（生物物理学专业论文）芋螺毒素合成过程中的分离、检测、鉴定方法和结构预测的研究.pdf

皇旦坐些查兰塑主笙塞堕堕里壅缩写a c mb o cb z ld c cd c md m fd m sn m rh fh o b th p c eh p l ci a mm a l d l -t o f m sm e bm o bs p p st e at f at o s缩略语表英文名称a c e t a m i d o m e t h lt - b u t y l o x y c a r b o n y lb e n z y ld i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d ed i c h l o r o m e t h a n en n d i m e t h y l f o r m a m i d ed i m e t h y l s u l f i d en u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c eh y d r o g e nf l u o r i d e1 - h y d r o x y b e n z o t r i a z o l em o n o h y d r a t eh i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sh i g l lp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yl o d o a c e t a m i d em a t r i xa s s i s t e dl a s e rd c s o r p t i o ni o n i z a t i o n - t i m eo f f l i g h t - m a s ss p e c t r o m e t r yp - m e t h y l b e n z y lp - m e t h o x y b e n z y ls o l i dp h a s ep e p t i d es y n t h e s i st r i e t h y la m i n et r i f l u o r o a c e t i ca c i dp - t o s y l中文名称乙酰氨甲基叔丁氧羰基苄基二环己基碳二亚胺二氯甲烷n ，n 一二甲基甲酰胺二甲硫醚核磁共振氟化氢1 一羟基苯并三氮唑高效毛细管电泳高效液相色谱碘代乙酰胺基质辅助激光解吸飞行时间质谱对甲基苄基对甲氧基苄基固相肽合成三乙胺三氟乙酸对甲苯磺酰基本文中所用氨基酸等的命名和缩写，基本上按照国际纯粹和应用化学协会( i u p a c ) 和国际生化学会所属术语委员会( c b n ) 制订和公布的命名与规则。中国农业大学硕士论文中文摘要中文摘要jf 芋螺是热带海洋中常见的腹足类食肉软体动物，其毒液中含有大量的活性多肽芋螺毒素。芋螺毒素多为富含半胱氨酸的小肽，其分子量在1 0 0 0 5 0 0 0 范围内，一般含有1 0 3 0 个氨基酸残基，大多选择性地作用于细胞表面的离子通道受体和其他受体，是研究离子通道和其他受体极好的化学探针，已成为一类得到广泛应用的】：具药。因此，开展此领域的研究，对新药物的开发都具有重大的意义。1 ，r本文根据富含二硫桥键的蛋白质折叠理论和已成功应用于合成多种芋螺毒素的两步法策略，选择了芋螺毒素a _ m i ( 线性肽中的半胱氨酸c y s 3和c y s 8 采用对甲氧基苄基保护，c y s 4 和c y s l 4 采用乙酰氨甲基保护) ，采用s p p s 法对树脂肽进行了合成，用低高浓度h f 裂解得到线性肽。线性肽通过空气氧化和碘氧化的方法，对二硫桥键进行了构建，通过高效液相色谱、毛细管电泳、质谱对此构建过程进行了监测和鉴定，最终得到芋螺毒索q m i 。本文还利用毛细管电泳对芋螺毒素v 7 的三个不同半胱氨酸保护策略线性肽空气氧化成单环肽进行跟踪监测，得到反应动力学数据及其方程；利用图形工作站的构象预测软件对芋螺毒素n m i 和芋螺毒素v 7及其单环肽进行了结构预测，得到了它们在最低能量下的构象。关键词：芋螺毒素，毛细管电泳，质谱，二硫桥键构建2堕查些查兰堡主堡塞些! ! ：! ! !a b s t r a e tc o n es n a i l sa r eg a s t r o p o dp r e d a t o r ym o l l u s k so ft h eg e n e sc o n u st h a tl i v e i nt r o p i c a lm a r i n eh a b i t a t s ，a n dt h e r ea r ea nu n p r e c e d e n t e dv a r i e t yo fb i o l o g i c a l l y a c t i v ep e p t i d e si nt h e i rv e n o m s - c o n o t o x i n s c o n o t o x i n sa r eas e r i e so fs m a l ld i s u l f i d e r i c hp e p t i d e sw i t hm o l e c u l a rw e i g h t1 0 0 0 。