微生物工程 第5章 发酵过程及控制.ppt

,第五章发酵过程及控制,发酵是一个复杂的生物化学过程影响因素很多：菌种、培养基、温度、pH、溶氧、污染等。,一、种子制备工艺及质量控制二、发酵过程中的代谢变化及规律三、基质浓度变化及控制四、温度对发酵的影响及控制五、溶解氧对发酵的影响及控制六、pH对发酵的影响及控制七、CO2对发酵的影响八、泡沫的形成及控制九、染菌分析及控制,第五章发酵过程及控制,一、种子制备工艺及质量控制,菌种是发酵的关键，从一个保存的菌种，到生产上使用的种子，如果按几十几百吨的发酵规模，10的种子量（接种量）计，需要几吨几十吨的种子。,（一）、作为种子的要求：1、细胞的生活力强，移种至发酵罐后能迅速生长2、菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求3、无杂菌污染4、生理形状稳定、保持稳定的生产能力,（二）、种子制备的工艺流程及对发酵的影响1、工艺流程,2、接种时间（种龄）和接种量接种时间：对数生长期，菌体量还未达最高峰。,接种量：决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。谷氨酸棒状杆菌：1大多数抗生素发酵：510%个别的发酵：2025接种量过小，除延长发酵周期外，往往还引起其它不正常情况。接种量过高，会使菌体生长过快，培养液粘度过高，造成供氧不足。,3、种子质量检查与判断检查pH检查培养基灭菌后糖、氮、磷等的含量检查菌丝的形态、浓度、种子液外观等无菌检查稳定性检查其它参数检查：某种酶的活性产物量等,（三）、影响种子质量的因素：1、原材料质量2、培养温度、湿度、时间等3、种子罐通气量4、冷藏时间5、传代次数,二、发酵过程中的代谢变化及规律,与代谢有关的参数：1、物理参数、温度、罐压、搅拌速度、空气流量、表观粘度、发酵液重量,与代谢有关的参数：2、化学参数、基质浓度、pH、产物浓度、DNA量、关键酶、溶解氧、排气中的氧含量、排气中的CO2含量,与代谢有关的参数：3、生物参数、菌丝形态、菌丝干重或湿重、菌体比生长速率、氧的比消耗速率、糖的比消耗速率、氮的比消耗速率、产物的比生产速率,三、基质浓度变化及控制,（一）、碳源浓度变化及控制碳源物质是发酵过程中菌体生长和产物合成的能量和碳素的来源。在发酵的前期，碳源物质主要用于生长，消耗较快，在发酵后期，碳源物质主要用于产物合成，消耗速度放缓。快速利用的碳源物质：对生长有利，对次级代谢产物的形成有抑制作用。缓慢利用的碳源物质：对延长产物的合成是有利的，尤其是次级代谢产物。,到发酵的中后期，发酵液中的残糖基本耗尽，影响产物的合成。如果采用丰富碳源的培养基，又会产生其它的问题;如培养基浓度过高，影响通气搅拌，过高的碳源浓度也抑制菌体的生长。解决的方法是采取“中间补料”补糖的方法：连续滴加补糖小量多次间歇补糖大量少次补糖,“中间补料”可以延长产物的产生时间，推迟菌体的自溶时间，增加了发酵液的体积，而使发酵单位大幅度上升。,（二）、氮源浓度变化及控制氮源物质主要用于菌体中蛋白质、核酸等含氮物质的合成，有些发酵产物中含有氮。发酵前期，氮源物质随菌体浓度的急剧增加而迅速减少，发酵中期，氮源（氨基氮）的下降速度比较缓慢，发酵后期，由于菌体自溶，氨基氮会回升。氮源物质往往抑制次级产物的合成。,快速利用的氮源物质：如氨水、铵盐促进菌体生长。缓慢利用的氮源物质：有利于延长产物的合成期。一般情况下，发酵培养基中同时含快速利用的氮源和缓慢利用的氮源物质。