（生物医学工程专业论文）新生儿苯丙酮尿症（PKU）荧光筛查系统的研究.pdf

a b s t i 认c t p h e n y l k e t o n u r i a ( p k u ) i s ag e n e t i cd i s e a s ea sar e s u l to fc h r o m o s o m ea b n o r m a l i t y , w h i c hc a nc a u s et h em e t a b o l i z a t i o nd i s o r d e ro fp h e n y l a l a n i n e i fl e f tu n t r e a t e d ，t h e d i s o r d e rw o u l dd a m a g et h en e u r a ls y s t e mg r e a t l ya n dc a u s en o n r e v e r s i b l em e n t a l r e t a r d a t i o na sar e s u l to ft h ea c c u m u l a t i o no fp h e n y l a l a n i n e t h e r e f o r e ，i ti so fg r e a t i m p o r t a n t a n c e t o d i a g n o s ea n dt r e a t e p k ua s e a r l y a sp o s i b l ef o rn o w b o m s u n f o r t u n a t e l y , t h e r ei sn od o m e s t i ci n s t r u m e n ts p e c i a l l yd e s i g n e df o rp k u s c r e e n i n g a tt h ep r e s e n tt i m e t h ea i mo ft h i sp r o je c ti st od e v e l o paf l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n s y s t e mf o rn e o n a t a lp h e n y l k e t o n u r i as c r e e n i n g m a i np o i n t sd i s c u s s e di nt h i sa r t i c l ea r el i s t e da sf o l l o w s ： 1 d e d u c e dt h er e a c t i o nm e c h a n i s mo fp h e n y l a l a n i n ea n dn i r d a y d r i n , b a s e do n w h i c hw ed e s i g n e dad e s i g n e dan e wr e a g e n tw h i c hu s e d i n p h e n y l a l a n i n e m e a s u r e m e n t f o u n dan e wm e t h o dt oa g g r a n d i z ea n ds t a b i l i z ef l u o r e s c e n c ea n da l s o w ed e v o l o p e dt h ef i r s td e m e s t i cr e a g e n tb o xf o rp k us c r e e n i n gt h r o u g hm a n yc l i n i c e x p e r i m e n t s 2 u s i n gam g hl u m i n a n c eu l t r a v i o l e tl e df o re x c i t a t i o ns o u r c e ，a ! y ”t y p ef i b e r w h i c hc o n s i s t so fq u a r t za n dg l a s sf i b e rw i t hd i f f e r e n td i a m e t e rf o rc o n d u c t i o no f l i g h t ，a na u t o f o c u sf i b e rf o rf o c a l i z a t i o n ，a n dap h o t om u l t i p l i e rt u b e f o rm e a s u r e m e n t d e s i g n e d an e wo p t i c a ls y s t e mf o r n e o n a t a l p h e n y l k e t o n u r i as c r e e n i n g a n d d e m o n s t r a t et h ef e a s i b i l i t yo