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第三章蛋白质组与蛋白质组学,第三章蛋白质组与蛋白质组学,DNA,mRNA,蛋白质,转录,翻译,基因,蛋白质,细胞特异性基因表达,生理状态,蛋白质相互作用,温度,应激状态,培养条件,药物作用,数量有限,结构相对稳定,复杂性,多变性,直接反应生命现象,复杂的调控,第三章蛋白质组与蛋白质组学,第一节蛋白质组与蛋白质组学的定义,第二节蛋白质组及其质点的分离与分析,第三节蛋白质相互作用的研究,第四节蛋白质数据库及其应用,第一节蛋白质组与蛋白质组学的定义,第一节蛋白质组与蛋白质组学的定义,蛋白质组protein+genomeproteome一种基因组所表达的全套蛋白质一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质,蛋白质组学旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式从整体的角度分析、鉴定细胞内动态变化的蛋白质的组成、结构、性质、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间、蛋白质与大分子之间的相互作用与联系,揭示蛋白质的功能与细胞生命活动的规律,一、蛋白质组与蛋白质组学的定义,第二节蛋白质组及其质点的分离与分析,一、分离纯化,第二节蛋白质组及其质点的分离与分析,二、分析鉴定,一、分离纯化,（二）破碎细胞,（三）蛋白质混合物的分离方法,（四）蛋白质分离纯化的条件,（一）选择材料,所含目的蛋白质含量材料易得,一、分离纯化,（一）选择材料,一、分离纯化,（二）破碎细胞,机械法物理法化学法,根据蛋白质溶解度、分子大小及形状、电离性质、生物学功能的差异进行：1、根据溶解度2、根据分子量透析和超滤平衡离心凝胶过滤层析,（三）蛋白质混合物的分离方法,一、分离纯化,3、根据电荷毛细管电泳离子交换层析,一、分离纯化,4、根据蛋白质的亲和能力亲和层析,（四）蛋白质分离纯化的条件,缓冲液盐、金属离子和螯合剂还原剂去垢剂蛋白酶抑制剂表面效应蛋白质的环境因素温度储存,一、分离纯化,二、分析鉴定,（一）Western印迹技术基本操作步骤：蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质的电转移蛋白质与抗体的结合反应目标蛋白质的显示,western印迹基本步骤图示,Western免疫印迹,用于测定特定蛋白质的大小和含量,基本原理,将经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至固相支持体上，以针对特定蛋白质的抗体作为探针，与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位进行特异性反应，结合上的抗体可用二抗检测。,常用的二抗是与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的抗免疫球蛋白或A蛋白；实际应用中常常还需要设置适当的对照。,常需要内参蛋白量化蛋白量；GAPDH、ACTIN、ALBUMIN,将SDS-PAGE的高分辨能力与抗原抗体反应的特异性、敏感性相结合(灵敏度达到ng级)蛋白电泳在变性条件下进行，消除了蛋白溶解、聚集以及与外来蛋白共沉淀等问题,特点,免疫荧光法(immunofluorescence),主要用于检测目的蛋白在细胞内的定位。,基本原理,将待检的目的蛋白作为抗原，固定在载玻片上，先加上针对目的蛋白的抗体(第一抗体)进行反应，再加上针对第一抗体的荧光素标记抗体(第二抗体)进行反应，称作间接免疫荧光法。如果将荧光素标记在第一抗体上，则不用再加第二抗体，称作直接免疫荧光法。