（细胞生物学专业论文）丙酮酸发酵工艺的研究.pdf

河南大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 中文摘要 丙酮酸是代谢途径中重要的有机酸，产品用途广泛。用传统的化学合成法进行生产，成本 高、工艺复杂、污染严重，而发酵法生产成本低、工艺简单、基本没有污染，更加有利于工业 生产。该文对丙酮酸发酵的工艺条件进行了优化研究。 作者以而，“蛐西咖打口幻t k 4 1 8 作为发酵菌株，确定了摇瓶发酵的最佳条件：温度3 0 ， 接种量1 0 ，转速2 2 0r p m ，一级种子摇瓶生长2 4h 。并确定了以硝酸铁化学法作为丙酮酸的 测定方法。用正交实验法和响应面分析法确定了摇瓶发酵培养基，即以葡萄糖为碳源，浓度 1 0 6g l ；硫酸铵为唯一氮源，浓度8 肌；碳氮比2 5 ：1 。采用b o x b e h n k e n 中心组合设计，并 结合s a s 统计软件，确定了最优的维生素浓度组合：盐酸硫胺素o 0 1 2 5m g l 、烟酸9 7m g ，l 、 生物素0 0 2 2m l 、盐酸吡哆醇0 5 4m g l ，并确证盐酸硫胺素是最重要的影响因素。通过培 养基优化，丙酮酸最高产量提高到6 8 5 lg l ，增加2 2 8 4 。通过对发酵培养基中添加不同梯 度的l 2 p 0 4 ，确定了最佳浓度为2g l ，此时的副产物最少。 实验对在发酵罐水平上对不同溶氧方式的比较，确定了最佳溶氧方式：0 1 2h 溶氧控制 在3 0 4 0 ，1 2 1 6h 溶氧控制在9 0 ，1 6h 至发酵结束溶氧控制在6 5 7 5 。通过 有机氮和无机氮对发酵的影响及其动力学分析，进一步验证了正交水平得到的氮源水平为丙酮 酸发酵的最佳氮源水平，并得到不同氮源条件下的丙酮酸发酵动力学方程。 确定了一种适合本实验室的提取丙酮酸方法：协同络合萃取法。络合剂为三辛胺，协同 剂为乙酸乙酯。 关键词：丙酮酸发酵工艺条件优化 a b s t r ac t p ”u v a t ei sa ni m p o r t a n tp a t h w a y mm eo 唱a n i ca c i d s ，w i d e l yu s e dp r o d u c t s u s i i l g 仇l d i t i o n a l c h e m i c a ls y n t h e s i sp r o d u c t i o n ，h i 曲c o s ta n dc o m p l e xp m c e s s ，c a u s es e r i o u sp o l l u t i o n t h e f e 肿e n t a t i o np r o d u c t i o ni sl a wc o s t ，s i m p l ep r o c e s s ，b a s i cn op o l l u t i o n ，a n dm o r ec o n d u c i v et 0 m d u s 仃i a lp r o d u c t i o n t l l ea c i df e 珊e n t a t i o np r o c e s sh a sb e e no p t i i n i z e ds t u d yi nt i l i s 硎i c l e a u t h o ru s e s 乃，“伽捃口6 ，口f 口t k 4l8 雏f e 硼e n t a t i o ns t r a i n s ，t l l ef e m e n t a t i o nd e t e 珊i i l et l l e b e s tc o n d i t i o n s ：t e m p e r a t u r eo f3 0 ，s e e d i n go fl op e r c e n t ，s p e e d2 2 0 叩m ，as e e df l 硒ko f2 4h a n dd e t e m l i n e dt oi r o nn i t r a t e 舔t h ec h e m i c a lm e t h o do fd e t e m i l l a t i o no fp y l l l v a t e b yo n l l o g o n a l e x p e 血l e n t 锄dr e s p o n s es u 渤c ea j l a l y s i sm e t h o d t od e t e m i n et h ef e n l l e n t a t i o nm e d i u m ，0 rg l u c o s e 雒c a r b o ns o u r c e ，t h ec o n c e n 仃a t i o no fl0 6g l ；a m m o n i 岫s u l f 乱e 弱t l l es o l es o u r c e0 fn i n o g e n ， t 1 1 ec o n c e n t r a t i o no f8g l ；m ec a r b o na n dn i t r o g e nr a t i 0w a s2 5 ：1 