4——细胞化学染色.ppt.ppt

临床血液学与检验-细胞化学染色,造血检验的基本方法,细胞化学染色检验,骨髓报告细胞化学染色,铁染色,中性粒细胞碱性磷酸酶（alp）,过氧化物酶（pox）苏丹黑,糖原（pas）,酸性磷酸酶（acp）,细胞化学染色,主要内容contents,细胞化学染色检验,酯酶染色,第二节、细胞化学染色检验p74,定义：血细胞化学染色是以形态学为基础，根据化学反应原理,将骨髓片染色,观察单个细胞内的各种化学成分、代谢产物等，了解它们的代谢活动和生理功能。鉴别各种类型血液细胞,细胞化学染色的临床应用,辅助判断白血病的细胞类型辅助血液系统等疾病的诊断和鉴别诊断观察疾病的疗效和预后发病机制的探讨,细胞化学染色检验,细胞化学染色方法,酶脂类糖原铁,造血检验的基本方法,固定,蒸汽固定甲醛液体固定-甲醛、乙醇、甲醇、丙酮；,造血检验的基本方法,细胞化学染色检验,有色沉淀反应,偶氮偶联法-nap、se、nse、acp联苯胺法-pox普鲁士兰反应-fe雪夫反应-pas金属沉淀法-nap-钙钴法,造血检验的基本方法,细胞化学染色检验,复染,使各种细胞有明显的对比度中性红甲基绿核固红亮绿,造血检验的基本方法,细胞化学染色检验,一、铁染色,原理：4fe3+3k4fe(cn)6含铁物质亚铁氰化钾fe4fe(cn)63+12k+亚铁氰化铁,造血检验的基本方法,细胞化学染色检验,结果判断,造血检验的基本方法,细胞化学染色检验,细胞外铁：存在于骨髓小粒的巨噬细胞中的蓝色颗粒外铁：+(+)约2/3人约1/3人(+)细胞内铁：存在于有核红和成熟红细胞内的铁；铁粒幼红细胞阳性率:19%44%无环形铁幼细胞及铁粒红细胞,细胞外铁,观察骨髓小粒中的铁阳性呈弥散性、颗粒状、小珠状或块状蓝色,细胞外铁（extracellulariron）,细胞化学染色检验,细胞外铁判定标准,实验结果显微镜下表现（-）无颗粒（+）有少数颗粒或偶见铁小珠（+）有较多铁颗粒或铁小珠（+）有很多铁颗粒、铁小珠及少数铁小块（+）有极多铁颗粒、铁小珠，很多铁小块密集成堆,细胞外铁（高倍镜）,细胞化学染色检验,幼红细胞核呈鲜红色，浆呈淡黄红色。铁粒呈蓝色，定位于胞质内。根据铁颗粒的多少、粗细将铁粒幼红细胞分为以下几种类型：typei:幼红细胞内含铁粒12粒typeii:幼红细胞内含铁粒35粒typeiii:幼红细胞内含铁粒610粒typeiv:幼红细胞内含铁粒10粒,细胞内铁（intracellulariron）,铁粒红细胞（siderocyte）:成熟红细胞中出现铁颗粒称为铁粒红细胞。铁粒幼红细胞（sideroblast）:胞质中出现蓝色铁颗粒的幼红细胞。环形铁粒幼红细胞（ringedsideroblast）：幼红细胞胞质内蓝色颗粒多于6个，围绕核周1/2以上的铁粒幼红细胞。,细胞内铁阳性阴性,细胞化学染色检验,细胞内铁（环状铁粒幼红细胞）幼红细胞胞质内蓝色颗粒多于6个，围绕核周1/2以上的铁粒幼红细胞,细胞化学染色检验,临床评价1.鉴别ida与非缺铁性贫血2.铁粒幼细胞性贫血3.骨髓增生异常综合症4.非缺铁性贫血,造血检验的基本方法,细胞化学染色检验,二中性粒细胞碱性磷酸酶染色（neutrophilalkalinephosphatasenap）（偶氮偶联法）,原理磷酸萘酚钠nap萘酚+重氮盐偶联ph9.6（亮红色沉着于胞浆中）结果nap主要存在于成熟中性粒细胞，其他血细胞均呈阴性反应。,细胞化学染色检验,中性粒细胞碱性磷酸酶染色（neutrophilalkalinephosphatasenap）（钙钴法）,原理-甘油磷酸钠nap甘油+磷酸钠nahpo4+ca（no3)2+（nh4）sco棕黑色（沉着于胞浆中结果nap主要存在于成熟中性粒细胞，其他血细胞均呈阴性反应。