,特点,需要在荧光显微镜下观察结果；无法检测目的蛋白的大小；操作简便，但需设立必要的对照；,免疫荧光法(immunofluorescence),例1,例2,免疫沉淀(immunoprecipitation)技术,将抗体加入蛋白混合溶液，使之与相应抗原结合；加入固定的抗体结合蛋白(如:ProteinA-琼脂糖珠)；经离心后，与ProteinA结合的抗原-抗体复合物便可沉淀；将样品变性后即可获得游离的抗原蛋白；,基本步骤,基本原理,利用一种可离心沉淀的抗体结合蛋白(如ProteinA,ProteinG等)，将抗原-抗体复合物从蛋白混合溶液中分离，进行定量或定性研究。,为方便后续分析，在免疫沉淀前，常会对抗原进行标记。,免疫共沉淀(co-IP)技术,基于与蛋白质X的生理性相互作用，如果用蛋白X的抗体免疫沉淀X，则蛋白质Y也可能沉淀下来。Y的这种免疫沉淀被称为免疫共沉淀(co-immunocipitation,Co-IP)，此法最常用于测定两种目标蛋白质在体内的结合。,Y,裂解细胞免疫共沉淀蛋白质X,（二）二维凝胶电泳（2-DE),是目前蛋白质组研究中最有效的分析鉴定技术之一由两相组成：第一相：等电聚焦凝胶电泳根据蛋白质电荷差异第二相：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳根据蛋白质分子量差异,二、分析鉴定,二维双向电泳(2Delectrophoresis),基本原理,基于等电点与分子量分离蛋白质,IEF-focusedproteins,SDS-chargedproteinsinIPGstrip,SDS-chargedproteinsresolvedaccordingtosizesinSDS-PAGEgel,2-DE原理示意图,二、分析鉴定,2-DE分析的基本步骤,蛋白质溶解变性还原去除蛋白质杂志,利用不同pK固定化电解质可配置不同pH范围的凝胶或利用商业化软件设计,第一相电泳：IPGIFE平衡第二相电泳：SDSPAGE,考马斯亮蓝染色、银染色、铜染色,样品制备,IPG胶制备,双相电泳,染色,二、分析鉴定,2-DE获得的蛋白质图谱,二、分析鉴定,优点：可以同时直观显示数千个蛋白质点；缺点：耗时，耗力，目前无法自动化；难以分离疏水、具极端分子量或等电点的蛋白质（如膜受体蛋白、组蛋白等）。,二维双向电泳(2Delectrophoresis),silverstaining(3000spots),蛋白质染色,考马斯亮蓝染色银染：灵敏度高；“雪崩”效应；末端封闭铜染,通过2-DE得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点电脑信号。,(三)图像分析技术,二、分析鉴定,2-DE图像分析软件包操作过程：,图像采集,斑点检测,背景消减,获得蛋白质相关信息,图像内及图像间的比较,二、分析鉴定,放射性核素标记亲和标签法,正常细胞D0亲和标签,病理细胞D8亲和标签,混合并消化,生物素亲和纯化,液相色谱质谱联用分析,测量两个不同样品中蛋白质的相对丰度,二、分析鉴定,蛋白芯片(proteinchip)技术,将一系列“诱饵”蛋白以阵列方式固定在经过特殊处理的底板上，然后将其与待分析的样品杂交，只有那些和“诱饵”结合的蛋白才被保留在芯片上。其实质是酶联免疫吸附测定。,基于蛋白质表面化学及质谱检测的高通量蛋白质分析技术,蛋白芯片(proteinchip)技术,基本方法,蛋白质的结合：未经处理的样品(如血清，尿液等)直接点在芯片上，根据芯片表面不同的化学或生物特性结合相应的蛋白质；清洗减少非特异性蛋白(如盐及其它污染物)的结合；加能量吸收分子(EAM)：EAM能有效的吸收激光的能量，使样品分子进入气相并得到电离；用表面增强的激光解吸电离法(SELDI)将保留在芯片上的蛋白质洗脱下来；电离的蛋白质可以通过飞行时间质谱仪精确地测定它们的质量；,蛋白芯片(proteinchip)技术,从未经提纯的生物或临床样品中直接捕获、检测和分析蛋白质不需任何标记或加尾超高的检测灵敏度(1-50fmole的蛋白质)从超小样品体积(0.5l)到大体积(400l)快速获取实验结果,蛋白芯片(proteinchip)技术,ProteinChip的应用,蛋白质芯片,原理样品分子离子化后，根据不同离子间的质量和电荷比值（质荷比，m/e）的差异确定分子量。