b yu s i n gb o x - b e l l i l i ( e nc e n 仃e d e s i g l l ，c o m b i l l e dw 沛s a ss t a t i s t i c a ls o m v a r et od e t e n n i n em eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no f m ev i 觚i 1 1 c o m b i n a t i o n ：t h i a m i n eh y d r o c h l o r i d e0 0l2 5m g l ，n i c o t i n i ca c i d9 7m g l ，b i o - 0 0 2 2m g l ， p 州d o x i n eh y d m c h l o r i d ea l c o h o lo 5 4m g l ，a n dc o n f i m e dt h i a m i i l eh y d r o c h l o r i d ei st l l em o s t i m p o r t a n tf a c t o r t h m u g ht h em e d i u mo p t i m i z a t i o n ，t h eh i 曲e s to u t p u to fp y r u v a t et o6 8 5 lg l ， i 1 1 c r e a s i n g2 2 8 4p e r c e n t 1 1 1 r o u g ha d d i n gd i 髋r e n tl a y e r so fk h 2 p 0 4 t ot 1 1 em e d i u m0 ff - e m e n t a t i o n ， w ef i n do u tt h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no f2g l ，a tl e a s ta tt h i st i m eo fm eb y 。p r o d u c t s e x p e r i r n e n t s t a k ed i f f e r e n tw a yo fc o m p a r i s 。ni i l 廿l el e v e l 。fd l s s 0 1 v e d l _ o x y g e n i i lm e 。 f e 皿e n t a t i o nt a i l k t h ed i s s o l v e do x y g e nd e t e 册i n et h eb e s tw a y ：0 1 2hi 1 1t t l ec o n 仃o lo fd i s s o l v e d o x y g e ni i lt h el e v e lo f 3 0 4 0 ，1 2 1 6hd i s s o l v e do x y g e ni nc o n 仃o l9 0p e r c e n t 1 6ht o 廿1 ee n d o ff e m e n t a t i o nc o n 仃o li i lt l l ed i s s o l v e do x y g e n6 5 7 5 1 1 1 r o u g hm eo 唱a n i cn i t r o g e na 1 1 d i 1 1 0 唱a i l i cn i 仃o g e na n di t sh p a c t o nt h ef e m e n t a t i o no ft h ed y l l 锄i c so ft 1 1 eo m l o g o n a lw e 如n h e r v e r i 毋m el e v e lo fn i 订o g e nl e v e l t h eb e s ts o u r c eo fn i 仃0 9 e na c i df e n n e n t a t i o n ，a 1 1 dw i m d i 疏r e n t s o u r c e0 fn i 仃o g e nu n d e rm ec o n d i t i o n so fa c i dw eg e tt 1 1 ef e n l l e n t a t i o nd y i l 锄i ce q u a t i o n i d e n t i f i e dal a b o r a t o 呵f o rt l l ee x 仃a c t i o no ft 1 1 ep y r l l v a t e ：s y n e 唱y c o m p l e xe x 仃a c t i o nm e 也o d c h e l a t o r sf o rt o a ，f o rt h ec o o r d i n a t i o no fe t l l y la c e t a t e k e yw o r d s ：p y m v a t e f e m e n t a t i o nt e c h l l o l o g i c a lc o n d i t i o n so p t i i t l i z a t i o n i i 关于学位论文独立完成和内容创新的声明 本人向河南大学提出硕士学位中请。