油烃降解菌降解机制研究 壤中取得竞争优势。 海洋环境中也广泛分布着石油降解微生物，其中最主要的是细菌，如假单胞菌属 ( p s e u d o m o n a s ) 、黄杆菌属( f l a v o b a c t e r i u m ) 、弧菌属( h b r i o ) 、无色细菌属 ( 彳c h r o m o b a c t e r ) 、微球菌属( m i c r o c o c c u s ) 、放线菌属( a c t i n o m y c e s ) 等。研究表明， 细菌对碳氢化合物的降解速率很大程度上受海洋环境中低含量的营养盐及含氧化合物所 限制3 ”。 石油污染环境的微生物治理技术研究几十年以来，目前应用最多的是通过投加经驯 化的土著微生物进行生物降低，但由于土著微生物菌群驯化时间长、生长速度慢、代谢 活性不高，也可加入一些适宜该污染物降解的与土著微生物有很好相容性的高效菌进行 生物修复。近年来采用基因工程技术手段，将有特殊降解能力的细菌的质粒转移到一些 能在受污染土壤中生存的菌体内，定向地构建高效降解的工程菌可更好的进行石油降解。 在微生物修复系统中存在的降解菌种类及数量影响污染物的降解效果。 1 3 2 石油烃的微生物摄取机理 烃类组分作为反应底物参与微生物的生化反应，由于微生物的代谢作用，土壤中的 有机污染物逐渐被降解。而微生物降解石油烃分为胞外酶降解和胞内代谢，在胞内代谢 生物化学反应过程中，其关键步骤是细胞膜对石油烃组分的吸附、吸收反应，即石油烃 的跨膜运输。目前，这一微观领域的研究仅仅停留在定性研究阶段，污染物质在微生物 细胞中降解的定量研究还很欠缺，其化学动力学过程和规律还不清楚。 1 9 7 9 年，y o n e z a w a y 等【3 2 】通过实验分析，研究认为当微生物对有机化合物的降解作 用是由其细胞内的酶引起时，微生物降解的整个过程可以分为三个步骤，首先是化合物 在微生物细胞膜表面的吸附，这是一个动态平衡；其次是吸附在细胞膜表面的化合物进 入细胞膜内，在生物量一定时，化合物对细胞膜的穿透率决定了化合物穿透细胞膜的量； 最后是化合物进入微生物细胞膜内与降解酶结合发生酶促反应，这是一个快速的过程。 上世纪9 0 年代，德国的h e i p i e p e r 和荷兰的d eb o n t 等【”琊】学者对水一油两相系统中 有机溶剂对大肠杆菌( e c o l i ) 细胞内的降解及其对细胞组织的影响做了深入的研究，检 测了荧光标记过的有机溶剂在膜中的扩散过程。美国密歇根大学f a n gj 等口6 j 运用液相色 谱电离喷雾质谱( l c e s i m s ) 比较了有机物( 苯、甲苯等) 对五种微生物的生理影响， 分析了微生物细胞膜的磷脂构成变化。 浙江大学王庆利掣3 7 1 在研究非水相生物转化和涉及有机溶剂的环境微生物技术的过 程中，研究得出：不同的微生物细胞，培养环境及生长状况不同，受到的有机物质( 溶 剂) 的影响也不同。有机物对细胞的毒害机理主要是大大增加了膜的通透性，破坏了它 的完整性，毒性的大小具体和溶剂的性质及细胞本身有关。 山东大学潘学芳等3 8 一1 对石油烃类运输的机理作了初步研究，运用气相色谱分析证 5 陕西科技大学硕士学位论文 明：细胞中石油烃类的运输有一定的选择性；而且，运输前石油烃类的某些组分是紧密 地吸附在细胞表面的，然后不加修饰地将这些组分运输到细胞内。这印证了前入的研究 结果，即微生物对石油污染物的降解分为细胞内和细胞外两种方式进行。 