5 0 0 0d a c o n o t o x i n sc o n t a i n1 0 - 3 0a m i n oa c i dr e s i d u e s ，a n dc a ns e l e c t i v e l ya f f e c to ni o nc h a n n e l so fc e l ls u r f a c ea n do t h e rr e c e p t o r s ，w h i c ha r eg o o dc h e m i c a lp r o b e so fr e s e a r c h i n gi o nc h a n n e l sa n dr e c e ：p t o r s ，a n dw i d e l yu s e da st o o l m e d i c i n e s o ，i ti si m p o r t a n tf o re x p l o i t i n gn e wm e d i c i n et od e v e l o p et h er e s e a r c ho f t h i sf i e l d a c c o r d i n gt ot h et h e o r yo fd i s u l f i d e r i c hp r o t e i nf o l d i n ga n ds t r a t e g yo ft w os t e p so x i d a t i o nw h i c hi ss u c c e s s f u l l yu s e di nc o n o t o x i n ss y n t h e s i s w es e l e c tm e t h o d so fb l o c k i n gc y sw h i c ha r ei nt h el i n e a rp e p t i d eo fc o n o t o x i n - m i ( c y s3a n dc y s8a r eb l o c k e dw i t hm b z l ，c y s4a n dc y s1 4a r eb l o c k e dw i t ha c m ) p e p t i d e - r e s i no f c o n o t o x i n - m ii ss y n t h e s i z e db ys p p sa n dc l e a v e df r o mr e s i nb y “l o w - h i g hh f ”m e t h o d t h r o u g ht h eo x i d a t i o no fl i n e a rp e p t i d eo f - m 1w i t ha i ra n di o d i n e d i s u l f i d eb o n d sw e r ef o r m e d t h ec o n o t o x i na - m ii so b t a i n e da tl a s ta n dt h ep r o c e s so ff o r m i n gd i s s u l f i d eb o n di sm o n i t o r e d _ a n di d e n t i f i e db yh p l c ，h p c ea n dm a l d i - t o f - m s i nt h i sp a p e r , t h ep r o c e s s ，f o r m i n gp e p t i d ec o n t a i n i n gas i n g l ed i s u l f i d el i n k a g et h r o u g ho x i d a t i o nt h r e el i n e a rp e p t i d e so fc o n o t o x i nv 7w i t ha i r , i sm o n i t o r e db yh p c ea l s o t h er e a c t i v ed y n a m i cd a t aa n di t se q u a t i o nw e r er e c e i v e d t h es t r u c t u r eo fc o n o t o x i n a m ia n dv 7w a sc a l c u l a t e db yu s i n gt h ec o n f o r m a t i o n a ls o f t w a r ei ns g ic o m p u t e rg r a p h i c sw o r k s t a t i o n ，a n dt h e n ，t h ec o n f o r m a t i o no fc o n o t o x i n a - m ia n dv 7i nt h el o w e s te n e r g yw a so b t a i n e d k e yw o r d s ：c o n o t o x i n ，c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，m a s ss p e c t r o m e t r yd i s u l f i d eb r i d g e3生旦坚兰竺查兰堡主望塞笙二塑坌第一部分前言1 1 芋螺与芋螺毒素1 1 1 芋螺芋螺是腹足纲( g a s t r o p o d a ) 新腹足目( n e o g a s t r o p o d a ) 毒舌总科( t o x o g l o s s a ) 芋螺科( c o n i d a e ) 海洋软体动物，约有5 0 0 余种，主要分布在太平洋和印度洋热带海域i l z i 。