本人郑重声明：所呈交的学位论文是 本人在导师奇勺指导下独立完成的，对所研究的课题有新的见解。据我所知，除 文中特别加麒说明、标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发袁或撰 写过的研究成果，也不包括其他人为荻得任何教育、科研机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示了谢意j ，、毒；，i ；。色， j ：i j，r ：i 一 、 7 ，1 r ： ； ， 学位申请人，( 学住茹受作者) 签名：盔亟魁 j 二：j _ 一， 。： ? j ：j i ：| l 。j | _ i l j ，7 二j 哆j ： j 2 0o 孑年6 月见日 ， 二 j ，7 7 1 = 二uu 口中v 月l l 目 一j 一、：；_ tj 。o 。| jj + ? i 一，j ? ， ，| ；： ，。“ 学，穆j ；。澎：j 影2 孑 ，7 。 ；，# 髟：7 ：7 了i ：j i ? j ：“j ，j：，0i ：， ，；j ；il 澎砉；，j ，i 移，夕 j - 关于学位论文著作权使用授权书? ，： “ - 一 ：，秒p 谚，j 够j _ ， 1 0 。8 可以直接准确滴定 ( c h 2 ) 6 n 4 h + + 3 h + + 4 0 h 。=( c h 2 ) 6 n 4 + 4h 2 0 指示剂：化学计量点产物( c h 2 ) 6 n 4 决定溶液的p h ， 【d h 一】= 瓜= 厄两丽= 1 朋= 8 9 计算公式：缈：堑尘丝丛二尘生 m 试样量 ，卵 2 2 6 发酵液中磷含量的测定 钼磷比色法，取o 5m l 的发酵液加入到含3 51 1 1 l5 三氯乙酸的试管中，振荡，3 7 恒 温反应，过滤得无蛋白滤液，再取滤液o 5m l ，水定容至3 0m l 后，加入钼酸铵- 硫酸混合液 1 3 丙酮酸发酵【j 艺的研究 2 5m l ( 3m o 儿硫酸和2 5 钼酸铵等体积混合) ，最后加入0 5m l 的旺1 ，2 ，4 ，氨基萘酚 磺酸溶液，在3 7 下恒温反应l om i n ，冷却至室温后，测定o d 6 6 0 值，查标准曲线的发酵液 中所含磷量。 该方法原理：发酵液中的有机物经酸氧化分解，使磷在酸性条件下与钼酸铵结合生成磷铝 酸铵。此化合物经对苯二酚、亚硫酸钠还原成蓝色化合物钼蓝。用分光光度计在波长 6 6 0 衄处测定钼蓝的吸光值，以测定磷的含量。反应式为： h 3 p 0 4 + 1 2 州h 4 ) 3 m 0 0 4 + 2 1 h n 0 3 ( n h 4 ) 3 p 0 4 1 2 m 0 0 3 + 2 l n h 4 n 0 3 + 1 2 h 2 0 o 6 o 5 o 4 占0 3 o 0 2 0 1 0 o51 01 52 02 53 0 磷元素含量( ug m 1 ) 图2 5 磷元素标准曲线 2 2 7 发酵液中甘油含量的测量 变色酸法【2 引，取一定量发酵液于1 20 0 0r m i n 下离心5m i i l ，用移液管准确移取1 5m l 上 清液置于2 5 0m l 的三角瓶中，加水1 0m l ，加入酚酞指示剂，用0 0 5m o l ln a o h 标准溶液 滴定至变色。然后加入l om lo 1m o l l 高碘酸钠溶液，避光反应5m i i l ，再加入2 5 乙二醇 溶液5m l ，避光反应5m i n 。然后用上述n a o h 标准溶液滴定至变色，变色程度应与前次变 色程度相当，记录这一次所用n a o h 溶液的量。 甘油含量的计算： 甘油浓度( m m l ) = 9 2 1 c v n 1 4 河南大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 式中n 为取液量( m l ) ，c 为n a o h 标准溶液浓度( m o 儿) ，v 是消耗的n a o h 标准溶液 1 i 的体积( m l ) 。 受所用的高碘酸钠和乙二醇量的限制，滴定法测定甘油的最大值为4 5m g 。 2 2 8 发酵液中a 一酮戊二酸含量的测量 纸层析法：将发酵液进行过滤，取2 3m l 滤液，加l 滴0 5 酚酞溶液，用o 1m o l l n a o h 溶液滴定至微红色。将新化滤纸l 号裁成1 0 2 2c m ，使用微量注射器进行点样，点样量为： 标准丙酮酸5 儿，标准酮戊二酸5 此，发酵液l o 儿，点的直径约为0 5c m 。干后，将滤 纸缝成圆筒形，操作时应保持滤纸洁净。将展开剂放入培养皿内( 展开剂为乙醚：8 8 甲酸：水 = 5 ：2 ：1 ) ，液面高约1c m ，把平衡溶剂( 展开剂混合分层后的下层溶液) 放在小烧杯中。将滤 纸放入层析缸内，勿使触及溶剂，密闭层析缸，平衡l 2 小时后，将滤纸点样的一端放入展 开剂内，室温下展开。将溶剂前沿到达滤纸顶端o 5 1 oc m 左右时，取出，用铅笔在溶剂前 沿处作一直线，吹干至无乙醚味为止。