一般来说，石油烃进入微生物细胞可分为两个阶段，第一阶段是烃类从油相转移到 微生物细胞表面，第二阶段是烃类通过细胞壁与膜进入细胞内。在第一阶段即烃类的转 移阶段中，由于石油烃几乎不溶于水，所以微生物降解烃类时有水相、烃相、空气相和 微生物相同时存在，是一个很复杂的体系【4 2 1 。国外对此体系的研究主要集中于油相的烃 如何转移到细胞表面，提出了几种模式。目前比较公认的有三种： ( 1 ) 微生物细胞摄取溶解在水相中的烃类。这种微生物利用方式，被称为“单一扩散 溶解烷烃的摄取”模型。该模型只适用于水溶性芳香烃和气态烷烃，由于长链烃类 在水中溶解度太小，不足以维持微生物的生长，第一种模式存在的比率不高。 ( 2 ) 微生物细胞与比其大缛多的浊漓直接接触进两进行摄取。“与大浊滴直接接触”模 型认为，微生物细胞与比其大得多的以非水相形式存在的液滴相接触，假设基质的摄取 是在接触点通过扩散或主动运输进行的，其中底物对细胞接触表面积的有效性是微生物 生长的限制因素。因此在第二种模式中细胞可以附着的油滴表面积和细胞表面的疏水性 是降解的关键因素【4 3 】。通过相差显微镜可以观察到不动杆菌 c a l c o a c e t i c u s ) h 0 1 - n 附着 于烷烃液滴表面h 4 】。有些用烷烃培养的微生物形成复聚体，复聚体的形成可使细胞与烷 烃保持紧密接触，形成一种微环境。热带假丝酵母菌( c a n d i d at r o p i c a l i s ) 对烷烃也具有很 高的亲和力，这与细胞表面有一种与烷烃结合韵组分有关它是由苗露聚糖和4 的脂肪 酸组成m j 。 ( 3 ) 微生物细胞与比其小得多的假溶、拟溶或被包裹的烃类颗粒作用，进而进行摄取。 这种“微滴接触”模型是微生物细胞在非水溶性底物的诱导下分泌生物表面活性剂将 底物乳化成小液滴，形成烷烃一表面活性剂胶束，可使微生物有效地利用烷烃生长i 舶j 。 研究表明，烷烃液滴的界面面积与微生物的比生长速率之间相关，即烷烃液滴直径越小， 界面面积越大，比生长速率越大h j 。 在第二阶段中，国内外学者主要关注的是细胞壁在烃类渗入中的作用。这是由于烃 降解酶属于胞内酶，催化脂肪族烃降解的最初三个反应的酶是与膜结合的，在膜中进行 【4 町。 石油由不同烃类化合物组成，微生物对石油中不同烃类化合物的代谢途经和机理也 不同。 1 3 3 石油烃的微生物降解机理 石油产品物质的碳分布从气体到液体到固体，如气态的甲烷、液态的苯和固态的沥 青等几种不同形态的物质。在自然条件下。这些物质均可被生物降解，但能被生物降解 6 产表面活性剂石油烃降解菌降解机制研究 的程度和速度却相差很大。一般石油物质按照下列方式被降解： 石油产品+ 微生物+ 0 2 + 营养元素- - c 0 2 + h 2 0 + 副产品+ 微生物细胞生物量 就一般的烷烃类物质，依下列生物降解途径进行： r c h 2 c h 3 一r c h 2 c h 2 0 h r c h 2 c h o r c h 2 c o o h b 氧化 石油中的主要化学物质是烷烃、烷基芳香烃和芳香烃。碳元素在1 0 - 2 2 之间的烷烃、 烷基芳香烃和芳香烃是环境毒性最低的石油化学物质( c 1 0 - 4 2 2 2 ) ，也是可生物降解的，而 碳元素在5 6 之间的石油化学物质( c 5 - - 4 2 6 ) 在低浓度下可由微生物缓慢降解，碳元素在 1 4 之间的石油化学物质( c l - 4 2 4 ) 也是可以生物降解的，但只能是一些特殊的专门的降 解菌才能降解。