应用蛋白质的序列分析研究蛋白质的修饰,（五）质谱技术,二、分析鉴定,（六）其它方法,Edman降解法测定蛋白质多肽的排列顺序。核磁共振（NMR）、荧光光谱法测定溶液中蛋白质分子的结构。X射线衍射分析法、小角中子衍射法测定晶体蛋白质的分子结构等。,二、分析鉴定,第三节蛋白质相互作用的研究,二、蛋白质核酸间相互作用研究,一、蛋白质蛋白质,一、蛋白质蛋白质,（二）蛋白质之间的相互作用力,（三）蛋白质相互作用的研究作用,（一）蛋白质-蛋白质相互作用的形式,（一）蛋白质-蛋白质相互作用的形式1、蛋白质亚基的聚合2、交叉聚合3、分子识别4、分子的自我装配5、多酶复合体,一、蛋白质蛋白质,（二）蛋白质之间的相互作用力,氢键范德华力疏水键离子键,（三）蛋白质相互作用的研究方法,1、酵母双杂交系统,2、噬菌体展示,3、生物传感芯片质谱,4、定点诱变技术,蛋白质亲和层析亲和印迹免疫沉淀交联酵母双杂交噬菌体展示生物传感芯片质谱蛋白质工程中的定点诱变技术,研究方法,传统技术,新技术,1、酵母双杂交系统,DNA-BD具有与报告基因转录调控区特异结合的功能，DNA-AD则具有活化转录的功能。,报告基因,酵母双杂交原理示意图,DNA-BD和DNA-AD分开时不能激活转录，只有当两者在空间上接近时，才能呈现转录因子的活性。只有当proteinX与proteinY间发生相互作用时，才能激活报告基因的转录，而当两者单独作用时均无此功能。,酵母双杂交原理示意图,酵母双杂交(yeasttwohybrid),双杂交系统基本原理,双杂交系统应用,筛选cDNA文库中编码域已知蛋白特异相互作用的成分。,2、噬菌体展示（phagedisplay）,研究基因工程产品蛋白质间相互作用的方法。主要采用抗体基因文库的构建及随机多肽基因文库的构建和筛选。前者主要筛选基因工程抗体，后者筛选随机多肽药物。,图：噬菌体展示原理示意图,3、生物传感芯片质谱,以表面等离子激原共振（SPR）为基础的生物分子相互作用的分析技术（BIA）与MALDI-TOF质谱技术有机结合的方法。能定性和定量检测蛋白质间相互作用并对其进行鉴定。,4、蛋白质工程中的定点诱变技术,通过对蛋白质的编码基因进行特定位点诱变；改变蛋白质的特定功能结构域，然后鉴定特定蛋白质的结构对功能的影响。通过比较研究发现某些疾病相关或特异的蛋白质，即疾病的比较蛋白质组学。对临床疾病诊断与药物开发具有重要意义。,二、蛋白质-核酸,（二）滤膜结合,（三）甲基化干扰,（四）DNase足纹,（五）核酸-蛋白质杂交,（一）凝胶滞后试验,二、蛋白质-核酸,（一）凝胶滞后试验蛋白质可以与末端标记的核酸探针特异性结合，电泳时复合物较无蛋白结合的探针在凝胶中的泳动速度要慢，即表现为相对滞后。该实验可以评价蛋白与核酸结合的特异性。,图：凝胶滞后实验结果示意图,DNA-蛋白质复合物鉴定,延迟胶实验(gelretardation),蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，这种复合物较无蛋白质结合的探针在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的泳动速度要慢，即表现为相对滞后。而且根据复合物分子量的不同在凝胶中表现为不同的带型，每一条带即代表一种核酸结合蛋白。