在w a l l s ，j g ( c o n es h e l l s ，1 9 7 9 ) 列出的3 0 0 多种芋螺中。太平洋海域有9 1 ，印度洋有6 9 ，大西洋仅有1 5，而气候温和的地区如南非的南海岸和澳大利亚的南海岸很少有发现。我国近海的芋螺科约有7 1 种，绝大多数见于西沙群岛、海南岛南部及台湾，为典型的热带种类，仅少数种类分布到海南岛北部以北的广西和广东大陆沿岸，个别延伸到东海i “i 。大多数芋螺栖息在珊瑚暗礁，特别是在潮间带和潮下带浅水区的暗礁平台、壕沟、礁湖等中。也有的栖息在海湾几十至几百米深处松软的沉淀物和大陆架。如地纹芋螺和织锦芋螺常栖息于珊瑚礁间或潮间带的下区，白昼或退潮后多在海藻下或珊瑚洞中隐蔽，夜晚外出觅食。图l 、中国南海常见：芋螺上排左起：桶形芋螺以b e t u l i n u sl i n n a e u s ) ，独特芋螺c a r a c t e r i s t i c u sf i s h e r ) ，将军芋螺( cg e n e r a i i sl i n n a e u s ) ；下排左起：槲芋螺( cq u e r c i n u ss o l a n d e ni nl i g h tf o o d ) ，织锦芋螺，僧芋螺( c m o n a c h u sl i n n a e u s )4中国农业大学硕士论文第一部分通常人们根据芋螺的食性将其分为三大类“：食虫芋螺( v e r m i v o r o u so rw o r m h u n t e r s ) ，如象牙芋螺( ce b u r n e u s ) 和方斑芋螺( ct e s s u j a t u s ) 等；食螺芋螺( m o l l u s c i v o r o u so rm 0 1 1 u s c h u n t e r s ) ，如织锦芋螺( ct e x t i l e ) 和黑芋螺( m a r m o r e u s )等；食鱼芋螺( p i s c i v o r o u so rf i s h h u n t e r s ) ，如地纹芋螺( cg e o g r a p h u s ) 、马兰芋螺( t u l i p a ) 、线纹芋螺( cs t r i a t u s ) 和幻芋螺( cn a g u s ) 等。它们依靠强有力毒液装置快速刺入猎物体内并将毒液肽注入其中使其不能运动。由于人们在收集芋螺壳作为工艺品和捕捞芋螺作为食物时只注重其美丽的外壳和鲜美的肉而忽视其毒性，以致于有文献记载的人被芋螺叮咬的事件达7 0 多起，其中至少包括2 6 人致死。早在1 7 0 5 年，就有人报道了芋螺能产生使人致命的毒液，对于脊椎动物包括人类来说，地纹芋螺( cg e o g r a p h u s ) 的毒性最大。对人类有致命威胁的还有织锦芋螺( ct e x t i l e ) 、马兰芋螺( ct u l i p a ) 、黑白芋螺( cm m d m m ) 、线纹芋螺( cs t r i a t u s ) 、堂皇芋螺( cg l o r i a m a r i s ) 和珍珠芋螺( co m a r i a ) 等。在对试验动物的试验中，食鱼芋螺的毒液毒性最大，其次为食螺芋螺，食虫芋螺毒性最小。典型的争螺毒液呈乳状，含许多小的不溶性颗粒、可溶性蛋白质、肽雨j 低分子化合物。芋螺毒液的毒性是其多种有毒成分共同作用的结果，它们以不同的方式作用于不同的靶位，产生多种生物活性如死亡、麻痹、颤抖、惊厥、昏睡、抑制、运动失调、多动等症状“；来自不同部位的成分的毒性略有不同，毒液管前段中的毒液一般为低毒性。1 9 6 3 年，w h y s n e r和s a u n d e r s 在对芋螺cc a l i f o r n i c u s 的致死成分进行了纯化研究后指出，致死的成分可能是蛋白或是蛋白结合物。芋螺毒液中含有极其丰富的有毒物质一一芋螺肽，即芋螺毒素。1 1 2 芋螺毒素芋螺毒素是具有代表性的一类多肽毒素，它毒性高，有的半数致死量有的达到微克每公斤。芋螺毒素的分子量在1 0 0 0 5 0 0 0 范围内，大多选择性地作用于细胞表面的离子通道受体和其他受体，是研究离子通道和其他受体极好的化学探针，己成为一类得到广泛应用的工具药。同时它也为治疗药物的寻找提供了丰富的先导化合物。因此，开展此领域的研究，对新药物的开发都具有重大的意义。据不完全统计。迄今为止，已有8 9 种芋螺毒素的结构被鉴定( 不包括从基因克隆预测的序列) 涉及芋螺1 6 种，其中食鱼芋螺9 种，食螺芋螺4种，食虫芋螺3 种9 i 。! 坐塑型生壁坠堡兰苎二塑坌芋螺毒素是一些含有1 0 3 0 个氨基酸的小肽，而其它的动物蛋白毒素如蜘蛛毒、蝎毒、蛇毒常含有4 0 1 0 0 个氨基酸残基。