fi ti nt h e o r y e x p e r i m e n t ss h o wt h a tt h i so p t i c a ls y s t e mi s s e n s i t i v e ，s i m p l e ，s m a l la n dl i g h t 3 a d o p t e dad o u b l e p a r a l m r a i lf r a m e ，a n du s e dt w om a r c h i n ge l e c t r o m o t o rf o r d r i v i n g ，f o u rs e n s o rf o rl o c a t i n ga n ds t a n d a r d9 6 - t i n y h o l eb o a r ds y s t e mf o rs c a n n i n g ， w h i c ha tt h es a m et i m eh a st h ea b i l i t y t om i xs p e c i m e n sa n dk e e pc o n s t a n t t e m p e r a t u r e 4 a d o p t e de m b e d d e d p cf r a m ef o rt 1 1 ed e s i g n i n go ft h eh a r dw a r ec i r c u i t so ft h e p k ud e t e c t i n gs y s t e mw h i c hh a sm u l t i p l ef u n c t i o n ss u c ha st h ep r e p r o c e s s i n go f e l e c t r i c a la n do p t i c a ls i g n a l ，a dc o n v e r t i n g ，s c a n n i n gd r i v i n g , t i n y - h o l eb o a r d s h a k i n ga n dc o n s t a n tt e m p e r a t u r ek e e p i n g ，e t c d e s i g n e dad a t ap r o c e s s i n gs o t h a r e u s i n gv c + + b a s e d o nw i n d o w s t h es y s t e mh a st h ea d v a n t a g e si nt h ef o l l o w i n g a s p e c t s ：h i g h l yi n t e l l e c t u a l i z e d ，e a s ym a i n t e n a n c ea n du p g r a d i n g ，s t r o n gs t a t i s t i c a la n d a n a l y z i n gc a p a b i l i t y , d i r e c ta c c e s st ot h ei n t e m e t ，e t c c l i n i ce x p e f i m e n si n d i c a t et h a tt h es y s t e mi ss t a b l e ，e a s i l yo p e r a t e d ，a c c u r a t e ， a n d 试也l o wc o s t , w h i c hm e e t st h ed e m a n do fc l i n i ca p p l i c a t i o n t h i ss y s t e m p r o v i d e san e wm e t h o df o rm a s sp k ud e t e c t i n g t h ep r o j e c ti ss u p p o r t e db yt i a n j i n s o c i a ld e v e l o p m e n tf u n da n dh a sb e e n a c c e p t e db yt i a n j i ns c i e n t i f i cc o m m i t t e e 。 k e yw o r d s ：p h e n y l k e t o n u r i as c m e m n nu l t r a v i o l e tl e d ，“y ，t y p ef i b e r , f l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n ，e m b e d d e dp c 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得鑫鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名 签字同期：易矿形一年7 月么r 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解吞盗盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 签名叫分学 签字同期：矽鄙- 年- 7 月z 同 导师 分互州_ 签字同期：p 户哆月文同 滞 第一章绪论 第一章绪论 1 1 新生几苯丙酮尿症及箕筛查的重要性 苯嚣酮嚣痣( p h e n y l k e t o n u r i a ，嚣u ) 楚一静交予入钵正拳染魏体缺貉，造 成新生几体内苯街氨酸代谢紊乱性疾病0 1 。