,细胞化学染色检验,1、胞浆中出现灰色到棕黑色沉淀者为阳性。,2、反应强度分为五级：-+淡红淡灰灰黑浅棕黑深棕黑色3、百分率：计数100个成熟中性粒细胞，计算阳性率。4、积分法：计数100个成熟粒细胞，按反应强度作出分级，将其百分率乘以级数，然后相加。,细胞化学染色检验,细胞化学染色检验,nap积分法计算100个成熟中性粒细胞的积分积分=(+)数量1+(+)数量2+(+)数量3+(+)数量4百分率=100个细胞中阳性细胞总数即为阳性率参考值:30130分（各单位应建立自己实验室的参考值）,注意事项1.标本要新鲜，否则酶活性会下降2.每次染色最好做阳性对照,细胞化学染色检验,类白血病反应慢粒白血病反应,细胞化学染色检验,参考值正常：阳性率：4089%积分：14-113分临床意义1.区别cml、类白血病反应积分为0;积分200分2.急粒积分;急淋积分;急单n或3.aa时pnh4.化脓性感染病毒性感染时,细胞化学染色检验,慢性粒细胞性白血病chronicmyeloidleukemia,细胞化学染色检验,慢粒阴性,细胞化学染色检验,急性淋巴细胞白血病,急性化脓性感染nap染色,慢性粒细胞性白血病alpchronicmyeloidleukemia阴性,三、过氧化物酶染色(peroxidase,pox)）,原理联苯胺法h2o2细胞内poxo联苯胺o联苯胺蓝+亚硝基氰化钠暗蓝色颗粒(定位于胞浆内)结果粒系：强阳性单核系：弱阳性淋巴系：阴性临床意义鉴别急粒和急淋,细胞化学染色检验,过氧化物酶染色(peroxidase,pox)）二氨基联苯胺法,原理h2o2细胞内poxo二氨基联苯胺o金黄色颗粒(定位于胞浆内)结果粒系：强阳性单核系：弱阳性淋巴系：阴性临床意义鉴别急粒和急淋,细胞化学染色检验,1min,6min,操作步骤,新鲜涂片,复方联苯胺溶液(或二氨基联苯胺）,加入等量1%过氧化氢溶液,水洗，待干，瑞氏复染1520min,水洗，待干，镜检,注意事项（1）标本要新鲜（2）掌握好h2o2的浓度，并要新鲜（3）在弱酸性环境中显色较为稳定（ph5.5）（4）加试剂要充分混匀，使染色均匀,pox结果判断,实验结果细胞表现（-）无颗粒（+）颗粒粗大聚集，约占胞浆面积1/4（+）颗粒弥散状分布，有一定空隙，约占胞浆面积1/2（+）颗粒均匀分布于胞浆或聚集，约占胞浆面积3/4（+）颗粒充满整个胞浆，无空隙,过氧化物酶（pox）,细胞化学染色检验,红细胞系统阴性,正常骨髓pox染色,各型白血病的pox反应,粒系白血病细胞淋巴细胞白血病细胞,细胞化学染色检验,临床评价,1.辅助鉴别急性白血病的类型急性粒细胞白血病aml（+）急性淋巴细胞白血病all（-）(阳性率3)急性单核细胞白血病amol（-/）,pox（+）可排除all,但pox（-）并不能排除anll或amol。,2.辅助鉴别急性早幼粒细胞白血病（apl)、急性单核细胞白血病（amol)、恶性组织细胞病（mh)apl呈强阳性反应amol呈弱阳性反应mh呈阴性反应,临床评价,四、苏丹黑b染色(sudanblackb,sbb),原理苏丹黑b（脂溶性染料）细胞质内含脂结构棕黑色或深黑色结果粒细胞系统：阳性（黑色粗大）单核细胞系统：阳性（黑色细小）其他细胞：阴性,细胞化学染色检验,临床意义,大致同pox;可用陈旧骨髓片,细胞化学染色检验,苏丹黑b染色临床意义,基本与pox染色相同，但其灵敏度及特异性有所不同。sb染色的特异性低于pox，pox阳性主要见于髓系细胞。sb染色的灵敏度高于pox，如急性粒细胞白血病pox染色阴性的患者，sb可见呈阳性。