芋螺毒素多数含有多个半胱氨酸，并形成有一定保守性的二硫键骨架。它们构象较稳定，能选择性地作用于离子通道等蛋白受体，从而影响神经传导，产生不同的生理作用。按其对不同受体的作用，芋螺毒素可分为以下几类”。q 一芋螺毒素：它主要作用于神经肌肉接头的n 一乙酰胆碱受体，拮抗乙酰胆碱，从而引起麻痹。某些a 一芋螺毒素，对脊椎动物腹腔注射可引起麻痹死亡。它们是芋螺毒素中较小的一族，通常含四个半胱氨酸形成两对二硫键。其半胱氨酸的排列方式为：cl c z c n c 4 ，成键方式为：c 。- - c 。，c 2 - - c 。a 一芋螺毒素是骨骼肌中烟碱型乙酰胆碱受体( n - a c h r ) 拮抗剂，所以在临床上川作肌肉松弛剂、催眠药( 如m i 和g i i 及其类似物) “；m i i 和i m i及其类似物被用于治疗小细胞肺癌( s m a l l - c e l ll u n gc a r c i n o m a ，s c l c )或探测s c l c 瘤的存在“。a 一芋螺毒素是用于乙酰胆碱受体类型的探针，同时对乙酰胆碱受体的结构一一功能关系的研究提供有用的工具乜2 lu 一：芋螺毒素：u 一芋螺毒素作用于肌肉中电压门控钠离子通道，可以引起脊椎动物麻痹，死亡。它们通常含有2 0 2 5 个氨基酸，其中6 个半胱氨酸。其半胱氨酸的排列方式为：c c c “c “c s c 6 ，成键方式为：c - 一c 。，c ：一c s ，c s c 。6 一芋螺毒素：6 一学螺毒素是一类从食螺芋螺中分离的多肽毒素，也作用于钠离子通道，但是不与河豚毒素( t t x ) 和u 一芋螺毒素竞争，它们具有不同的作用位点。其半胱氨酸排列方式与u 一芋螺毒素类似，为：c n c 厶c c 。c c 。，成键方式为：c - 一a ，c 2 一g ，已一c 6 。但疏水性较强，因此研究者认为这些肽可能是溶解在脂膜中从钠通道的侧面发生作用。( ) 一芋螺毒素：u 一芋螺毒素作用于神经末梢突触前的电压敏感性钙离子通道，不同的u 一芋螺毒素所作用的受体亚型不同，现u 一芋螺毒素已经成为研究电压敏感性钙离子通道的标准试剂。如m _ g v i a 作用于神经中的n 型及l 型钙离子通道，而只对肌肉中的n 型钙离子通道起作用。一芋螺毒素一般含有2 5 3 0 个氦基酸，其中6 个半胱氨酸，排列方式为：ch c “c 3 c “c “c 6 ，成键方式为：c ，一c 。，g c s ，c 3 一已。与6 一芋螺毒素相比带有较多的正电荷，亲水性强。6! ：旦! 些查堂堡主堡壅塑二塑坌k 一芋螺毒素：1 9 9 0 年0 1 i v e r a 就报道了芋螺毒素中有一类与钾离子通道作用的多肽毒素存在。”，但直到1 9 9 8 年才报道第一个x 一芋螺毒素的序列，它来白食鱼芋螺，芋螺fp u r p u r a s c e n s ，序列为c r i o n q k c f q h l d d c c s r k c n r f n k c n 。是一个含6 个半胱氨酸的2 7 肽，命名为k c o n o t o x i np v i i a ，其半胱氨酸分布和二硫键配对与典型的u 一族一致。、l ，一芋螺毒素：1 l r c o n o t o x i np i i i e 是v 族中的唯一成员，它作用于n 一乙酰胆碱受体，但不阻断a 一银环蛇毒素及其它a 一芋螺毒素，因此，它与a 一芋螺毒素有不同的作用位点。它的序列为：h o o c c l y g k c r r y o g c s s a s c c q r + ，是一个含有6 个半胱氨酸的2 4 肽，二硫键的配对方式与u 一芋螺毒素相同。芋螺睡眠肽( c o n a n t o k i n s ) ：c o n a n t o k i n s 作用于脊椎动物中枢神经系统的兴奋受体一一谷氨酸受体的n m d a ( n - 甲基一d 一天冬氨酸) 亚型。它可以使出生两周以内的小鼠进入一种睡眠状态，而使成年鼠出现超敏反应( h y p e r a c t i v e ) ，其结构中含有多个y 一羧基谷氨酸。尚有许多芋螺活性肽其作用的受体还没有研究清楚，在此不加列举。1 2 毛细管电泳的原理1 2 1 毛细管电泳简介1 2 1 1 毛细管电泳的发展概述毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) ，又名高效毛细管电泳( h p c e ) ，是近年来分析化学中的一个比较活跃的领域之一，是近年来发展最快的分析方法之一。电泳作为一种物理现象早在1 9 世纪已经被人类所认识到，在本世纪初期作为一种分离技术开始广泛应用。1 9 0 7 年，f i e l d 和t e a g u s 利用琼脂糖凝胶管首先实现了白喉毒素和抗毒素的分离”1 。1 9 3 7 年t i s e l i u s 建立了蛋白质的移界电泳方法，将人血清分成几个成份，因此荣获诺贝尔化学奖。在电泳过程中发现，由于产生的焦耳热会造成体系内部形成温度梯度，极易引起溶液对流，扰乱样品区带，导致分离效率下降。为了克服这一缺点，4 0 年代以来，人们采用固体支持物来抑制对流和稳定样品区带，从而出现了纸电泳、醋酸纤维素电泳、淀粉凝胶、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e ) 等。