1 9 3 4 年，p o l l i n g 首先诊断出智力发 育不全性苯丙酮尿症“。其发病机理是新嫩儿体内缺爰一种叫苯丙氮酸水解酶 ( 苯嚣氨酸羟纯酶“，曲e n y l a l a n i n e h y d r o x y l a s e ，p a h ) 的活性物威，两苯丙氨 酸零解酶酶作藤怒将蛋自质巾豹苯丙氨酸承解为酪氨酸，便于入体吸收霍翻霜。 由予酪氨酸的形成途径被阻断，血液中的举丙氨酸就不能被水解。苯丙氨酸通过 代谢旁路形成苯蹰氨酸及其衍生物引起苯丙氨酸浓发高出正常水平。如果在 婺j b 密生旱襄没餐褥交及簿诊羧秘浚疗，凌发弯过程孛，嵩浓度豹苯瓣氨酸会严 熏损害婴儿的神经系统，p k u 将导致病儿不可逆的智力障碍。但是，如果早期能 够确诊苯丙酮屎症，及时给烘儿喂养低苯丙氨酸的食品，就可以预防智力发育障 碍豹窭瑰，因此瓣耨生，l 出煞旱翅进行筛豢 # 常有意义。目前，对耨生) l p k u 的 筛凌已是国际公认重要筛套项鹾之一睁“稚，成为预防聪学领域豹一顼重要措施。 我国1 9 9 6 年己缀将p k u 筛查和甲状腺功能低下( c h ) 筛豢项目列入中华人民共 和嗣母婴保健法中，1 9 9 8 圣f - - 国家卫生部缀织编写了新生几筛查篱理办法， 势逐步痰莛瑟囊蔑薅查办法8 醅。 据报道，全球新生儿p k u 平均发病率的大约是2 5 0 0 0 分之一，我国目前筛套 绐槊显示其p k u 平均发病在1 5 0 0 0 分之一赢右“”“”。尤其我国华北嫩区是p k u 的 寒发区，发病搴农1 - 6 0 0 0 震窟。按照1 5 0 0 0 分之这一平均值计冀，我重拥有 1 3 亿多人西，舔年新出生入强在2 0 0 0 万麓右，每年将掰增添1 3 0 0 多p k u 惠，k 。 尽管苯丙酮尿癜的发病率并不高，但是它的危害却非常犬，它不仅影响下一代智 力的发育，也绘诲多家庭和社会带来不幸。所以对这些患儿及时诊断和治疗，避 免冀发生餐链落嚣，有羞极蘩重要鲍柱会爨义帮经漭意义。薪玺j k 疾癍豹藩查已 经成为提高我融人口素质的麓大措施。有统计报道，我幽对p k u 筛纛的成本与效 赫之比为1 ：3 7 “”，如果考虑进一步降低筛查成本，以及考虑我圈社会福利保 障铡度的不舔改誊，其比值迩会大大：增嬲。翔法国，其成本效益毙必l ：1 2 。2 。 踟能可觅其翡鼹被会效益和黢济效益。 我国政府对新生儿筛查工作非常重视。我国新生儿筛查始于8 0 锥代初，1 9 8 3 第一章绪论 年上海、北京、天津、沈阳簿城市首先开髅叛生，l 筛焱m 卜洲。1 9 9 2 年- 1 9 9 3 年 髓赛重生组织( w h o ) 秘里受帮在孛国七文城市( 多数为瀣海城市) 拜展了一个 新生几筛查合作项目，期间熬筛查了2 3 0 0 0 0 个新生儿，统计出p k u 和c h 的发病 率分别为1 1 1 1 8 6 和1 5 8 7 3 。1 9 8 6 年一1 9 9 9 年卫生部和芬兰政府农国内选择了 纛今毅生j l 多 | 纛孛心痿动了令会终顼嚣，蒡在瑟瑟阗嚣蠹又建立了近8 0 令薅 套实验室，主骚进行p k u 积c h 的筛查。1 9 9 9 年在卫擞酃临床检验中心建立了质 掇实验室，自谖年起每年进行3 次p k u 和c h 的质控梭旋，至2 0 0 0 年有3 2 个筛 鸯巾心参加该鹱量控制。1 9 9 9 年9 月在巾国预防医学会的直接主持下建立了中 鬻耨生豇筛套协会，2 0 0 4 零潮家卫生部又每发了薪象，b 疾病簿套技术筑范。 早在1 9 9 4 年我园颁布的中华人民共和豳母婴保健法中第二十四条明确规定； 医疗保健机构为产妇提供科举育几、合理营养和母乳喂养的指导。腋疗保健机构 霹装j l 送牙髂壤捡奎露预防援瓣，逐步嚣麓瑟垒，l 疾瘸簿奎、婴j 0 多发痣秘零见 瘸防治等医疗保健服务。卫嫩部对该条文的解释中明确指出：新生几疾病筛查愚 防治某些先天性代谢及内分泌疾病造成的儿童智力低下的有效方法。全国各地根 擐上述精神分别制定了实藏如法豹地方蛙法规，如天浮精划定了天津市实照 务法静逢秀靛法援，其牵第二十五条溅定：本泰建 藏新生儿疾病筛查制度。新生儿接生单位负责新生儿疾病筛查的取样和送检工 作；市卫生行政部门指定的暇疗保健机构负责新生几疾病的筛查工作，对新生几 接凳攀燕戆取榉鞠送捡遴孬羧塞夔控秘效务巍导。 1 2 目前国内外用于检测p k u 的方法及存在问题 1 2 1 目前国内外用于检测p k u 的方法 目前世界土用于检测苯丙氨酸的方法肖经典的细馘抑制法、荧光法、时间分 辨法瑷及褰效滚耀色涛法等黝侧。 