,五、糖原染色（过碘酸-雪夫反应）(periodicacidschiff,pas),【原理】过碘酸细胞内的糖原氧化双醛基+无色品红（雪夫碱）紫红色沉淀,细胞化学染色检验,涂片于95乙醇固定10min（dw冲洗）,高碘酸氧化1520min，冲洗，待干,雪夫染液染色3060min,亚硫酸溶液冲洗3次，每次2min,水洗，待干，镜检,甲绿复染1020min,操作步骤,注意事项1.雪夫氏试剂变红无效2.结果观察要及时，长期保存会褪色,正常血细胞的染色反应,粒细胞系统:分化差原粒呈阴性早幼粒以下均呈阳性，随细胞的成熟阳性程度逐渐增强嗜酸粒细胞颗粒不着色,颗粒间胞质呈阳性嗜碱性粒阳性,呈粗颗粒或块状,正常血细胞的染色反应,红系:有核细胞及成熟红细胞均呈阴性淋巴系:大多数呈阴性,少数呈阳性,粗颗粒巨核系及血小板:均为阳性,块状或颗粒状其它:浆细胞少数可呈阳性,巨噬细胞呈细颗粒阳性,正常血细胞的染色反应,单核系原始单核:阴性幼单核:(+)成熟单核:(+)(+)细颗粒弥散阳性,胞浆边缘粗颗粒,中性粒细胞pas染色分级标准,实验结果细胞表现（-）胞质无色（+）胞质呈淡红色，薄而透明，颗粒不明显，边缘有极少深红色颗粒（+）胞质呈红色，厚而不透明，有少量颗粒或边缘有较多深红色颗粒（+）胞质呈深红色，颗粒多或呈片状，颗粒较紧密，颗粒间尚有空隙（+）胞质呈深紫红色，颗粒紧密，颗粒无空隙,各系细胞糖原结果判断,细胞化学染色检验,淋巴细胞pas染色分级标准,实验结果细胞表现（-）胞质无色（+）胞质内呈弥散淡红色或有少数细颗粒（10个）（+）胞质内呈弥散较深的红色或有多数红色细颗粒（10个）（+）胞质内有较多红色粗颗粒或少数小块状红色物质（+）胞质内有多数红色粗颗粒并有大块状红色物质,各系细胞糖原结果判断,细胞化学染色检验,有核红细胞pas分级标准,实验结果细胞表现（-）胞质无色（+）胞质内有少数分散细小红色颗粒或浅红色弥漫物质（+）胞质中有110个中等大小的红色颗粒或弥漫较多的细小红色颗粒（+）胞质中有1120个中等大小的红色颗粒或弥漫细小红色颗粒，颗粒间有一定空隙（+）胞质中有粗大红色块状物质或有粗大致密的紫红色颗粒,红血病、红白血病（原始红细胞）,细胞化学染色检验,巨核细胞pas染色分级标准,实验结果细胞表现（-）胞质内无红色颗粒，但细胞内弥散性红色，此系其它多糖物质所致（+）胞质内含有数小块或一大块糖原，常定位于近核膜处（+）胞质内含有许多小块或较多大块糖原，定位于核膜处或分散在胞质中，约占胞质的1/3(+)胞质内含有许多大块糖原,分散于胞质中,占胞质1/2(+)糖原包涵体充满整个胞质,各系细胞糖原结果判断,细胞化学染色检验,临床应用,急性白血病类型鉴别：all-原幼淋巴多数阳性，粗颗粒或块状阳性aml-原粒细胞阴性或阳性，呈弥散阳性apl-早幼粒细胞呈弥散阳性，呈弥散阳性amol-原幼单核呈阴性或阳性，细颗粒状，胞质边缘及伪足处颗粒粗大红血病及红白血病-幼红细胞呈阳性或强阳性巨核细胞白血病-呈阳性或强阳性，呈颗粒状或块状,红血病、红白血病（原始红细胞）,细胞化学染色检验,淋巴细胞巨核细胞,急淋巨核细胞白血病,细胞化学染色检验,鉴别各类贫血,mds-幼红细胞呈阳性或强阳性ida、珠蛋白合成障碍性贫血-阴性或弱阳性巨贫、溶贫及aa-阴性,鉴别其他疾病,戈谢细胞尼曼-匹克细胞强阳性弱阳性nhl淋巴瘤细胞hd(r-s细胞)粗颗粒或块状弱阳性或阴性骨髓转移癌腺癌细胞呈强阳性,临床评价,阳性或强阳性：红细胞系统疾病：红血病、红白血病、mds淋巴细胞系统疾病：急淋（原淋、幼淋巴细胞）、慢淋、恶性淋巴瘤巨核细胞系统疾病巨核细胞白血病,细胞化学染色检验,（六）、酯酶染色esterase,萘酚as-d氯乙酸酯酶（nas-dce）t,-醋酸萘酚酯酶（-nae）,醋酸萘酚酯酶（nas-dae）,d,-丁酸萘酚酯酶（-nbe）,特异性酯酶粒细胞酯酶,中性非特异性酯酶,中性非特异性酯酶,单核细胞酯酶非特异性酯酶,酯酶染色esterasestaining,方法偶氮偶联法1特异性酯酶染色氯乙酸as-d萘酚酯酶染色（specificesterasestaining）2.