展开后的滤纸用0 0 4 甲基红乙醇溶液( 使用前用o 1 m o l ，l n a o h 溶液调p h 值为7 5 左右，此时溶液呈桔黄色) 喷雾，黄色的纸上出现红色的斑点。 干后，立即用铅笔将斑点圈出，以免退色。测出标准丙酮酸、标准n 酮戊二酸和发酵液中各 斑点的r f 值，根据它们的r f 值来确定发酵液中有无丙酮酸和a 酮戊二酸。同时还可以由斑 点的人小与标准丙酮酸、标准a 一酮戊二酸的斑点相比较，从而了解发酵情况的好坏。 2 3 实验方法i 2 3 1 摇瓶发酵实验基本条件的确定 ( 1 ) 一级种子生长时间的确定 。种龄是指一级种子培养物接种至下一级种子瓶( 罐) 或发酵瓶( 罐) 时的培养时间。种龄 实发酵的重要影响因素之一，种龄短则种子幼嫩，发酵力不足，发酵时间延长；种龄长则种子 衰老，发酵力降低；一般接种种龄应在对数生长末期为宜。接种斜面菌种入种子摇瓶培养基， 三角瓶为5 0 0m l ，装液量分别为1 0 0r n l 和2 0 0m l 。3 0 培养，每2 h 测定菌密度。确定丙酮 酸种子摇瓶培养的最佳时间。 ( 2 ) 发酵温度对丙酮酸摇瓶发酵的影响 在2 5 0m l 三角瓶装入5 0m l 发酵培养基，将其置于2 2 、2 4 、2 6 、2 8 、3 0 、 3 2 、3 4 等7 个不同的温度下进行摇瓶振荡培养，测定各三角瓶的丙酮酸产量，确定丙 酮酸发酵培养的最适温度。 1 5 丙酮酸发酵l ：艺的研究 ( 3 ) 摇瓶转速对丙酮酸发酵的影响 在2 5 0n 儿三角瓶装入5 0m l 发酵培养基，培养温度为3 0 ，将其分别置于1 0 0 叩m 、 1 2 0r p m 、1 4 0 叩m 、1 6 0r p m 、18 0 叩m 、2 2 0r p m 、2 4 0 甲m 、2 6 0r p m 的转速下进行摇瓶振荡培 养，测定各三角瓶的丙酮酸产量，确定丙酮酸发酵培养的最适转速。 ( 4 ) 种子液接种量对丙酮酸发酵的影响 接种量是指种子液与发酵液体积之比，接种量影响发酵产物的产量与发酵时间，对于发酵 而言，接种量过低，菌体增长缓慢，发酵时间延长，提高生产成本：接种量过高，菌体增长虽 快，但由于从种子培养基中带来大量的代谢废物而对菌体造成一定的毒害作用，导致菌体过早 衰老，发酵后劲不足，不利发酵生产。 为考察不同的接种量对发酵的影响，我们将培养好的一级种子分别以4 、6 、8 、 1 0 、1 2 、1 4 、1 6 等7 个不同比例，接种于盛有5 0m l 液体摇瓶发酵培养基的2 5 0m l 三角瓶中，3 0 摇瓶振荡培养，测定各三角瓶中丙酮酸产量，确定丙酮酸发酵培养的最适接 种量。 2 3 2 丙酮酸测定方法的确定 ( 1 ) 根据所测定的标准曲线，使用乳酸脱氢酶法、2 ，4 二硝基苯肼法、硝酸铁化学比色法、 紫外分光光度法对发酵液中的丙酮酸进行测定。 ( 2 ) 重现性试验 取发酵液体样品，分别精密星取5 份，按绘制各种标准曲线的方法进行操作，测定丙酮酸含 量，考察四种方法的重现性。 ( 3 ) 回收率试验 为考证四种方法的准确度，选用3 批发酵样进行同收率实验。发酵样预处理后，稀释到各 方法适宜的倍数测定其丙酮酸含量，然后加入已知浓度的标准丙酮酸测定，计算同收率。 2 3 3 培养基及发酵条件的优化 ( 1 ) 碳氮源的单因素试验与碳氮比的初步确定 选择葡萄糖，硫酸铵为考察因素，做单因素试验以p y r 最终浓度，g l c 终浓度以及o d 6 6 0 三个指标为参考进行分析，进而确定合适的用量以及初步确定其碳氮比。 ( 2 ) c ，n ，m g ，p 元素正交实验 选择葡萄糖，硫酸铵，m g s 0 4 ，k h 2 p 0 4 四医i 素，各选3 个水平，并作三个平行样，进行 1 6 河南人学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 发酵试验，以丙酮酸浓度为指标，最终确定其浓度水平。 ( 3 ) 金属离子正交实验 选择c a c l 2 ，f e s 0 4 ，z n c l 2 ，m n c l 2 ，c u s 0 4 五因素，各选3 个水平，并作三个平行样， 进行发酵试验，以p y r 最终浓度为指标进行分析，进而确定合适的金属离子浓度水平。 ( 5 ) 响应面分析应用于丙酮酸发酵培养基的优化 为了对维生素的影响进行深入分析，我们利用统计学软件s a s 中的b o x b e h n k e n 中心组合 设计和响应面分析法考察不同维生素浓度组合对zg 肠加口勉过量合成丙酮酸的影响，得较优 的维生素浓度组合，并考察其中最重要的影响劂素。根据b o x b e h n k e n 的中心组合设计原理， 以盐酸硫胺素、烟酸、生物素和盐酸吡哆醇四个因素为自变量，以丙酮酸产量为响应值设计了 四因素三水平共2 7 个实验点的响应面分析实验，以随机次序进行，重复三次，记录数据，分析 试验结果2 9 1 。 2 3 4 优化条件下的发酵实验 以优化的培养基条件与优化后的发酵条件进行发酵实验，每4 h 测定丙酮酸浓度，残糖浓 度，。绘制出丙酮酸发酵产酸趋势曲线，糖降曲线，综合分析，确定发酵结束的时间。 