1 细菌抑制法( b i a ) 蝴。撕 1 9 6 2 年美湖盖塞利( g u t h r i e ) 发明绷菌抑制法( b i a ) 。该法撼利用枯草杆 菌的变异株生长时需要苯弼氨酸，当在培券基中加入抗剡，则可抑制轱草轷菌生 袄。鲡盘滚串苯嚣氨酸含塞臻麓辩细蓥又生长使蓥琢交大，爱之，羹| j 夺。稷据蘩 环生长大小与笨丙氨酸标准衄片进行比较，即可得出嫩样中苯丙氮酸含量。此法 灵敏、简便、熬复性好、成本低、效率商，尤其是作成试剂盒以后，可以用于大 糕摸薪生，l 涨u 多i l 查，是墩毒誊豹一秘p k u 鹣鬻勰方法，继虫子我法是悫蛙分辑，速 度慢且假阳率离，所以哥前穗经趋于淘汰。 2 第一章绪论 2 。荧光分耩法( f i a ) 鼬卜椭) 一 由于荧光势亳哥法的灵敏发篱于其它光谬分析法2 _ 3 个数量级，逶瘸子微量分 析，血清中游离氨基酸含量甚微，一般方法难以定量测定。采用荧光分析法测定 其含量，不仅灵敏度高，方法特异、简便，而且血清用黧少，非常遗含临床诊断 莱魏先天毪爨基羧健滚缺陷瘸。只要测霉受捡者盘渣审游离苯嚣氨羧( p h e ) 瓣 禽麓，就可以诊断是否有苯丙酮尿症。采用多微量反威板( 微孔板，通常为9 6 孔) 作样品容器，这样一次可以进行大批擞检测。由予荧光分析是一种高灵敏度 寇爨分辑方法，冀检测方法镄便、抉捷、荔操终、重复性好、稳定燃舞。目翦采 用荧光分析法稔测雕u 特异梭、敏感性较麓，易于大规模酱查，它融经舞始逐步 替代半定量的抑菌法。 3 时间分辨法( t r f i a ) m 1 删 “露蘑分辨荧竞免疫技术”是最近足年叛发震怒酌一羹生秘貘学分辑技 术，其目的就嫩为了逐步或瀚部分取代传统“放射免痰分析方法”。8 0 年代初， 国外开始建立以双功能铕络食物为荧光发射体的时间分辨脉冲荧光免疫技术。此 静技术被认为燕炙l 受荧光标识物缺点豹出憩方法，是一秘有剖造毪的技零，并在 促遴生物医学的进展中起了熬要作用。由予它采用的示踪物不是荧光綮两是稀 元素，在紫外激发光照射下，会发出高强度光，且s t o k e s 位移较大( 约2 7 0 r i m ) ， 两艇荧光寿命长，它从时间、空间域上提取信号，极大地增强了分析灵敏度。这 秘穷法，灵敏震篱，毽是捡溯藩瑗复杂，戏本蹇，不逶会丈熬量箨套，可敬终荛 小批量进一步定量检测用。 4 高效液相色谱法( h p l c ) 吖蜘 苯嚣囊尿痰戆发痣骧嚣鼹患者苯嚣氨黢羟纯酶的缺隆，麸瑟罨| 致体内苯丙氨 酸( p h e ) 不髓旋常代谢为酪氨酸( t y r ) ，静者在俸内大鲞堆积并裁化为有害的 苯丙酮酸1 。利用高压液相燕要是利用它寓集作用，然胼在采用气棚色谱质谱联 用( 螨髑) 或是采用化学电离源选择离予舱方式用气相魏谱质谱( g c 吨i 嘲s s i m ) 遴弦分辑，瓣定p h e 窝t y r ，势逶过嚣定p h e 籀t y r 滋藿采薅查p k u ，这稃虿班壳鼹 假附性的产生。这种方法速度侠，准确性好，但是价格蹄贵，不适予犬人群筛查， 暂时不适合在我国推广。 男终，还鸯髑苯秀氨酸瓣氮酶法、聚会酶链反应( p c r ) 技术遴纾p k u 诊叛， 懊这种方法适会乎对已知有p k u 病症的家族进行检测。 比较上述方法，其中适用于大人群新生) l p k u 筛鹰的方法只有细菌抑制法和 荧光法。其中绷麓抑制法仅悬种半定量蒜至定性的方法，两荧光法是一静定量 戆精确熬方法，褥宅发震成纸舞徽量法更逡雳手象玺兑簿奎。今天墩赛往豹趋势 鼹用基于微量反应板的定量荧光法来替代半定量的抑荫法。 第一章绪论 美国等发逸冒家也已经撼p k u 薅查作为新生扎的一释强铡牲筛焱矮基，但各 霹研究梳籀熬焚光法和荧光分析仅礴楚予磺究开发阶段，还未推广磐及，只有芬 兰w a l l a c 和l a b s y s t e m s 公司融有产品推出。 1 2 。2 我国进纷毅生j lp k u 筛查面蠛的问题 国内的新擞儿p i ( u 筛餐工作在筛查方法上已经经历了从起步到达到国际水 平的过程。目前p k u 筛查方法由抑菌法到荧光法的过渡正在进行中。现在国内使 用熊基本为芬黧觐l l a c 积l a b s y s t e m s 公蠲豹多功能荧必检测纹器，毽其徐格暴 赛，尤其是对予高价检溅试帮的依赖，撬黼了检测成本，加之这些仪器均不是专 用p k u 检测仪器，有些功能凭用，不适合中国国情，不利于p k u 筛焱在我国的酱 及。另外，仪器灵敏度、检测速度还需要谯一步提高，操作界面需聚改进，以适 瘦今螽瓣络健舞葵。还骞，备实验室与鬻努公司所签是豹舍嚣基本鬟期，寻我潦 价的、适合我图大规模筛查的替代产品已缝是不可回谶的问题。为了使我国荧光 法的研究水平和国际保持同步，需要研究和开发一种肖自己独立知识产权的，可 以凌嚣内生产瓣、具有广泛使羯牲，可以赣我国终犀炎产品豹纹器。为燕，我们 率报了“新生j k 苯丙酮尿痉( p k u ) 荧光筛查系统的研究”课题，该谍题2 0 0 3 年 得剿了天津市社会发展基金( 0 3 3 1 1 1 5 1 1 ) 的资助。 + 据报道我嗣目前每年新擞儿p k u 筛纛人数只占总出生人数的2 ，绝大部分 穗送熬薪望，b 逐褥不妥正豢多攀套捡溪，该谍蘧夔磷究将琴提供廉徐、侠邃、准确、 筛鸯效率高等离性能的新生儿p k u 筛查用仪器，并配用国产新生儿p k u 检澳4 试剂 盒构成一种新溅的新生儿p k u 荧光筛查系统。这样就可以大大降低新生儿筛查的 成本，麸嚣接动我嚣薪生儿筛豢事业瓣发疑，为提嘉重涎毽康水平提供技术支持， 并将会带来鳃鼹的社会效益稀潜在的经济效益。 1 3 本课题研究的内容翱创毅点 i 3 1 本课题研究的主要内容 苯嚣氨酸荧光纯合魏的制餐：扶干燥滤纸片盘标本巾洗提出苯丙 氨酸与茚三粥形成荧光f 匕含物，经获试裁提高荧光茨应，使震锈 试剂以稳定荧光复合物。同时建立相_ 陂的标准物及质控物，并通 过临床试验与进口试剂比对，实现新艇) h p k u 筛查试剂盒的国产 诧。 2 以灵敏度赢、低功耗、低成本、小型化为原贝设计酉已套的荧光激 4 第一章绪论 发和检测光学系统： ( 1 )实验选取新型特殊波长( 3 9 5 n m ) 的紫外发光二极管作荧 光激发光源，简化激发光源系统结构，减小体积、功耗 和成本，同时提高激发光的单色性。拟通过稳定激发光 源的电源减小激发光源波动对测量的影响。 ( 2 )设计并制作特种y 型的光纤，一个分支采用石英光纤用于 传输紫外激发光束，另一个分支采用玻璃光纤用于传导 荧光( 4 8 5 n m ) ，并计算其传光效率。采用光纤光传输和 分光系统，大大减小光学系统的体积，使仪器整机更小 巧。 ( 3 )采用与国产试剂盒配套的紫外激发光波长和发射荧光波 长滤光系统，以得到单色激发光和提取高纯度的荧光。 使激发光与发射光的串扰抑制优于1 0 - 6 ，提高p k u 检测分 辨率。 ( 4 )设计荧光检测装置，选取侧窗型硼硅玻璃壳、锑铯光阴 极、暗电流较小、光照灵敏度高、具有极好的输出稳定 性的r 1 0 5 u h 特种光电倍增管进行光电转换。以获得较高 的检测灵敏度。 ( 5 )设计高稳定度光电倍增管偏置电源，以减小电源不稳定 对测量精度的影响。 ( 6 )因为待测荧光光谱是一变化较缓慢的直流信号，拟在系 统中设计低通滤波器，抑制电路中的噪声和高频干扰， 提高信噪比。 ( 7 )制作模拟试验装置，测试新型监测系统性能，调整装置 参数使输出结果最佳。 3 设计微孔板定位扫描精密机械系统：为进行大批量筛查，通常9 6 微孔板作为样品容器，一次可以进行9 6 个样品的监测，以提高筛 查速度。为保证检测精度和一致性，要求微孔板定位扫描系统定 位精度x 、y 均在0 1 毫米以内。同时，扫描机构还兼有对样品的 混合震荡以及恒温反应功能。 4 利用嵌入式p c 技术设计电路控制系统：应用嵌入式p c 技术，使仪 器控制更灵活，接口更丰富，软件应用更方便，通过设置网络接 口，可以实现网上数据统计。 5 荧光强度数据采集和分析：数据采集、数据分析和数据库软件的 第一章绪论 编写。实现数据采集分析，完成系统标定和修正，建立微机数据 库管理系统，实现新生) h p k u 数据存档、查询、跟踪复检和数据 统计等管理工作。 6 进行临床试验，并与进口标准仪器进行比对试验，完成线性补偿 换算和灵敏度、精确度评估。 1 3 2 本课题的创新点 1 苯丙氨酸荧光化合物的制备与完善，实现新生儿p k u 筛查试剂盒的 国产化，性能达到国外同类产品标准。 2 新型光纤荧光新生儿p k u 筛查光学系统的设计，选取新型超亮紫外 发光二极管作激发光源，采用y 型两种材料双直径光纤光传输结构， 并采用自聚焦光纤进行准直，大大提高光传输效率，增加了检测灵 敏度。并进行了理论推演和实验验证。 3 微孔板精密机械扫描系统结构设计，并兼有对样品混合震荡和恒温 反应功能。 4 首次将嵌入式p c 结构应用于p k u 检测系统中，使仪器结构紧凑、智 能化程度大大提高。 6 第二章干血片荧光法苯丙氨酸测试剂盘的研制 第二章干血片荧光法苯丙氨酸测试剂盒的研制 由于荧光分析法的灵敏度高，适用于微量分析，血清中游离氨基酸含量甚微， 一般方法难以定量测定。采用荧光分析法测定其含量，不仅灵敏度高，方法特异、 简便，而且血清用量少，只要测得受检者血清中游离苯丙氨酸( p h e ) 的含量，就 可以诊断是否有苯丙酮尿症。为了进行大人群p k u 筛查，通常采用干血片式荧光 检测法，所以，于血片荧光法苯丙氨酸检测试剂盒的研制将是课题的关键之一 本章将就荧光产生的基本原理、干血片荧光法苯丙氨酸检测试剂盒制作原理及方 法进行探讨，并通过临床对比试验，得到能够满足临床筛查要求的国产苯丙氨酸 检测试剂盒。 2 1 荧光的产生机理 荧光的产生过程包括分子的激发及去活化两个阶段。 2 1 1 激发 当物质吸收了一定频率的辐射能之后，分子中的电子由原来的基态跃迁至激 发态的不同振动能级，这一过程称为激发“7 1 。大多数分子在室温下处于基态的最 低振动能级。通常分子里的价电子数目是偶数，若一半的自旋方向正好与另一半 的自旋方向相反，价电子自旋量子数的总和为零，即s = o ，自旋的多重态 m = 2 s + i = i ，这类分子我们称它处于单重态，用s 表示。个别物质的分子正向自旋 和反向自旋电子数不相等，两者相差为2 ，s = i ，m _ 3 ，我们称这类分子处于三重 态，用t 表示。