5`RACE(Takara).ppt

宝生物工程（大连）有限公司,116600takarabiotechnology(dalian)co.,ltd.,cdna5,（5race法）,端的快速扩增法,(race:rapidamplificationofcdnaends),目的,扩增5端未知的基因（dna）序列,报告内容,使用试剂与方法实验例,实验使用的主要试剂,takara5takaralataq酶5条dna扩增用引物切胶回收试剂盒,-fullracecoreset,self-ligation法,5race原理,5race的实验方法,反转录（rt）反应。hybridrna的分解。单链cdna的自身连接。pcr扩增5未知区域。目的dna片段的切胶回收。dna序列测定。,体外转录psptetrna。配制psptetrna和人总rna的混合样品。设计合成5条引物。使用5race法获取psptetrna的5末端。切胶回收目的dna片段。进行dna测序确认序列结果。,（获取psptetrna的5末端）,实验例,psptetrna体外转录,psptetrna的电泳结果,rnamixture的配制,将psptetrna与人总rna按1：105的比例混合，此混合物用于5race实验。,人总rna的电泳结果,psptetrna的5端序列,aatacaagcttgggctgcaggtcaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttaatgcggtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcaggcaccgtgtatgaaatctaacaatgcgctcatcgtcatcctcggcaccgtcaccctggatgctgtaggcataggcttggttatgccggtactgccgggcctcttgcgggatatcgtccattccgacagcatcgccagtcactatggcgtgctgctagcgctatatgcgtgatgcaatttctatgcgcacccgttctcggagcactgtccgaccgctttggccgccgcccagtcctgctcgcttcgctacttggagccactatcgactacgcgatcatggcgaccacacccgtcctgtggatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgcctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattat,五条引物与psptetrna的位置关系图,未知序列,5,3,5条引物的详细序列,rtprimer：5-(p)aaaatgacccag-3f1primer：5-gtcctgtggatcctctacgc-3r1primer：5-agccactatcgactacgcgat-3f2primer：5-agcgcttgtttcggcgtgggtatggtg-3r2primer：5-ctggcgatgctgtcggaatggacgata-3,体外转录psptetrna。配制psptetrna和人总rna的混合样品。设计合成5条引物。使用5race法获取psptetrna的5末端。切胶回收目的dna片段。进行dna测序确认序列结果。,（获取psptetrna的5末端）,实验例,5race的实验方法,反转录（rt）反应。hybridrna的分解。单链cdna的自身连接。pcr扩增5未知区域。目的dna片段的切胶回收。dna序列测定。,step1.反转录反应,rnamixture10rtbufferrnaseinhibitor(40u/ml)amvreversetranscriptasexl(5u/ml)5磷标记反转录引物(200pmol/ml)rnasefreedh2oupto,3010分钟5030分钟802分钟4保存,1.反应液组成:,2.反应条件:,3.0mg1.5ml0.5ml1.0ml1.0ml15ml,step2.hybridrna的分解,1ststrandcdna反应液5hybridrnadegenerationbufferrnaseh(60u/ml)dh2oupto,30;1小时乙醇沉淀,1.反应液组成:,2.反应条件:,15ml15ml1ml75ml,step3.单链cdna的自身连接反应,step2的cdna沉淀物5rna(ssdna)ligationbufferdh2o40%peg#6000t4rnaligase(40u/ml),16;过夜反应,1.反应液组成:,2.反应条件:,8ml12ml20ml1ml,step4.pcr反应(1stpcr),step3的连接反应液10lapcrbufferiidntpmixture(2.5mmeach)primerf1(20mm)primerr1(20mm)takaralataq(5u/ml)dh2oupto,1.反应液组成:,2.反应条件如下:,1.0ml5.0ml8.0ml0.5ml0.5ml0.5ml50ml,943min9430sec5530sec7230sec,25cycles,step4.pcr反应(2ndpcr),1stpcr反应液10lapcrbufferiidntpmixture(2.5mmeach)primerf2(20mm)primerr2(20mm)takaralataq(5u/ml)dh2oupto,1.反应液组成:,2.反应条件如下:,1.0ml5.0ml8.0ml0.5ml0.5ml0.5ml50ml,9430sec5530sec7230sec,30cycles,2ndpcr反应结果,切胶回收电泳结果如下,step5.目的dna片段的切胶回收,step6.dna片段的序列测定,未知序列,5,3,测序结果与五条引物间的关系,psptetrna的5端序列,aatacaagcttgggctgcaggtcaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttaatgcggtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcaggcaccgtgtatgaaatctaacaatgcgctcatcgtcatcctcggcaccgtcaccctggatgctgtaggcataggcttggttatgccggtactgccgggcctcttgcgggatatcgtccattccgacagcatcgccagtcactatggcgtgctgctagcgctatatgcgtgatgcaatttctatgcgcacccgttctcggagcactgtccgaccgctttggccgccgcccagtcctgctcgcttcgctacttggagccactatcgactacgcgatcatggcgaccacacccgtcctgtggatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgcctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattat,使用rnaligase的5race法self-ligationmethodadaptor-addingmethod2.使用tdt(terminaldeoxynucleotidyltransf