2 3 5 磷元素实验设计 在发酵培养基中添加不同浓度的磷酸二氢钾( 见表2 3 ) ，相同条件下2 5 0l n l 三角瓶中摇 瓶培养，分别发酵2 4 和4 8 小时，测定其磷消耗量、丙酮酸和主要副产物产量、菌体生长及碳 源、氮源基质消耗，考察不同发酵时间、不同的初始l ( h ：p o 。质量浓度对丙酮酸发酵的影响。 表2 3 添加的磷酸二氧钾量及对应的无机磷含量 2 3 6 对于溶氧的研究 溶氧( d o ) 是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中受多方面因素的限制，而d o 往往 是最易成为控制因素，这是氧在水中的溶解度很低所致。在2 8 氧在发酵液中的l o o 的空 气饱和浓度只有7m g l 左右，比糖的溶解度小70 0 0 倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧 能达到1 0 0 空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中d o 便可在几分钟之内耗竭，使得d o 一 _ ，： 1 7 丙酮酸发酵丁艺的研究 成为发酵过程中的限制因素。在工业发酵中产率是否受氧的限制，单凭通气量的大小是难丁：确 定的。因d o 的高低不仅取决于供氧，通气搅拌等，还取决于需氧状况。故了解溶氧是否够的 简便有效的办法是就地检测发酵液中的溶氧浓度。从d o 变化的情况可以了解氧的供需规律及 其对生长和产物合成的影响【3 0 】。 光滑球拟酵母的维生素营养缺陷型以葡萄糖为底物积累丙酮酸时，溶氧是。个很重要的因 素3 1 1 。且丙酮酸发酵需人量菌体，供氧对菌体的生长、糖的消耗和副产物酒精的生成，都有 重要影响。了解溶氧是否充足的最简便、最有效的办法是在线检测发酵液中的溶氧浓度，从溶 解氧变化的情况可以了解氧的供需规律及其对生长和产物合成的影响，【大】此供氧控制策略的研 究对丙酮酸发酵有重火意义【3 2 1 。 从新鲜斜面上接一环菌入种子培养基( 1 0 0m l 5 0 0m l ) 锥形瓶，在3 0 ，2 2 0 叩m m 协 下培养2 4h ，以1 0 接种量接入发酵罐。7l 发酵罐装液量为4l ，用5m o l l n a o h 控制p h 5 0 ，发酵温度控制3 0 ，通气量1 8 0 2 0 0m 。 目前国际上研究应用较多的是溶氧浓度先高后低的供氧方式，即在( o 1 6 ) h 溶氧控制 在8 0 1 0 0 ，1 6h 后控制在6 0 8 0 。斟为在( 0 1 6 ) h 底物中的碳主要用于合成 细胞，1 6 h 后碳流则转向积累丙酮酸，发酵后期控制高溶氧，则葡萄糖消耗慢，不利于缩短发 酵周期。本文根据菌体浓度的变化，进行3 种不同供氧方式的较系统的实验，并进行了比较。 ( 1 ) ( 肚1 2 ) h 溶氧控制在8 5 9 5 ，( 1 2 2 0 ) h 溶氧控制在6 5 7 5 ，2 0h 至发 酵结束溶氧控制在3 0 4 0 ； ( 2 ) ( 0 1 2 ) h 溶氧控制在3 0 4 0 ，( 1 2 1 6 ) h 溶氧控制在9 0 。1 6h 至发酵结 束溶氧控制在6 5 7 5 ； ( 3 ) ( 0 1 2 ) h 溶氧控制在6 5 7 5 ，( 1 2 1 6 ) h 溶氧控制在9 0 ，1 6h 至发酵结 束溶氧控制在6 5 7 5 。 2 3 7 氮源对丙酮酸发酵生产的影响以及动力学分析 为了研究发酵培养基中氮的含量及其性质对菌体浓度、丙酮酸产量和葡萄糖消耗的影响， 用( n h 4 ) 2 s 0 4 作为无机氮源、蛋白胨作为有机氮源。将发酵培养基中的( n h 4 ) 2 s 0 4 的浓度设 定为6 、8 、1 0g l ( 氮浓度分别1 2 7 2 、 1 6 9 6 、2 1 2 l ) ，对应实验批次表示b b 1 2 b 1 3 1 r 河南大学2 0 0 8 届硕：f ：研究生学位论文 将发酵培养基中的蛋白胨的浓度设为1 3 、1 7 、2 1g l ( 氮浓度分别为1 3 、1 7 、2 1g l ) ，同 样相应实验批次为b 2 i ，b 2 2 ，b 2 3 。在7l 发酵罐中进行分批发酵 3 3 】。 2 3 8 丙酮酸的提取 丙酮酸的提取方法主要有减压蒸馏法、溶剂萃取法、反渗透膜分离法和离子交换法【3 4 1 等。 根据本实验室的条件，拟用协同络合萃取法【3 5 1 对发酵得到的丙酮酸进行提取。： 协同络合萃取法分离极性有机稀溶液是2 0 世纪8 0 年代形成的新型分离方法，是通过待分 离溶质的特殊官能团与络合剂之间的化学反应实现的。 萃取分离可分为物理萃取和化学萃取两大类。化学萃取也称为络合萃取，在这类萃取过程 中，稀溶液中待分离溶质与含有络合剂的萃取剂相接触，络合剂与待分离溶质反应形成络合物， 并使其转移至萃取相内：然后进行逆相反萃取使溶质得以回收，萃取剂循环使用。协同萃取理 论认为：两种或两种以上萃取剂混合在一起进行萃取时，萃取分配系数d 协显著大于每一萃取 剂在相同条件下单独使用时的分配比d 加台，既d 协 d 加合= d l + d 2 + d 3 + 。某一萃取体系若同 时具有协同、络合双重作用，则称之为协同络合萃取。 