基态分子和激发态分子都有单重态和三重态两类。单重态的电子 基态( s 。) 的分子被激发时，容易跃迁到单重态的电子激发态( s ，s z ，) ， 而不容易跃迁到三重态的电子激发态( t 。，t 2 ，) ，后一种为电子自旋不允许 的禁止跃迁。同样，t o t 。或t 。一t o 容易，t 一s 。或s 一t o 难。荧光( 或磷光) 所 涉及的分子，其基态都处于单重态，具有最低的电子能。 图2 1 表明处于单重态的电子基态和电子激发态分子与处于三重态的电子 激发态的差别。 7 第二章干血片荧光法苯丙氨酸测试剂盒的研制 嗍 抬 捌 蒜 水 电 图2 - 1 基悉、激发早重态捌= 重悉甲电于分布 2 1 2 激发态分子的去活化 激发态分子所处的是不稳定的状态，它可以通过辐射跃迁和非辐射跃迁等分 子内的去活化过程失去多余的能量而返回基态。 ( 1 ) 辐射跃迁过程 辐射跃迁去活化过程发生光子的发射。原则上每一个激发态都可以通过发射 光子退回到基态。在实际中，几乎只观察到分子从最低激发态的发射，而极少从 较高的激发态发射。由第一电子激发单重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象 称为荧光；而由最低的电子激发三重态所产生的辐射跃迁，其发光现象称为磷光。 磷光的发射必须改变自旋状态，因此这一发射过程的速度比荧光慢得多。 ( 2 ) 非辐射跃迁过程 在无发光伴随下从最低激发态( s 。或t i ，) 到基态s 。的去激过程叫非辐射去 活化。非辐射跃迁包括：内转化( i n t e r n a lc o n v e r s i o n ，i c ) ，指相同多重态的 两个电子态之间的非辐射跃迁( s 。一s 。，t 2 一t i ) ；系统间交叉或称体系间窜跃 ( i n t e r s y s t e m c r o s s i n g 。i s c ) ，指不同多重态的两个电子态问的非辐射跃迁( s l t 。t 。一s 。) ；碰撞振动弛豫( v r ) 等等。典型有机分子的重要辐射和非辐射的 弛豫过程见图2 2 。 较高振动能级上的分子很快地( 约l f f ”s 1 0 1 。s ) 发生振动弛豫，落到该电子 的最低振动能级( v _ 0 ) 。激发单重态间的内转化速度很快，更高激发单重态s 。 以上的寿命很短( 1 0 。1 。s 。1 0 1 3 s ) ，在辐射跃迁发生之前，便内转化及振动弛豫落 到s 。电子态的最低振动能级。所以观察到的荧光现象，通常情况下是发生自s 一 态的最低振动能级的辐射跃迁。发生于单重态三重态之间的系统间交叉属自旋禁 第二章千肌片荧光法苯荫氨酸测试剂禽的研制 一 j t t 一v r 工，名1 、 ；l r 酱q ， 。 i + 砰1 s 。韫 寸 沪 囊 鞭主 十 十 ，1 1f、 (w 血 ，r wi 0 二： 典整骞蠛努争豹垂魏l 过程耀实线寝零) j # 辐瓣溉攮过程t 用波蔽缝鬏示) 聃工，r _ 振动自缎i 一噘收鞯共振荧光， 船一普通髓光p 一磷光，v r 一碰撞振动弛1 蠹l i c 一内转换，i g c 一系统间突叉lr g - - 化学成成 圈2 2 典鳖裔嵇| 分子的重甏辐射过程鞫# 辐身| 貔豫避糕 止过程，速度常数较小，所以液态溶液中很少观察到磷光。因为在发射蒙光以前 裁鸯一帮势嚣意蔹溃耗，溪淡发象熬荧您毙量要魄吸投嚣戆量夺，毽藏是荧毙 的特征波长比l 致收的特征波长要长些。 2 2 荧光分耩法 利用某些物质被紫外光照射后所产生的、能够反映出该物质特性的荧光，以 进行该物质的定性分析和定燃分辑的方法称为荧光分拼法h 町。任何发射荧光的分 予器菇青嚣令特征光谱：激发觉谱秘发瓣瓷谱，它稻蹩瘸荧竞分褥法遗行定量瑟 窳性分析的基本参数和依据。荧光激发光谱( 简称激发光谱) 就是通过测量荧光 体的发光通量随波长变化而获得的光谱荧光发射光谱。产生荧光的第一个必要条 黪跫该兹质豹努子必须其骞警掰照射豹必线握嚣豹频搴，这与势子戆缝构密甥稳 关；第二个登饕条件是吸收了与本身特种频率相同的能慧之后的分带，必须具有 离的荧光效率”w 。 2 。2 。1 荧光分橇法具有以下足个饿点 ( 1 ) 灵敏度高，常达亿分之一，甚黧千亿分之一# ( 2 ) 选择性简。主要是 9 魏 第二章予m 片荧光法苯荫氦酸测试剂盒的研制 针对有杌纯含物嚣言，只要蔽剃荧光分光必度计中激发毙和荧光单识诗的波长， 便霹褥至逸释谯嶷好的方法；( 3 ) 荧免分耩法还有方法俊蕤、重现後好、取样容 易、试样需要擞少等优点8 “。 2 2 + 2 溶液荧光毙谱的特征 ( 1 ) 斯托克斯做移( s t o k e ss h i f t ) ：在溶液荧光中，所观察到的荧光波长总是 大于激发光的波长，斯托克斯于1 8 5 2 年莆次观察到这种波长移动的现象，所以 鼗糖现象称为矮撼尧赣燕移。簸踅竟簸搜移圣隽骥在激发秘发羹雪之翅存在着一定豹 熊慧损失。 ( 2 ) 激发光谱的形状和吸收光谱的形状极为近似，逸憋因为物质分乎吸收能量 的道程就是它的激发过程。 一 ( 3 发袈光谱瓣形获释激发毙黪波长无笑( 个澍纯含携除舞) ，这怒溺必荧竞发 射的产生是由籀一电子单线激发态的最低振动能级开始的，而和荧光物质原来被 激发到哪个电予自级无关。 ( 4 ) 荧悫光谱翔吸收光谱麓影姨援为穰 鼓，且呈镜像瓣爨：关系。逸楚嚣为吸唆 光谱中第一吸收带的形成怒国基态分子被激发至第一电子激发态巾备个不两搬 动能级所致，所以其形状决邂于第一电予激发态中能级的分布情况；荧光光谱的 形成是由于激发分子从第一峨予单线激发悫的最低搬动能级辐射跃迕至基态的 务令不弱蒹动熬级所零l 超豹。掰班荧光毙游豹形狡与蕊态孛振动能缀豹分毒请凝 脊关。一般情况下，基态和第一电子激发态中能级的分布情况棚类似。根据 f r a n k - c o n d o n 原理，电子跃迁速率非常之快，以致跃迂过程中核的相对位置近 叛苓变，爱以焚悫光谱帮吸收必潜之藏爨镜像对豫关系。 2 2 3 荧光和分子结构的关系 产生荧光的曾要条件是物壤分子必须舆有吸牧的绻擒蚴，即生色邂( 分予中 暴有吸收特链频率的光能静麓函) 。其次麓该物质登须蹙有一定的纛予产率帮逶 崴的环境。分予中能发射荧光的基团叫荧光团。一种物质吸收光的能力及量子产 攀又与物质所处的环境紧密相关。所以，环境( 如溶剂、p h 值以及温度等) 常 鬻建勃囊量子产率毫纛，甚篪毙否产生荧党戆重要嚣豢捧鞋。 判断化合物能否产生荧光，一般可以从以下几个方面来分析； ( 1 ) 碳原子骨架荧光通常发生于具有皴轭双键体系的分子。这种体系中的丌 彀予共耗度越大，则 # 定域菇电子越易被激发，荧搬魄裁越易产嫩，嚣虽荧光 光谱将向长波移动。所敬绝大多数产鸯荧光静物质会青芳香琢或祭环。任俺有 利于提高丌电子共轭度的结构改变，都将提高荧光效率，或使荧光波长向长波 l o 第二章干血片荧光法苯丙氨酸测试剂盒的研制 方向移动。 ( 2 ) 分子的几何排布具有强烈荧光的有机分子，多数具有刚性的平面结构。 如果一种有机分子本来不发荧光，但与金属离子形成络合物时，使分子变为平面 构型，就可能发出荧光。 ( 3 ) 取代基的类型和位置在芳香化合物的芳香环上，进行不同基团的取代， 对该化合物的荧光强度和荧光光谱都将产生很大的影响。取代基可以分为三类： ( a ) 加强荧光的如：一o h ，一o r ，- n h 2 ，一n h r ，- n r 2 ，- c n ，一0 c h 3 ，一0 c ：h 5 ； ( b ) 减弱荧光的如；一c o o h ，_ c = 0 ，一n 如，- n o ，一s h ，一f ，一c 1 ，一b r ，一i ； ( c ) 影响不明显的如：一r ，一s o a l ，_ n h 3 + 双取代和多取代化合物对非定域矩电子激发的影响较难预测。取代基之间 如果形成氢键，并从而增加分子的平面性，则荧光加强。分子所处的环境，如溶 剂、温度、p h 值等会影响分子的结构和立体构象，从而就会影响分子的荧光。 除此之外，立体异构现象对于荧光强度也有显著影响，顺式和反式同分异构 体具有不同的荧光强度。 2 2 4 环境因素对荧光光谱和荧光强度的影响 溶液中的环境因素对分子荧光会产生强烈的影响”，通过了解和利用这一重 要因素，可以提高荧光分析的灵敏度和选择性。 ( 1 ) 溶剂的影响许多荧光体，尤其是芳环上含有极性取代基的荧光体，其荧 光光谱易受溶剂的影响。其影响有两种，一种为一般的溶剂效应和特殊的溶剂效 应。一般的溶剂效应指溶剂的折射率和介电常数的影响，特殊的溶剂效应是指荧 光体和溶剂分子之间的特殊化学作用，如氢键的生成和配合作用 ( 2 ) 温度的影响温度对溶液荧光的影响十分明显。一般来说，随着温度的降 低，荧光物质溶液的荧光量子产率和荧光强度将增大，这是因为，随着温度的降 低，介质粘度增加，荧光物质分子与溶剂分子的碰撞机率也随之而减小。溶液温 度的上升致使荧光强度下降的一个主要原因是分子的内部能量转化作用，亦即将 激发能转换为基态的振动能，或者通过碰撞将能量转移给其它分子。 ( 3 ) p h 值的影响对于大多数含有酸性或碱性基团的芳香性荧光物质来讲， 其荧光光谱对溶液的p h 值非常敏感。由于基态和激发态电荷分布情况不同，但 分子由基态被激发至较高的激发态时，其偶极矩会发生改变，因而它们的化学性 质也有所区别，溶液的p h 值的改变将会影响到基态分子或激发态分子的酸碱性 质。而弱酸和弱碱的分子和离子可视为不同的型体，各具有自己特殊的荧光光谱 和荧光量子产率，只有严格控制溶液的p h 值，才能达到最好的灵敏度和准确度。 ( 4 ) 溶液粘度的影响化合物受溶剂粘度的影响，一般来说，是随着介质粘度 第二章干血片荧光法苯丙氮酸测试剂盒的研制 的升高而增加。这是由于介质粘度增加，减小了荧光物质分子与溶剂分子的碰撞 机率，从而减少了能量损失的结果。 ( 5 ) 氢键的影响荧光物质和溶剂或其它溶质之间发生氢键作用对于荧光物质 的荧光光谱和荧光强度有着显著的影响。荧光物质和溶剂或其它溶质之间发生的 分子间氢键可能有两种情况：一种是在激发前基态的荧光物质分子便与溶剂或其 它溶质分子产生氢键配合物。这一情况下荧光物质的吸收光谱和荧光光谱都将由 于与溶剂或其它溶质分子形成氢键配合物而受到影响；另一种是在激发之后由激 发态的荧光物质分子与溶剂或其它溶质分子产生的激发态的氢键配合物。此种情 况下，由于只在激发之后才形成激发态的氢键配合物，因而只有荧光光谱才受到 氢键作用的影响。