非特异性酯酶染色non-specificesterasestaining）,-醋酸萘酚酯酶染色（a-nae),-丁酸萘酚酯酶染色（a-nbe）,醋酸as-d萘酚酯酶染色（nas-dae）,（nas-dce）,分类,（一）氯乙酸as-d萘酯酶染色naphytholas-dchloroacetateesterase,nas-dce,原理：氯醋酸as-d萘酚as-dnceas-d萘酚h2o不溶性红色沉淀+坚牢酱紫,细胞化学染色检验,结果阳性反应为胞质中出现红宝石色颗粒1粒细胞系统（+）2单核细胞系统大多数（-），个别（）3肥大细胞（+）4其他细胞（-）,粒细胞特异性酯酶染色,（二）-醋酸萘酚酯酶(-nae)(-naphythyolacetateesterase）,-醋酸萘酚nae-萘酚+重氮盐（坚牢蓝b）棕黑或灰黑色（胞浆中）,细胞化学染色检验,-醋酸萘酚酯酶-nae染色结果（非特异性酯酶）,细胞化学染色检验,急性单核细胞白血病acutemonocyticleukemia,细胞化学染色检验,临床评价,鉴别白血病类型；同时必须做naf抑制试验,细胞化学染色检验,2张相同标本同时固定后，配制2缸孵育液，其中一缸内加入naf（抑制酶活性），然后将2张标本分别放入2个缸内各自染色。最后分别进行积分，求出抑制率。（50）,氟化钠抑制试验（nafinhibittest）,naf抑制率,抑制前阳性率或积分,抑制后阳性率或积分,抑制前阳性率或积分,100,-,细胞化学染色检验,非特异性酯酶染色,细胞化学染色检验,结果,急性粒细胞白血病-原粒细胞弱阳性，不被naf抑制急性单核细胞白血病-原单核细胞阳性，被naf抑制；,细胞化学染色检验,非特异性酯酶+naf,-丁酸萘酚酯酶染色,原理:-丁酸萘酚酯酶在碱性条件下，水解其基质液中-丁酸萘酚并释放出-萘酚，后者与基质中重氮盐偶联形成不溶性有色沉淀，定位于细胞质酶所在部位一。,-丁酸萘酚酯酶染色,正常血细胞染色反应粒系:(-)单核系:分化差原单(-),分化原单好(+),幼单及成熟单核(+),+naf抑制淋巴系：t淋巴、非t非b淋巴（+），b细胞（-）其它细胞：巨核、幼红、浆细胞（-）或（），组织细胞（+）+naf未抑制,-丁酸萘酚酯酶染色结果,酯酶双染色,-醋酸萘酚酯酶+氯乙酸as-d萘酚酯酶-丁酸萘酚酯酶+氯乙酸as-d萘酚酯酶临床多用：anll-m4,酯酶双染,两种酯酶在同一张片子上染色,细胞化学染色检验,一种特异性酯酶染色加一种非特异性酯酶染色临床意义：粒、单核细胞白血病（m4）,酯酶双染,注意事项,标本必须新鲜，应于取材后两天内染色。重氮盐的选择。,七、酸性磷酸酶（acidphoshataseacp),原理：硫化铅和偶氮偶联法结果：胞质内出现棕黑色颗粒者为阳性（硫化铅）胞质内出现亮红色颗粒者为阳性（偶氮偶联法）,细胞化学染色检验,1偶氮偶联法磷酸萘酚as-bi萘酚as-bi六偶氮付品红红色沉淀,acp,ph5.0,方法及原理,3.抗酒石酸酸性磷酸酶染色(t-acp)acp共有7种同工酶(isoenzyme)(0、1、2、3、3b、4、5)，其中同工酶5的活性不被左旋酒石酸抑制。,l-tartaricacid,l-tartaricacid,(-),(+),结果胞质中有棕黄或棕黑色颗粒状或片状沉淀为阳性。,临床意义鉴别多毛细胞白血病，不被l-酒石酸所抑制,细胞化学染色检验,毛细胞白血病细胞,细胞化学染色检验,hclt-acp染色,骨髓细胞学检查,鉴别gaucher病与nienann-pick病阳性阴性,细胞化学染色检验,鉴别t细胞白血病b细胞白血病阳性阴性,b细胞白血病