络合剂的选择应满足【3 6 】： 1 ) 络合剂应具有可与待分离物发生络合反应的官能团，形成的络合物应具有较好的稳定 性和较高的络合平衡常数，易于实现相转移；这种络合物在一定介质条件下易于解析，实现可 逆反应。 2 ) 络合剂应具有较低的毒性和在水中较低的溶解度，以免二次污染或络合剂的流失及逆 向反应时溶质的损失。 ，。 3 ) 络合过程中应无其他副反应或不可逆反应。，络合剂在萃取过程中应具有稳定性，不易 分解、降解或与介质中溶质以外的成分反应。 4 ) 络合反应在正逆向反应上均应具有足够快的动力学机制，以便萃取过程易于实现。 协同剂应满足的条件： 1 ) 协同剂对被萃取物和络合剂应有较好的溶解度，以便起到稀释或溶解( 有时络合剂是 固体) 以及协同萃取的作用。 2 ) 协同剂应相对络合剂价廉易得，应可调节萃取剂的黏度、密度及界面张力等参数。 1 9 丙酮酸发酵j ：艺的研究 3 ) 对络合物应有较好的溶解能力，以便促进络合物的形成和相问转移。 基于上述条件，我们实验以三辛胺为萃取剂；协同剂分别为乙酸乙酯、正辛醇、氯仿 和煤油【3 8 】。 协同络合萃取法作为一种高效和高容量的分离过程，具有如下优点【3 9 j ： 1 ) 两相可变的物理和化学因子多，有利于实现多组分的分离； 2 ) 不依赖于组分的挥发度，能分离挥发度相近的物质； 3 ) 两流动相便于实现多级逆流操作； 4 ) 能耗低，选择性高，操作条件温和，可以减低生物大分子活性的破坏； 5 ) 溶剂再生简单，成本低，便于自动化操作和控制。 分配系数的计算方法： 分配系数( d ) = 有机相中溶质浓度水相中溶质浓度 萃取实验方法： 向发酵液往发酵液中加入2g l 的粉末活性炭，在8 0 下恒温搅拌3 0m i n ，p h 值控制 为5 ，对发酵液进行脱色。在带塞锥形瓶中分别加入等体积的转化液和萃取剂，在恒温摇床 上以一定转速振荡，待平衡后在70 0 0r m i n 下离心1 0m i n ，分离历相，以硝酸铁测定水相中 溶质浓度，由物料衡算可得油相中溶质浓度，从而可求得分配比。 反萃取试验4 1 】： 使用等体积n a o h 进行反萃取试验，反萃取过程发生的反应： r 3 n h a o r f + n q o h 口q j 喜r 3 n h + o h i + n a 膏+ a i 得到的季胺碱或叔胺，可再生用于络合萃取。 2 0 河南人学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 3 实验结果 3 1 菌龄对发酵的影响 奠 。5 孝麓 。2 。1 0 051 01 52 02 53 03 5 时间( h ) 图3 - l 一级种子生长曲线 一级种子生长曲线如图3 1 所示，从图形可知，对数生长末期大概在2 2 2 4h 左右；装液 量l o or n l 的种子培养基在菌浓以及速度方面均较优，考虑可能是溶氧问题。选择1 0 0r n l 装 7 液量的种子瓶2 0 、2 2 、2 4 、2 6h 的种子接入发酵摇瓶中发酵，测定丙酮酸浓度，以确定合适 的接种种龄，发酵4 8h ，记录结果如表3 1 所示： 表3 1 不同种龄发酵产酸比较 由表中数据可以看出，种龄2 2 h 与2 4 h 的丙酮酸浓度相差不大，2 0 h 略小，估计为种子 过于幼嫩所致，2 6 h 种子过老产酸也较低，综合考虑上述因素，选择菌龄为2 4h 的种子接入发 酵瓶。 3 2 接种量不同的摇瓶试验 不同种子液接种量对丙酮酸摇瓶发酵的影响如图所示。随着丙酮酸一级摇瓶种子液接种量 的增大 固定时间内丙酮酸产量也增大，种子液接种量为l o 时，菌丝体产量最高，随着接 种量继续增大，丙酮酸产量有逐渐下降的趋势，考虑应该是代谢产物过多引起的产量下降。综 2 l 丙酮酸发酵，【：艺的研究 合考虑发酵时间长短和生产成本的因素，确定1 0 的种子液接种量为其最适种子液接种量。 7 0 6 0 ，、5 0 、一4 0 倒 建3 0 暖 腔2 0 1 0 0 24681 01 21 41 6 1 8 接种量( ) 图3 2 不同接种量对丙酮酸产量的影响 3 3 发酵温度的试验 不同温度对丙酮酸摇瓶发酵的影响如图3 3 所示。发酵温度对丙酮酸产量有较人的影响， 随着温度的升高，丙酮酸产量不断增加，但在3 0 后继续升温，丙酮酸产量反而降低，因而 确定3 0 为其最适发酵温度。 2 02 22 42 6 2 83 03 23 43 6 温度( ) 图3 3 不同温度对丙酮酸产量的影响 3 4 发酵摇瓶转速的试验 不1 - j 转速对丙酮酸摇瓶发酵的影响如图3 4 所示。随着转速增加，通气量和溶解氧增大， 们 享； 加 0 1v删钆窿屠翟 河南大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 丙酮酸产量增大。当转速达2 2 0 印m 时，丙酮酸产量最高，接下来转速增加并不能让丙酮酸 产量继续提高。因而确定2 2 0r p m 为其最适摇瓶转速。 