6 0 年代末期，有人尝试用3 m m 内径的石英管并用高电压进行电压分离，来解决电泳过程中产生的焦耳热引起样品区带分散问题。随着检测技术及拇壤7中国农业大学硕士论文第一部分现代微柱技术的发展，1 9 8 1 年j o r g e n s o n 和l u k a c s 首先在7 5um 内径的石英毛细管内用高电压进行分离，获得4 0 万塔板数的分离效率，并成功解释了毛细管区带电泳( c z e ) 的谱带分散过程，刨建了现代毛细管电泳技术l 2 9 jo1 9 8 3 年h j e t e n 等将传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术引入发展为毛细管凝胶电泳( c g e ) 。1 9 8 4 年t e r a b e 等建立了胶束毛细管电动力学色谱“”。1 9 8 7 年h j e t e n 等建立了毛细管等电聚焦技术。至此，毛细管电泳的儿种主要的分离模式就己经形成了。得益于毛细管色谱( 气相和液相) 仪器技术的研究成果，到了8 0 年代末期，第一台商品化的毛细管电泳仪就面市了。随仪器技术的日益成熟，商品化的毛细管电泳仪发展十分迅速。目前，美国和欧洲的一些分析仪器公司己经先后推出近2 0 种型号的仪器。1 2 1 2 毛细管电泳的主要特点同h p l c 相比，c e ( 毛细管电泳仪) 省去泵、梯度混合装置和进样阀，不需要特殊的检测池，而且毛细管电泳的多种分离模式都可以在一台c e 上实现，可以通过改变选择性来扩大应用范围。c e 使用的石英毛细管可以反复使用，其柱体积只有几个ul ，分析过程中流量又小，消耗的缓冲液远远少丁h p l c ，十分经济。毛细管的高电阻增加分离速度的同时 高电压( 1 0 3 0 k v ) 下实现高电场( 1 0 0 5 0 0 v c m ) 限制了焦耳热的产生，这使得c e 具有很高的塔板数( n 1 0 5 1 0 7 m ) 。c e 的柱体积小，必须以很小的进样体积( 3 情况下，其内表面由于硅羟基( s i o h )以阴离子形式存在而带负电，和溶液接触时形成一个双电层。在高电压作8三生塑型竖堡主丝奎笙二塑坌用f ，双电层中的水合阳离子引起了流体的整体性地向负极方向移动，这种现象叫做电渗流( e o f ) 。电渗流是c e 中流体前进的驱动力。在高压电场中，带电粒子在电场的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象u 做电泳。粒子在毛细管电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流两种速度的矢量和。+高压电源图2 、毛细管电泳仪的基本结构示意图+ + + + + + + + + + + + + + f 、 一口0 二= 口- - - b ，。一0 一口0 + + + + + + + + + + + + + + 图3 、毛细管电泳分离原理示意图图中+ 为正离子，一为负离子，口为中性粒子正离子的运动方向与电渗流是一致的，它最先流出；中性粒子的电泳流速度为零，其迁移速度为电渗流的速度；负离子的运动方向和电渗流相反，但电渗流的速度一般大于电泳速度，它在中性粒子之后流出。从而各种粒子由于迁移速度不同而得到分离。从图3 中可以看到，电渗流使整个流体象塞子一样以均匀的速度向前9! 旦坐些查兰堡主堡苎笙二塑坌运动，而且整个流型呈现出近似于扁平型的“塞式流”。由于它的存在使溶质区带在毛细管内原则上不会扩散。但是在h p l c 中，由于采用压力驱动的方法使柱中流体呈抛物线型，其中心的流速是平均流速的两倍，这必然会导致溶质区带本身扩散，引起柱效的下降，使其分离效率低于c e 。1 3m a l d i t o f - m s 介绍1 3 1 姒l d i m s 的发展概述：激光解吸电离质谱( l d i - - m s ) 是分析难挥发有机物的手段之一，曾川于分析合成聚合物和热不稳定生物小分子，但激光解吸测定的分子量均小丁二3 k d a 。因只有当化合物能较好吸收激光时，才能产生解吸，对不易吸收激光的化合物，需加大辐射能，大量能量沉积到样品分子上，会破坏其结构，使分子离子峰变弱。1 9 8 8 年t a n a k a 和h i l l e n k a m p 两个研究组分别提出使用基质辅助激光解吸电离质谱( m a l d i - m s ) ，使l d i m s 应用于生物大分子分析得到发展”1 。1 _ 3 2m a l d i - t o f - 峪原理基质辅助激光解吸电离产生的离子常用飞行时间( t i m e o f f l i g h t ，t o f ) 检测器进行检测，所以i 雌l d l 名字常与t o f 联在一块，即叫基质辅助激光解吸飞行时间质谱( m a l d i t o f - m s ) ，其电离的基本原理是利川激光脉冲辐射分散在底物中的分析物使其解吸形成离子，并根据不同荷质比离子在仪器无场区飞行和达到检测器时间的不同而形成一张完整质谱图。蛙熏鬟藏图4 、有基质辅助的激光解吸飞行时间质谱仪器示意图1 0一璺堡些盔兰塑主笙壅笙二塑坌m a l d i - - t o f m s 分析蛋白质关键是选择合适基质。