碳元素在2 2 以上的烷烃、烷基芳香烃和芳香烃石油化学物质的水溶性极 低，这些物质在一般生物的生理活动的温度范围内是固体状态，因此生物转化非常困难。 烷烃类物质的b 氧化在某些环境中会受到阻碍，特别是一些带支链的烷烃类物质， 这时就有可能发生u 氧化，即在b 氧化受阻时，微生物在链烃的另一端的末端将甲基氧 化。 芳香族化合物受微生物的作用而降解有几个共同的步骤，即微生物细胞与化学物质 的相互作用过程。第一步，污染物通过自由扩散或者其它方式，主要是消耗能量的被动 形式，而进入微生物细胞内，消耗能量的主要形式如微生物细胞的主动吸收；第二步， 微生物产生合适的酶，酶在细胞体内与污染物芳香族化合物反应，生成一种中间物，或 者是苯环裂解的前体物；第三步，苯环裂解前体物在酶的进一步作用下而发生苯环裂解； 第四步，苯环裂解后被再转化为其他中间产物；最后，将各种裂解后的降解中间产物转 化为可被微生物细胞所利用的物质，最终代谢为简单化合物，如c 0 2 、c h 4 和h 2 0 等。 芳香化合物的有氧代谢必须有氧分子的参与，同时需要加氧酶的催化。单加氧酶和 双加氧酶分别催化不同的反应途径，使苯环开裂，行成容易降解的直链烃。一般而言。 真核细胞( 真菌等) 微生物是利用单加氧酶将分子氧中的一个氧原子引入芳香烃中，而 原核细胞生物( 细菌) 则常常利用双加氧酶。将分子氧中的两个氧原子化合至芳香化合 物中。 单加氧酶将氧原子导入芳香环中。形成中间产物环氧化物，中间产物通过水合作用 形成水合中间产物反式一二羟基一1 ，2 一二水合物，然后再转化为反式一二羟基化 合物。双加氧酶催化，将氧导入芳香环中，其初级代谢产物为顺式一二羟基二醇，这是 中间产物，然后再转化形成邻苯二酚。单加氧酶和双加氧酶的两条不同的降解途径都经 过邻苯二酚这个环节。邻苯二酚再通过邻位或间位途径形成三羧酸循环的中间产物。进 入三羧酸循环，产生细胞物质c 0 2 和h 2 0 。 1 3 4 微生物降解酶学研究 1 3 4 1 酶反应作用原理【4 ”列 7 陕两科技大学硕士学位论文 微生物细胞的所有活性依赖于底物的利用，而涉及到的所有化学反应都受酶的控制， 酶促反应速度受酶浓度、酶活性、底物浓度、p h 、温度及反应物等因素的影响，同时， 酶又是一类活细胞产生的，具有催化活性和高度专一性的特殊蛋白质，其催化活性很高。 对于酶的作用原理，学者们已经做过大量研究。当单位酶催化某一特定反应时，首 先它与底物( 指酶所作用的物质) 暂时结合，形成酶底物复合物，这种复合物是底物分子 贴补在大分子酶蛋白表面的一定部位上形成“一把钥匙一把锁”的配合，这个一定部位 称为“活性部位”，由于它与底物分子结合的化学基团有专一性的几何关系，所以它只能 接受互补关系的分子。在形成酶一底物复合物时，酶分子稍微扭曲，对底物分子的几何结 构施加部分张力。这就使得底物分子易受小或o h ，或者受酶的特殊功能基团的攻击。 这样，底物分子就转化为产物，产物从活性部位扩散离去，酶分子恢复到天然状态，再 与第二个底物分子结合，周而复始 1 3 4 2 酶反应动力学原理 酶首先与底物形成复合物，然后分解。得到游离的酶和反应产物。因此，酶与底物 的反应可以写成： 酶+ 底物h 酶一底物一酶+ 产物 表示为：e + s # e s 山e + p 2 式中：e 一酶：s 一底物；p 一产物；k j ，k 2 1 3 为动力学参数。 如果以一定数量的酶作为起点，然后把底物浓度逐步升高，就会有越来越多的酶转 化为复合物e s ；反应的速度递增，直到最后全部的酶都形成e s 复合物为止。 