,也称作Bandshiftassay或Gelshiftassay等,基本原理,对含有特异结合位点的DNA片段进行末端标记；进行DNA和蛋白质的结合反应；非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、干胶及放射自显影；,DNA-蛋白质复合物鉴定,特点,简单、快速、具有高灵敏度和高分辨率可以在DNA片段混合物中鉴别出特定DNA结合蛋白的靶序列可以反映结合蛋白有否不同的亚基组合、几种不同的蛋白之间有否相互作用以及多个蛋白竞争同一位点通过加入竞争性抑制剂可以评价蛋白与DNA结合的特异性,DNA-蛋白质复合物鉴定,（二）滤膜结合法,利用硝酸纤维素滤膜不能结合双链DNA，但可与蛋白质结合的特性，将与蛋白质结合的DNA片段与游离DNA片段分离开。,二、蛋白质-核酸,（三）甲基化干扰,经甲基化修饰的DNA探针可以干扰蛋白质的结合。将DNA甲基化后与结合蛋白进行结合反应，只有在结合位点上未被修饰的DNA片段才能与蛋白结合。,DNA探针的末端标记及探针的甲基化,蛋白质与甲基化探针的结合及DNA蛋白质结合探针的分离,结合物及对照探针的化学切割,DNA片段的序列测定,甲基化干扰实验的基本步骤,二、蛋白质-核酸,甲基化干扰实验(methylationinterferenceassay),利用硫酸二甲酯(DMS)使DNA分子中的嘌呤碱基G与A发生甲基化，被甲基化修饰的G和A，会干扰DNA结合蛋白与所在部位的DNA结合；甲基化的探针可被化学试剂哌啶特异地切割，从而得到不同分子量的DNA探针片段。而与蛋白质结合着的DNA位点则不会被切割。,基本原理,用特殊方法将DNA从被修饰的碱基处进行切割，并经电泳分离，由于未结合蛋白的DNA可在随机修饰的位点被切割，而有结合蛋白的DNA在结合位点上未被修饰而不能被切割，由此可获得蛋白质与核酸定位结合的信息。,将待测双链DNA片段中的一条单链的一端用放射性核素标记甲基化修饰DNA探针，并使之与DNA结合蛋白反应；按电泳迁移率将游离DNA探针和DNA-蛋白质复合物分开，并回收分别用哌啶切割后在测序聚丙烯酰胺凝胶中电泳，放射自显影,基本步骤,哌啶切割,DNA-蛋白质结合位点的检测,DNA-蛋白质结合位点的检测,DNaseI足迹分析(DNaseIfootprintanalysis),DNA分子上的特定序列与DNA结合蛋白结合后，后者可保护该部位的DNA序列不受DNaseI的攻击。,基本原理,基本步骤,将待测双链DNA片段中的一条单链的一端用放射性核素标记；加入待测蛋白质，使之与末端标记的DNA形成复合物；加入适量的DNaseI进行部分消化，使DNA断裂为相差一个核苷酸的不同片段；标本经变性后在测序聚丙烯酰胺凝胶中电泳，放射自显影，使之出现以相差一个核苷酸为梯度的DNA条带。,也称作DNaseI保护实验，是体外鉴定DNA结合蛋白在DNA分子上的结合位点的实验方法。,DNase足纹分析是目前广泛用于蛋白质精确结合位点的研究方法。原理：DNase可以随机水解核苷酸中的磷酸二酯键，将DNA切成单核苷酸，而结合有蛋白质的DNA免于DNase的水解。,DNA-蛋白质结合位点的检测,DNA结合蛋白,有,无,DNA探针测序反应,DNase足纹分析原理示意图,（五）核酸-蛋白质杂交实验,蛋白质杂交,SDS-PAGE,TBE缓冲液中DNA蛋白质杂交,缓慢复性、封闭、预杂交,加入同位素标记的DNA片段作探针,多次洗膜,放射自显影,用于鉴定蛋白质与DNA的特异性结合和确定集合蛋白质的分子量。基本步骤：,蛋白质杂交,SDS-PAGE,转移至NC膜或Nylon膜,缓慢复性、封闭、预杂交,加入同位素标记的DNA片段作探针,多次洗膜,二、蛋白质-核酸,Southwestern印迹,一种核酸-蛋白质杂交实验，能够快速鉴定蛋白质与DNA的结合并测算所结合蛋白的分子量。,基本原理,待测的蛋白质样品经SDS-聚丙烯酰胺