基质的具体作用包括以下儿个方面：首先基质相当于样品分子的溶剂，样品分子被基质彼此分开，这种作用削弱了样品分子之间的相互作用，然后基质分子从激光脉冲中吸收能量，转化为固态熔体体系的激发能，使微量样品产生瞬间相变，在形成离子过程中有两个临界值，低的是表面解吸，高的是本体解吸，后者给出离子信号。常用的基质是尼古丁酸或其同系物，如肉桂酸衍生物、苯甲酸衍生物和芥子酸等”1 。m a l d i 使用脉冲激光，脉冲宽度为卜2 0 0 h m 。常用的有氮激光器( 3 3 7 n m ) 、n d y a g 激光器( 3 5 5 n m ，2 6 6 n m ) ，红外激光器有t e gc o z 激光器( 1 0 6 n m ) ，e r y a g 激光器( 2 9 4 n m ) 等。1 _ 3 3 姒l d i t o f - 螨的特点m l d i 与其它质谱电离源相比，对样品要求低，能耐高浓度盐、缓冲剂和其它非挥发性成分，这是m a l d i 的显著优点。高灵敏是m a l d i 的另一个优点，样品量只需l p m o l ，甚至更少。若样品浓度大于0 5 9 l ，基质对样品隔离作用会受影响，从而导致信号强度下降。在m a l d i t o中，对蛋白质与多肽的测量信号主要是完整的分子离f-ms子峰，在应j ： j 于测定蛋白质和多肽的分子量时，精确度可达到01 0 0 1 ，这远远高于其它方法( 如s d s p a g e 、凝胶、超离心等) 。1 4 课题意义与研究内容芋螺毒素的应用研究受到了广泛的关注，它既为神经生物学提供了有效工具，又拓宽了新药开发的领域，具有较大的潜在应用价值。芋螺毒素a m i 是1 9 8 2 年m c l t o s h 从食鱼的幻芋螺毒液中分离得到的一个1 4 肽“”。芋螺毒素q - m i 含有四个半胱氨基酸形成两对交叉的二硫键，该肽序列为：g 。y a 。g c 5 ：j ：i i ：；：j ：。盈。g ，y l y 。a 。n t y ，s 。r c y 。一n h ：( 末端酰胺化) 。它作用于乙酰胆碱受体，对脊椎动物毒性很大，是目前己知毒性最大的芋螺毒素之一。1ug 的m i 可使2 0 9 重的小鼠在2 0 m i n 内死亡。选择它为合成目标物，其目的一是进行合成方法的探索研究：二是芋螺毒素。一m i 可作为神经生物学研究的工具，主要是用作乙酰胆碱受体研究i ：具具有实用价值。! 里查些盔兰堕圭堡苎丝= 塑坌a 一芋螺毒素t 大都由1 3 一1 5 个氨基酸残基组成，含有两个二硫桥键这两个二二硫桥键对多肽的活性有十分重要的作用，但是同时又给其合成带来一定难度。芋螺毒素的化学合成的关键在于二硫桥键的构建。对于捅有两个二硫桥键以上的多肽合成来说，由于其含有多个c y s 残基，在构建二硫桥键时极易形成多个异构体( 两个桥有3 个异构体，三个桥有1 5 个异构体，四个桥有1 0 8 个异构体) ，对下一步的分离纯化带来很多困难。因此在对合成路线的设计与选择是十分重要的。总的来说要考虑以下因素：首先是半胱氨酸侧链上保护基的选择“。：对半胱氨酸侧链上保护基的选择主要有以下几方面的考虑：在合成过程、裂解过程中巯基保护基的稳定性，在氧化过程中巯基保护基对氧化试剂的稳定与脱保护的难易程度，以及巯基保护基对其它氨基酸残基有无影响等等。可以利用的主要巯基保护基有苄基类( 包括对甲氧基苄基、对甲基苄基) 、三苯甲基、乙胺甲酰基、乙酰胺甲基、叔丁基、对硝基苄基等等。其次是氧化体系的选择“”：对于一个有效的氧化体系，其选择性是十分重要的。常用的氧化体系主要有空气氧化体系、谷胱甘肽氧化体系、碘氧化体系、二甲亚砜氧化体系等。再有是氧化策略的选择“3 o “：对一个含有两个以上的二硫桥键的氧化策略通常有两种：一步法与两步法。一步法是采用随机氧化的理论，在构建二硫桥键时极易形成多个异构体；两步法是采用分步氧化，选择性进行构建，需要两种在不同氧化体系下可以脱除的半胱氨酸侧链上保护基。1 9 8 3 年g r a y ，w r 成功使用此策略用于芋螺毒素a m i 的合成。1 9 9 7 年蒋辉在此基础上合成了含三个二硫桥键的芋螺毒素6 一p v i a 。本课题的主要研究内容是：a 、利用i 蒯相合成肽的方法，使用b o c t f a m b h a 树脂合成策略，合成学螺毒素o m i 线型肽，并利用毛细管电泳、高效液相等其他色谱与质谱方法，对芋螺毒素a m i 线型肽二硫桥键构建过程进行检测。b 、利用毛细管电泳对芋螺毒素v 7 的三个线性肽的空气氧化进行跟踪监测，以求得到反应动力学数据。c 、利用分子设计工作站对芋螺毒素o m i 氧化过程中可能产生的结构和芋螺毒素v 7 及其三个线性肽进行构象计算研究。! 堕垄兰兰奎兰堡主堡苎笙三塑坌第二部分芋螺毒素a m i 的合成、构建、纯化与鉴定2 1 芋螺毒素q m i 线性肽的合成与纯化2 1 1 芋螺毒素a _ m i 线性肽的合成与鉴定方法的选择2 1 1 - 1 合成策略的选择芋螺毒素a m i 是1 4 肽，拟采用固相肽合成( s p p s ) 法合成线性肽。由于芋螺毒素n - m i 的c 端是酰胺，所以有两种策略可以选择，其一是f m o c p i p e r i d i n e r i n ka m i d e - m b h a 树脂策略，另一个是b o c t f a m b h a 树脂策略。