平衡常数可由下列公式计算：如：赠 底物浓度是决定酶反应速度的最重要因素之一，当酶反应速度达到最大值时，将反 应速度对底物浓度作图时，可以得到一段矩形双曲线，这可以归因于多种因素，诸如反 应的温度或p h 影响下的失活作用。底物浓度因酶的种类而异，同一种酶又因底物种类而 异，从曲线上很难找区别它们的差异。因此，在酶作用研究中采用了另一种方法，该方 法取决于初速度或最大速度半数值的测定。在达到最大速度半数值时，有一半的酶形成 e s 复合物，另一半呈游离态因为反应速度与e s 浓度成比例，所有k 。等于最大速度半 数值时的底物浓度 s 】，换言之，达到最大速度半数值时的底物浓度等于酶- 底物复合物的 解离常数。这个常数也称为米氏常数( m i c h a e l i s m e n t e nc o n s t a n t ) 或k 。米氏常数的数 值越大。意味着需要底物的浓度高，或酶对底物的亲和力弱。米氏方程为： v = v s ( 珞n + s ) ( 1 - 1 ) 8 产表面活性荆石油烃降解菌降解机制研究 式中： v - 基质生物反应速率( v ，。为最大速率) ； s _ 基质浓度。 d i x o n 和w e b b ，k a r l s o n 和g u t 雠u d 等人对微生物酶的动力学有更详尽的描述。对 于微生物对污染物的降解反应，其大多属于酶促反应，因此也遵循米氏动力学。而污染 底物在与微生物作用以及微生物分泌的酶反应过程存在着多个步骤，所以，由米氏方程 只能解释其化学动力学的部分环节，而不能反应出各个反应阶段的实际情况。这需要进 一步研究其降解变化机理，通过实验来研究其不同动力学模型。 1 4 石油污染环境微生物降解的影响因素 微生物对有机污染物质的代谢、转化及降解作用，是当今环境污染研究中最活跃的 领域之一。然而，土壤一有机污染物一微生物系统仍然是一个黑箱，人们对微生物降解 有机污染物质的机理还不清楚，有很多问题有待解决【5 3 】，这主要是因为土壤中石油烃类 有机污染物质的生物降解受到许多因素所影响，例如微生物、营养物质、氧气、p h 值、 含水率、土质、温度，以及污染物质的质量、数量和生物有效性等等 f , 4 - 5 6 1 。国内外许多 学者在影响石油生物降解速率的主要因素即烃类的组成与状态、烃类降解微生物、温度、 营养盐及p h 值等方面进行了深入而细致的研究1 5 7 - 5 9 1 。也有学者从微生物的生理生化特性 和生物能学的观点探讨碳氢化合物的降解，并着重探讨影响其生物降解速率的环境因子 与生物因子【删。另有学者认为烃类的生物降解往往取决于微生物细胞摄取烃类过程中烃 类的传质效果而不是细胞本身活性1 6 1 1 。因此各影响因素在降解过程中的影响大小及程度 是将来研究中值得探讨的方向。 1 4 i 降解烃微生物的适应性 在选择降解烃的微生物菌群之前，很重要的一点是考察烃是否能够较快地被生物降 解，即菌群是否能很块地适应有烃存在的环境。菌群对烃的氧化潜力提高的现象叫做适 应性。与适应性有关的三种机制是：( 1 ) 对特异性酶诱导或抑制；( 2 ) 基因改变产生新 的代谢能力；( 3 ) 选择性富集能转化目标化合物的微生物。通常生态系统中利用烃的微 生物数量反映其污染程度。 1 4 2 降解体系的环境因素 1 4 2 1 营养 在自然水体中，氮和磷的缺乏往往成为微生物降解石油烃类的限制因子。因此在水 中加入尿素磷酸、n - p - k 营养物、氨和磷酸盐( 包括不溶性氮源) ，尤其是含有n 、p 的 亲油性肥料，可以加速石油的生物降解速度。一般认为c ：n ：p = 1 0 0 ：1