h ul u ui z u1 4 ui b ul h uz u uz z uz 4 uz b uz 5 u 转速( r p m ) 图3 - 4 不同摇瓶转速对丙酮酸产量的影响 3 5 丙酮酸测定方法试验结果 3 5 1 四种方法的标准曲线 四种方法所得标准曲线如图3 5 至图3 8 所示： 0 1 2 o 1 0 0 8 坦 曼0 0 6 昌 0 0 4 o 0 2 0 0o 0 0 20 0 0 4o 0 0 60 0 0 80 叭 丙酮醇含旨( m z 曩1 ) 图3 5 乳酸脱氧酶法标准曲线 oo 0 lo 0 2 0 0 30 0 40 0 5d 0 0 7 丙酮酸含量( - g 1 ) 图3 62 。4 一二硝基苯肼法标准曲线 加 柏 加 m 0 1?删址瑶j匿医 8 6 4 2 o 0 0 o 0 捌暑譬o o 丙酮酸发酵工艺的研究 o 2 0 1 6 j 四0 1 2 昌0 0 8 0 0 4 0 丙酮酸含量( m g m 1 ) 图3 7 硝酸铁化学比色法标准曲线 0 6 o 5 0 4 趔 曼o 3 凸 o 0 2 0 1 o 00 40 81 21 6 2 丙酮酸产奄( m g m i ) 图3 8 紫外分光光度法标准曲线 3 5 2 重现性结果 取一定量发酵液，经离心、预处理后，等量量取5 份，按上述四种方法测定其丙酮酸含量， 考察重现性，结果如表3 2 。 表3 2 重现性实验结果 3 5 3 回收率结果 取不同的3 批发酵液，用四种不同方法测定其含量，再按如下表加入绘制各标准曲线时所 用的已知浓度的标准丙酮酸，测定回收率。 表3 3 乳酸脱氧酶法同收牢实验结果 河南大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 表3 42 ，4 - 二硝基苯肼法同收率实验结果 表3 5 硝酸铁化学法回收率实验结果 表3 6 紫外分光光度法回收牢实验结果 从四种方法测定原理、实验方法来看，各有侧重点，且都有各自的特点。我们试从以下几 个方面比较。 1 各方法实用性及其影响因素方面：酶法特应性反应强，检测较为准确，但是操作时反 2 5 丙酮酸发酵工艺的研究 应不好控制，特别是当底物浓度大时，反应太迅速，使得n a d h 的减少量偏低，使测得的丙 酮酸值偏少：苯肼法，发酵液中存在的丙酮酸和0 【酮戊二酸均能和2 ，4 二硝基苯肼反应，专一 性较差，对发酵液中丙酮酸的检测不准确，测得值偏高：硝酸铁法，根据文献，此测定方法基 本不受有机酸和氨基酸的影响，但受到无机酸的干扰。在发酵液中，基本上不存在无机酸，所 以该法检测较为准确。紫外吸收法，根据文献报道，3 2 0 衄波长处，在同一质量浓度下，除乳 酸有轻微干扰外( 相对误差小于2 5 ) ，其他有机酸、葡萄糖和硫酸铵几乎无干扰，该法检测发 酵液中的丙酮酸含量也较为准确。但该法测定时需要在碱性条件下进行，具体p h 值随测量 环境而变，而且很难准确定值。p h 值对结果影响较大，结果表明测量值比其他的方法偏高 较多。 2 回收率，重复性方面：从统计结果来看，四种方法的重复性差别不大，相对而言，硝 酸铁法稍好一点；在回收率上，硝酸铁法最高，苯肼法最差。 3 发酵液的处理上：酶法需要万倍的稀释，苯肼法要千倍稀释，硝酸铁法十倍稀释，紫 外分光光度法需百倍稀释；从操作步骤的简捷程度来说，酶法和苯肼法分别包括发酵液稀释及 加三种溶剂共六步，硝酸铁法包括发酵液稀释和加入两种溶剂共三步，紫外吸收法为两步：从 操作时间来说，酶法需要的时间最长，大约2 0m i l l ，苯肼法时间较长为1 5m m ，硝酸铁需5m i n ， 紫外吸收法需5m i l l 。由此可见，该四种方法中紫外吸收法、硝酸铁法最为简捷，较为复杂的是 苯肼法和酶法。 4 检测成本方面：酶法最为昂贵，其中的乳酸脱氢酶和n a d h 是较为贵重的药品且配成 的试剂容易在存放过程中失效，使检测结果不准；苯肼和硝酸铁是实验室较为常见的药品，苯肼 价格稍高一些；紫外吸收法不需要什么其他特别的药品。 5 总体上：酶法测量准确，但操作步骤烦琐，费时长，成本高；苯肼法测量受到其他酮酸的 影响，且操作较为繁琐，时间也较长；硝酸铁法，测量较为准确，不受发酵液中有机酸的影响， 且操作简单，省时，成本低廉，适合于测量发酵液中的丙酮酸含量；紫外吸收法，虽然操作简 便，无需特别药品，但测量受到较大的干扰，结果不够准确。所以接下来的试验以硝酸铁法作 为丙酮酸产量的测定方法。 3 6 培养基及发酵条件的优化 2 6 河南大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 3 6 1 初始葡萄糖浓度的确定 以葡萄糖为碳源，( n h 4 ) 2 s 0 4 为氮源，选择不同的碳氮比，固定n 含量8g ，测定各相关 ，参数如表3 7 所示。 表3 7 不同葡萄糖浓度下的发酵情况 冈素 序号 g l c 含量( 叽) 0 d 6 6 0丙酮酸量( 叽) 残糖量( g l ) 。