随着溶剂的氢键供体能力的提高，荧光物质的吸收光谱和荧光 光谱将向长波方向移动。 ( 6 ) 重原子效应有一类溶剂效应，既不是由于溶剂的极性，也不是由于溶剂 的氢键性质引起的，而是由于溶剂分子中含有高原子序的原子引起的，这种效应 即为外重原子效应。重原子效应可能影响到溶质的荧光强度。 ( 7 ) 表面活性剂的影响表面活性剂的胶束水溶液在光学上透明、稳定，光化 学上是非活性的，价格便宜，使用方便，毒性小，而且对荧光测定具有增溶、增 敏和增稳等独特的性质，是提高荧光测定灵敏度和选择性的有效途径之一。 ( 8 ) 光解作用和光互变异构现象用作激发光的强紫外光辐射，有时甚至是可 见光辐射，可能会引起某些荧光化合物发生光解作用等光化学变化而受到破坏， 结果使得荧光强度的测量信号随着光照的时间而逐渐下降。在某些具有多功能团 的分子中，如至少含有一个碱性基团和一个酸性基团的质子提供基团的分子，在 激发之后，可能使受体基团的碱性和供体基团的酸性都变得足够强，以致在供体 基团失去质子的同时质子为受体基团所俘获，这就是激发态时的互变异构现象， 称之为光互变异构现象( p h o t o t a u t o m e r i s m ) 。 ( 9 ) 散射光和拉曼光的影响散射光和溶剂的拉曼光对荧光分析有显著影响， 常常成为荧光分析方法灵敏度的主要限制因素 ( i 0 ) 其它溶质的影响有机分子的荧光不仅由于溶剂效应而受到影响，也会因 为与其它溶质的相互作用而受到影响。荧光体可能与其它溶质发生化学反应、能 量转移、电荷转移或者碰撞作用等过程，而导致荧光体的荧光淬灭现象。 2 3 溶液的荧光强度与浓度的关系 2 3 1 荧光的寿命 荧光分子的平均寿命( t ) 为：当不存在进一步的激发时，处于激发态的分 第二章千舰片荧光法苯丙氨酸测试剂盘的研制 予数霉衰减到翘始篷豹i e 掰经历的时阅，用下式表示 ( 2 - i ) 式巾，骜：秀荧必发袈熬速率鬻数；x 为套耱 辐麓去溪纯过疆懿逮搴豢数总秘。 荧光强度的衰炎一般遵从如下速率方程式 ；在菜一滋度下，滠溲翡保持嚣孛游瞧与荧竞强璇骞关，傈潺定辩蕊惹， 荧光强度达到黢高值，以后邂渐下降，通常以6 5 7 0 c 保温6 0 r a i n 为最佳。保温完 毕加入铜试剂麟，荧光值约稳定9 0 m i n ，以后逐渐下降；另外，荧光测定中如遇 渗灭勃凄，将致荧光蘧下降，霆魏爱援戆玻璃容器必须溶净，嚣懿容器多采瘸锻 爨反应板( 微孑乙板，通常为9 6 孔) ，这样一次可以进行犬批量检测。 2 4 1 苯丙氨酸与茚三酮的反应机理 咒是具有游离氨基的巍基酸，都和个皤徽蘸三黼的试帮发患反应嘲嘲3 ， 从而生成一种紫色物质，非常灵敏，是用于鉴定氨基酸的最简便的方法。苯丙氨 1 4 第二章干血片荧光法苯丙氨酸测试剂盒的研制 酸与茚三酮的反应机理如图2 - 3 所示，苯丙氨酸具有一个游离的氨基，茚三酮水 合物可以和苯丙氨酸分子中的氨基反应，脱去2 个水分子，然后脱去羧基，变成 一个s c h i f f 碱，水解后，得到氨基茚二酮，再和一分子茚三酮水合物反应，经脱 水后得到一种在紫外光照射下会发生明亮荧光的化合物，其检测限可以达到 1 0 1 m 。 0 6 0 0 5c 2 ：x 2 = o 0 7 7 ，p = 0 7 8 2 0 0 5 ) 。( 见表2 - 3 ) 实验日期 c l c 2 2 0 0 2 年2 月 1 9 75 6 3 2 0 0 2 年3 月 2 0 36 2 1 2 0 0 2 年4 月1 9 36 4 0 2 0 0 2 年5 月 2 2 0 5 7 5 2 0 0 2 年6 月 2 0 86 7 5 2 0 0 2 年7 月 2 0 3 6 6 2 2 0 0 2 年8 月 2 0 76 6 6 2 0 0 2 年9 月 2 3 55 9 4 2 0 0 2 年l o 月 2 4 36 0 3 2 0 0 2 年1 1 月 1 9 56 3 4 2 0 0 2 年1 2 月2 4 7 6 1 1 2 0 0 3 年1 月 2 1 6 5 8 7 2 0 0 3 年2 月 2 3 6 6 0 1 5 、灵敏度：用0 标准血斑纸片连续做2 0 次重复测定，所得结果得均值减去 2 s d ，在标准曲线上查值为o 2 m g d l ，即为最小检测值。 6 、精密度：用3 个不同浓度血标本制备干燥血斑纸片，测得其批内及批间 变异系数。( 见表2 - 4 ) 1 9 第二章干血片荧光法苯丙氨酸测试剂盒的研制 表2 - 4 精密度结果 分组批内变异系数批间变异系数 样本ii iii ii i i x3 9 6l o 2 72 0 2 41 9 65 7 01 8 4 0 s do 1 90 5 21 4 7o 2 6 0 7 02 3 4 c v ( ) 4 8 05 1 07 4 2 1 3 2 01 2 3 01 2 7 0 7 、准确性：在低值干血斑纸片中加入不同量的苯丙氨酸，测得回收率范围 为9 4 - 1 0 7 。( 见表2 5 ) 表2 - 5 回收实验结果： 基础含量 加入量期望值 实测值 回收率 ( m g d 1 )( m g d 1 )( m g d 1 )( m g d 1