前者虽然合成过程中氨基酸偶联率高，而且酸碱引起的副反应较少，有利于下一步的分离纯化，但是f m o c 保护的氨基酸价格太高，且需要特殊手段才能得到c _ 端酰胺化的肽；而后者路线较简洁，但合成过程中酸碱引起的副反应以及h f 裂解时的副产物较多，不利于下步的纯化。根据本实验室的具体条件合成采用b o c t f a m b h a 树脂策略制备芋螺毒素一m i 线性肽。2 1 1 2 合成方法及保护基的选择采用m b h a 树脂，利用活泼酯法合成全保护树脂肽。该方法主要是将n ”一和侧链保护的氨基酸羧基与h o b t 在d c c 的存在下形成活泼酯与树脂上暴露的氨基缩合。如图5 所示：所有氨基酸的都为b o c 保护n o 氨基酸，侧链保护为s e r ( o b z l ) ，t y r ( o b z i ) ，l y s ( z ) ，h i s ( t o s ) ，a r g ( t o s ) 。为了进行定向合成，保证二硫桥键的配对l e 确，c y s 侧链中c y s 3 和c y s 8 采用对甲氧基苄基( m o b ) 保护，c y s 4 和c y s l 4 采用乙酰氨甲基( a c m ) 保护。对甲氧基苄基( m o b ) 在下一步的h f 裂解中可以同其他保护基同时脱去，而乙酰氨甲基( a c m ) 则将保留。它们将在第2 步i ：氧化时脱除，并形成二硫桥键。2 1 1 3 带有保护基肽与树脂的分离合成结束后，结合在邶 i a 树脂芋螺毒素a m i 肽树脂内含有侧链为一o b z l 保护的s e r 、t y r ，侧链为一t o s 保护的a r g 、h i s ，有侧链为一z 保护的l y s 以及侧链为一m o b 、一a c m 保护的c y s 。采用低高浓度h f 法将肽从树脂上切f ，同时脱除保护基，只有肽中c y s 4 和c y s l 4 的a c m 保护未脱除。用醋酸溶液提取后，冷冻干燥得到粗肽。! 坐堕型生茎兰堡燮笙三塑坌b 。n h 一罄c o o 。+c h 3n c h 瞧ia t t a c h m c 呲煳箍_ n h 垒竹aj 枷r o f t e 凡c t i o nr c f 3 c o o o n l 乜x i ：h ，c o n h 名h - h r b o c - n h c h c o nc h a i ne | o n s a t l o nd e p r o t e c t i o nn e u t r a l i z a t i o nh 警c 。o 二h - c o 越c h - c o 眦- c h 一n h c- 卜n 一n h c - 寸哆 霞)2 1 1 4 粗提与鉴定将冷冻干燥得到粗肽，在s e p h a d e x g 一1 5 上进行脱盐处理，收集茚三酮检测阳性的峰，准备进行第一步氧化反应，同时用毛细管电泳对粗肽进行分析，用质谱( 姒l d i - t o f - m s ) 鉴定目标肽。基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱可以对分子量大到几十万的蛋白质分子进行测定，而对样品的纯度要求不高，且不出碎片峰，误差小于0 2 。1 4；一圆崦拳删- 2 拶一秽。k10ml塞o甘c睡陀n麓嘣瑚k毒一一呲三望墅蔓! ! ：! 兰堡兰丝兰笙= 塑坌2 1 2 固相合成全保护树脂肽2 1 2 1 材料与仪器试剂：m b h a 树脂( 取代值0 6 m m o l g ，颗粒度2 0 0 4 0 0 目) ，s i g m a 公司：d c c和h o b t ，a l d r i c h 公司；b o c c y s ( a c m ) ，b o c c y s ( m o b ) ，b o c s e r ( o b z l ) b o c t y r ( o b z l ) ，b o c l y s ( z ) ，b o c h i s ( t o s ) ，b o c - a r g ( t o s ) ，b o c a s n ，b o c a l a ，b o c p r o ，b o c g l y ，均为美国a c t 公司。t f a ，浙江桃源化工厂；其余试剂，均为北京试剂公司。一些试剂处理方法：三乙胺( 分析纯) ，干燥后重蒸；n ，n - 二甲基甲酰胺( 分析纯) ，分子筛干燥后重蒸：d c m ( 分析纯) ，无水n a 2 c o 。干燥后重蒸；无水乙醚( 分析纯) ，金属钠回流后重蒸。茚二酮检测试剂：a ：茚三酮l g 溶于2 0 m l 无水乙醇。b ：苯酚2 0 9 溶于5 m l 无水乙醇。c ：取l 1 0 的氰化钾溶液0 5 m l ，用经过茚三酮处理的毗啶稀释为2 0 m l 。仪器：摇床，国产；多肽合成反应管，中科院上海有机所制；冷冻干燥机a l p h a l 4 ，c h r i s t 公司；快速电子天平( 感量0 0 1 9 ) 型号b l l 5 0 0 s ，分析天平( 感量0 o l m g ) b p 2 1 1 d ，均为s a t o r i u s 公司。2 1 2 2 合成方法按照活泼酯法步骤进行，将m b h a 树脂至于反应器中，加入d c m 浸泡过夜，用l o t e a d c m 中和3 0 m i n ，分别用d c m 、m e o h 洗涤三次，加入肽氨基酸序列中c 端第一个b o c 一从的h o b t 活泼酯，在室温下摇床搅拌反应两小时，进行茚二酮检测。