如果氮源物质投料多，会造成菌体生长快，但菌体衰老也快。解决方法：“中间补料”。,四、温度对发酵的影响及控制,（一）、温度对微生物和发酵的影响1、不同的菌、不同的发酵对温度的要求不一样。2、菌体生长的最适温度与产物形成的最适温度往往不一致。3、菌种在不同的生长期对温度的敏感性不同。4、温度归根结底是影响酶的活力。,谷氨酸菌种的最适生长温度和产物形成的最适温度,（二）、温度在发酵中的变化规律图生物热的变化规律,（三）、温度的控制依靠夹层或蛇管控制。目前许多发酵罐都采用自动化控制。,五、溶解氧对发酵的影响及控制,溶解氧：溶解于液体（发酵液）中的氧。氧难溶于水，在25，1atm下，氧在水中的溶解度为0.26mmol/升，临界溶解氧浓度：满足微生物呼吸的最低限度的溶解氧浓度。一般好气性微生物约为0.0030.05mmol/升之间。,影响微生物需氧量的因素1、菌种2、菌体浓度3、菌龄4、培养基,（一）影响需氧和供氧的因素,影响供氧量的因素1、搅拌2、通气量3、空气分布管的结构4、发酵罐的液柱高度/直径比5、培养液的物理性质6、泡沫,溶解氧的控制：应满足需氧供氧,（二）溶解氧的控制,需氧方面控制最适的菌体浓度供氧方面：1、改变气体成份2、提高搅拌速度3、增加挡板4、增加通气量5、提高罐压,几个概念：呼吸强度：指一克干菌体，在一小时内所需氧的毫摩尔数摄氧量：指一升发酵液，在一小时内所需氧的毫摩尔数通气量：指一分钟内，通过发酵液的空气体积比发酵液的体积,六、pH对发酵的影响及控制,（一）、pH值对发酵的影响：1、pH影响酶的活性2、pH影响微生物细胞膜的带电状况，从而影响微生物对养料的吸收和对代谢产物的分泌3、pH影响培养基中某些营养物质的可给性4、pH可能改变培养基的氧化还原电位5、pH会影响某些微生物的形态,（二）、影响pH变化的因素：1、菌种特性2、培养基组成3、发酵条件,（三）、pH在发酵过程中的变化规律,在发酵前期，菌体生长缓慢，糖分解的少，铵离子利用的也少，所以pH变化缓慢。随菌的生长，菌分解了含氮有机物，释放出铵，培养基的pH会缓慢上升。当菌转入对数生长期，由于菌体大量繁殖，大量利用糖和铵离子，培养基的pH逐渐下降。在生长后期，由于菌体自溶，释放出铵，pH又回升。,1、调节培养基的配方2、补料控制加酸、加碱增加无机氮源增加碳源物质3、调节通气量,（四）、发酵过程中pH的调节,七、CO2对发酵的影响,CO2是微生物的代谢产物，同时它往往也是合成所需的一种基质。排气中CO2的浓度与细胞量有一定的联系，通过测定CO2的生成，可用来估算菌的生长速率和细胞量。溶解在发酵液中的CO2对氨基酸、抗生素等发酵具有抑制或刺激作用。,（一）、CO2对菌体生长及产物形成的影响,当排气中的CO2浓度高于4时，菌体碳水化合物的合成及呼吸速率下降。发酵液中的CO2浓度为1.6102mol时，会严重抑制酵母菌的生长。CO2影响产黄青霉的形态。,CO2对氨基酸合成的影响,CO2对紫苏霉素生物合成的影响,（二）、排气中CO2与菌体生长的关系,（三）、排气中CO2与pH的关系,对数生长期pH变小,生长后期,菌体自溶,铵离子被释放,pH升高,RQ（呼吸商）=,CEO,OUT,CEO：CO2释放率（molCO2/Lh）OUT：菌耗氧率（molO2/Lh）,（四）、排气中CO2与排气中O2之间的关系,酵母菌：RQ=0.93生成柠檬酸RQ=1.0生成菌体RQ1.1生成乙醇青霉素发酵RQ=0.909菌体生长RQ=1菌体维持RQ=4青霉素生产,八、泡沫的形成及控制,泡沫的危害：泡沫的持久存在影响着微生物对氧的吸收；妨碍二氧化碳的排除，因而破坏其生理代谢的正常进行，不利于发酵；致使培养液的容量一般只能等于种子罐容量的一半左右，大大影响了设备的利用率，甚至发生跑料，招致染菌，造成巨大损失。