c ：n l6 2 31 4 0 83 5 2 6 o 3 41 5 ：l 28 1 21 5 6 24 5 1 50 4 8，2 0 ：l 31 0 61 6 7 84 8 6 41 0 22 5 ：l 4 1 2 7 3 9 1 5 2 l4 8 7 55 8 83 0 ：l 51 4 8 51 1 3 34 4 8 43 2 5 l3 5 ：l 6 1 6 9 7 9 o 9 8 5 3 9 9 34 5 1 64 0 ： l 2 0 16 1 ，2 毫 o o0 8 0 4 n 0 u4墨1 z1廿zuz 4z b u m e ( h 懵) 图3 9 不同葡萄糖初始浓度下的生长曲线 结果表明：初始糖浓度在6 0 1 3 0g l 时，菌体浓度、丙酮酸产量及残糖浓度随糖浓度增 加而增加，糖利用率逐渐降低；初始糖浓度达到1 3 0 一1 6 9 7g l 时，菌体浓度、丙酮酸产量及 残糖浓度随糖浓度增加而降低，残糖大量增加；结合图3 9 可见，初始糖浓度过高时，最终菌 浓度偏低，菌体量增加减慢，菌体生长明显受到抑制，不仅延迟期增长，且对数末期的到来也 较初始糖浓度1 0 6g ，l 时大约慢了2 h ；这些情况表明糖浓度不仅可以影响酸的产量，也影响 菌体利用糖的能力；过高的糖浓度对菌体生长产生抑制，导致残糖浓度增加，浪费了原料，提 高了生产成本；而糖浓度过低又会导致发酵过早结束，微生物利用完葡萄糖后又转而利用丙酮 2 7 丙酮酸发酵 ：艺的研究 酸，导致丙酮酸产量降低。 综合考虑产酸，降糖以及糖利用等岗素，我们选择初始的糖浓度1 0 6g l ，此时菌体生长 最好，酸产量较高，残糖较低。同时也提示合适的c n 应该为2 5 ：l 左右，为此我们固定糖 浓度1 0 6g l ，改变( n h 4 ) 2 s 0 4 氮源的量，以确定合适的氮源用量以及最佳的碳氮比。 3 6 2 初始氮源浓度及碳氮比的确定 固定葡萄糖浓度1 0 6g ，l ，( n h 4 ) 2 s 0 4 氮源梯度选择6 0g l ，7 og l ，8 0 叽，9 0g 几，1 0 g l ，以确定合适的氮源用量以及最佳的碳氮比，测定各相关参数如表3 - 9 所示： 表3 - 9 不同吖h 4 ) 2 s 0 4 浓度下的发酵情况 结果表明：( n h 4 ) 2 s 0 4 浓度6 0 8 0g ，l 时，菌体量变化情况随( n h 4 ) 2 s 0 4 浓度增加而更 易于促进菌体生长，过高的( n h 4 ) 2 s 0 4 浓度，如浓度在9 0 1 0 0g 几时反而抑制菌体生长：推 测原因可能是光滑球拟酵母能够耐受一定的n 出+ 浓度，过高n h 。+ 浓度对细胞生长有毒害作 用，而在耐受范围内，随氮源浓度的提高，更易促进细胞生长，这一点也与理论上的低碳氮比 更易于促进细胞生长相吻合。丙酮酸浓度与菌体量正相关，变化情况也是如此，在8 0g l 的 ( n h 4 ) 2 s 0 4 浓度下达到最大，为4 9 5 5g l ，此时c n 为2 5 ：1 。 因此，我们优化的葡萄糖浓度为1 0 6g l ，( n h 4 ) 2 s 0 4 浓度为8 0g l ，c n 为2 5 ：l 。此时 菌体生长最好，丙酮酸产量较高，转化率较高，残糖浓度较低。 3 6 3c ，n ，m g ，p 元素正交实验结果分析 在单因素实验中，我们确定了较为合适的碳源，氮源用量以及碳氮比2 5 ：l ；但是对- 葡 萄糖，( n h 4 ) 2 s o 。而言，固定碳氮比情况下其不同的用量对发酵的影响还未考察，因此在对 m g s 0 4 和k h 2 p 0 4 水平进行正交实验分析的同时一并考察，每因素各选取三水平，每个做三 个平行样，作发酵实验，检测丙酮酸质量浓度，实验数据取平均值，结果见图3 1 0 ： 根据实验数据的极差及图表分析：四因素重要性依次为g l c ( n h 4 ) 2 s 0 4 m g s 0 4 河南大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 k h 2 p 0 4 ；四凶素的最佳组合为葡萄糖1 0 6g l ，m h 4 ) 2 s 0 46 0g l ，l 2 p 0 4 2 o g l ，m g s 0 4 0 3 l ：在此基础之上做金属离子正交实验。 表3 - l o 各冈素选取水平( 单位：叽) 因素 编号 g l c ( n h 4 ) 2 s 0 4m g s 0 4k h 2 p 0 4 一 l8 06 00 21 5 21 0 68 oo 32 o 31 3 09 8o 42 5 表3 1 l 碳氮镁磷元素的l 9 ( 3 4 ) 正交实验表( 单位：虮) 因素 笏号 g l c ( n h 4 ) 2 s 0 4 m g s 0 4k h 2 p 0 4 丙酮酸 lll l l 4 0 3 9 ： 2l2224 7 3 0 3l333 4 5 9 2 4 2l234 9 0 0 5223l5 0 9 9 623l24 9 6 l 73l324 5 4 6 832l34 7 2 3 9332 l 4 6 8 4 t l1 3 3 6 l1 3 4 4 91 3 7 2 31 3 8 2 2 1 2 1 4 9 2 41 4 5 5 21 4 2 7 81 4 2 3 7 t 31 3 9 5 31 4 2 3 71 4 2 3 71 4 1 7 9 x l 4 4 54 4 84 5 74 6 1 x 24 9 84 8 54 7 64 7 5 x 34 6 54 7 54 7 44 7 2 r5 33 71 91 4 2 9 丙酮酸发酵工艺的研究 c 1 g z g 3一n 1n z n 3一m 9 1m 9 2 m 口3 一p 1p z p j c 0 n s e