乙醚封闭3 0 m i n ，用3 3 t f a d c m 连续脱b o c 两次，一次5 m i n ，一次3 0 m i n 。如此反复，直至序列结束。洗涤数次，放于干燥器中减压干燥，等待裂解。详细操作见表i 。茚三酮检测方法：在- d , 试管中加入微量肽树脂，取另一试管作空白对照，分别加入a 、b 和c 各2 3 滴，在1 0 0 c 水浴中加热5 m i n ，与空白对照看树脂和溶液颜色变化，变蓝则为有一级胺的存在。此方法不能检测p r o 。土尘塑型生苎兰型苎笙三塑坌2 脱保护3 脱保护4 洗涤5 中和6 洗涤7 中和8 洗涤9 洗涤l o 检测1 1 偶合1 2 洗涤1 3 洗涤1 4 洗涤1 5 洗涤1 6 洗涤1 7 中和1 8 洗涤1 9 检测2 0 封闭2 l 洗涤2 2 洗涤2 3 洗涤2 4 洗涤5 0 t f k ? d c m25 0 t f a d c m3 0d c m2i o t e a d c m3m e o h21 0 t e a d c m2m e o h2d c m2茚三酮检测a a) 1 2 0o c m2m e o h2d c m2m e 0 h2d c m21 0 t e a d c m2d c m2茚三酮检测，如未通过从1 1 步重复2 5 a c 2 0 d c m2 0d c m2m e o h2d c m2m e o h22 1 3 i f 裂解2 1 3 1 材料与仪器h f ( 钢瓶装) ，河南鹤壁化工厂；p - c r e s o l ，t h i o l c r e s o l 。s i g _ i a 公司。h f 裂解仪，日本( 大阪) 蛋白质研究所：离心机，s i g m a 公司。2 1 3 2 裂解方法将2 0 0 m g 肽树脂加入聚四氟乙烯h f 裂解反应器中，加入5 m l d m s ，0 7 5 m lp - c r e s o l ，0 2 5 m lt h i o l c r e s o l ，在液氮冷却下转移约2 5 m l 无水1 6苎尘型型生茎堂型塞苎三塑坌h f ，o c 下反应1 2 0 m i n ，减压抽除d m s ，再加入l o m l 无水h f ，0 下反应6 0 m i n ，减压抽除h f 。用o 干燥的无水乙醚( 含有2 巯基乙醇) 5 0 m l 洗涤5 次，尽量将捕捉剂洗净，并依次用2 5 、5 乙酸溶解，稀释到乙酸浓度小于1 0 ，冷冻干燥。2 1 4 粗肽的脱盐与鉴定2 1 4 1 脱盐2 1 4 1 1 材料与仪器材料：双重蒸水，0 i t f a 溶液，0 5 醋酸溶液( v v ) ；葡聚糖s e p h a d e x g 一1 5 ，p h a r m a c i a 公司。仪器：凝胶过滤系统，p h a r m a c i a 公司；记录仪，p h a r m a c i a 公司：层析拄1 6 6 0 a m ，北京新技术公司。2 1 4 1 2 实验方法见图5 中的条件。2 1 4 2 鉴定2 1 4 2 1 材料与器材材料：0 0 1 m 磷酸盐缓冲溶液( p h = 2 5 ) 作为电泳缓冲液。器材：高效毛细管电泳仪b i o f o c u s 3 0 0 0 型，美国b i o - r a d 公司：石英毛细管5 0 um 3 6 c m ，石英毛细管5 0 um 5 0 c m ，河北永年光纤厂；基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪m l d i 型，m i c r o m a s s 公司。2 1 4 2 2 毛细管电泳分析实验方法见图6 、7 中的条件。2 2 线性肽的氧化及分离、纯化2 2 1 芋螺毒素q 叫i 的构建、纯化与鉴定方法的选择2 2 1 1 第一步氧化第一步氧化采用空气氧化体系进行。空气氧化体系要求简单，只要在弱碱性条件f 就可以与溶于水中的氧气发生氧化反应，形成二硫桥键，但蠹；1 7! 璺垒些查兰堡兰堡兰丝三塑坌是要求肽的浓度要低于0 1 m g m l ，整个反应时间也较长。2 2 1 2 第二步氧化第二步氧化在i ：的体系中进行。i z 氧化体系可以在脱掉a c m 保护基的同时形成二硫桥键，反应十分快速，试剂便宜易得，操作简单；但是在反麻的过程中，i z 对一些氨基酸的侧链残基同样有氧化作用。为防止二硫桥键的交换，增强肽的溶解性，决定选用含有5 t f a 和2 0 7 腈水溶液( v v ) 。2 2 1 3 纯化与鉴定在每一步的氧化后都要进行鉴定，采用毛细管电泳鉴定目标肽纯度，同时用m a l d i t o f m s 质谱鉴定目标肽。2 2 2 空气氧化与碘氧化2 2 2 1 材料与器材材料：0 0 1 m o | l 的碳酸氢铵溶液，含5 t f a 2 0 乙腈水溶液( v ，v ) ，5 m m l碘乙腈溶液，含o i t f a 的乙腈，2 0 m g m l 抗坏血酸溶液，含o 1 t f a的双重蒸水。器材：制各色谱柱c 1 8 型号2 1 8 t p 5 1 0 ，规格2 5 0 1 0 r a m ，分析色谱柱c 18型号2 1 8 t p 5 4 ，规格2 5 0 4 6 m m ，美国v y d a c 公司；半制各高效液相色谱