泡沫多会从轴封溢出，容易造成染菌。降低了发酵罐的装料系数。严重时停搅拌，影响正常的发酵过程。,产生泡沫的原因:通气和机械搅拌使液体分散和空气窜入，形成气泡；培养基中某些成分的变化或微生物的代谢活动产生气泡；培养基中某些成分(如蛋白质及其他胶体物质)的分子，在气泡表面排列形成坚固的薄膜。因此，气泡不易破裂，聚成泡沫层。玉米浆花生饼粉黄豆饼粉通气搅拌的强烈程度种子和接种量染菌,1、机械消泡,泡沫的消除,靠机械强烈振动和压力的变化，促使气泡破裂，或借助机械力将排出气体中的液体加以分离回收，达到消泡作用。优点：不需再发酵液中加入其它物质，减少了由于加入消泡剂所引起的染菌机会和对后继分离工艺的影响。缺点：效果不如化学消泡迅速、可靠、不能根本上消除引起稳定泡沫的因素，同时它还需要设备和消耗动力。,机械消泡分类,罐内消泡和罐外消泡罐内消泡：耙式消泡桨、旋转圆板式、气流吸入式、冲击反射板式、碟式及超声波式等罐外消泡：旋转叶片式、喷雾式、离心式及转向板式等,2、化学法消泡,发酵工业常用的消泡剂有各种天然的动植物油及来自石油化工生产的矿物油、改性油、表面活性剂等。新型的有机硅聚合物如硅油、硅树脂等，则具有效率高、用量省、无毒性、无代谢性，同时兼有提高微生物合成酶等多种优良特性，是一类有发展前途的消泡剂。泡沫的控制除了添加消泡剂外，改进培养基成分也是相辅相成的一个重要方面。,化学消泡剂应具备以下特点：必须是表面活性剂，具有较低的表面张力，消泡作用迅速有效；具有一定的亲水性，使消泡剂对气液界面的分散系数足够大，从而迅速发挥消泡活性；在水中的溶解度必须小，以保持持久地消泡或抑泡性能；对人、畜及微生物无毒；不影响氧在发酵液中的溶解和传递；来源方便、广泛、价格便宜；,常见的消泡剂:天然油脂:玉米油,米糠油,豆油,棉子油.聚醚类,高级醇,脂肪酸,.,九、染菌分析及控制,（一）染菌原因分析,归结起来是：设备、管道、阀门漏损、灭菌不彻底；空气净化不好；无菌操作不严或菌种不纯等。,染菌的原因,1、种子带菌或怀疑种子带菌9.64%2、罐压跌零造成染菌0.19%3、培养基未彻底灭菌0.79%4、空气系统带菌19.96%5、泡沫冒顶0.48%6、夹层穿孔12.36%7、其它管道穿孔5.89%8、接种管穿孔0.59%9、阀门泄漏1.54%10、搅拌轴密封泄漏2.09%11、罐基漏1.54%12、其它设备漏10.13%13、操作问题10.15%14、原因不祥20.91%,某发酵厂染菌现象的统计分析,1、种子带菌或怀疑种子带菌10%2、培养基未彻底灭菌1%3、空气系统带菌20%4、操作问题10%5、设备问题40%6、原因不祥20%,染菌规模：大批发酵罐染菌、部分发酵罐染菌、个别发酵罐染菌染菌时间：早期、中后期染菌种类：芽孢杆菌、小球菌、霉菌、酵母菌、水生细菌,（二）防止染菌的措施,主要是加强管理：1、培养基的无菌试验2、种子的无菌试验3、设备的定期检查、维修4、严格、规范的操作,（三）染菌后的挽救措施,1、种子罐染菌：倒罐，从其它未染菌的罐移种。2、发酵罐早期染菌：调酸以抑制杂菌生长；加入药物抑制杂菌生长；培养基重新灭菌，转入发酵旺盛的发酵液。3、发酵罐后期染菌：根据情况，提前放罐。,（四）噬菌体污染与防治,噬菌体在自然界广泛存在，噬菌体污染轻则减产，重则倒罐，长时间停产。,1、发酵前期菌丝量不上升或回落2、