生物化学-核酸的生物合成.ppt

,生物化学,第十二章核酸的生物合成,掌握DNA的半保留复及DNA复制的起点与方向掌握原核细胞DNA的复制熟悉真核生物DNA复制特点掌握反转录作用及DNA损伤的修复了解细菌的限制修饰系统,第十二章核酸的生物合成,【目的与要求】,1964-1970发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录,1953年，Watson和Crick提出中心法则：遗传信息的单向流动。,中心法则：,RNA的复制存在于RNA病毒,DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。,第十二章核酸的生物合成,1964-1970发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录,1953年，Watson和Crick提出中心法则：遗传信息的单向流动。,中心法则：,RNA的复制存在于RNA病毒,第十二章核酸的生物合成,中心法则图示,一、DNA的半保留复制,2.半保留复制的实验证据:,1.定义：,1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。,以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。,第十二章核酸的生物合成,DNA复制的可能方式,全保留与全新复制,分散复制,半保留复制,DNA半保留复制图示：,半保留复制的证明：,Meselson和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。,第十二章核酸的生物合成,复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图,DNA的半保留复制的生物学意义：,DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。,DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。,第十二章核酸的生物合成,双向复制,单向复制,二、DNA复制的起点与方向,复制中的DNA,复制原点,复制叉,第十二章核酸的生物合成,DNA复制的主要方式,大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制）,真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制）,第十二章核酸的生物合成,DNA复制的主要方式,不同位置D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步）,单向滚环式复制（噬菌体X174DNA单链环状）,第十二章核酸的生物合成,三、原核细胞DNA的复制(DNA指导下的DNA合成),原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链，也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。3-OH.,DNA聚合酶：该酶的催化性质如下：,第十二章核酸的生物合成,原核细胞DNA的复制(DNA指导下的DNA合成),需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含3-OH.合成方向：53,DNA聚合酶：该酶的催化性质如下：,第十二章核酸的生物合成,（1）53聚合酶功能（但持续合成DNA的能力差）；（2）35外切酶活性（对双链无作用，在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，校对功能。）；,1、DNA聚合酶:1956年Kornberg首先从大肠杆菌中分离。该酶为单体酶,含一个锌原子。为多功能酶，具有:,第十二章核酸的生物合成,（3）还具有53外切酶活性（双链有效）；,DNA聚合酶:1956年Kornberg首先从大肠杆菌中分离。该酶为单体酶,含一个锌原子。为多功能酶，具有:,该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成酶活性，只是对DNA损伤的修复能力下降，容易导致变异和死亡。推测该酶主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其缺口的填补。,第十二章核酸的生物合成,ArthurKornberg1918,StanfordUniversityStanford,CA,USA,TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959,fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid,第十二章核酸的生物合成,2、DNA聚合酶和DNA聚合酶：,DNA聚合酶:多亚基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶高；持续合成DNA的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成能力，推测该酶仍然不是真正的DNA聚合酶。该酶具有35外切酶活性。其功能可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。,第十二章核酸的生物合成,DNA聚合酶:多亚基酶，含十种亚基:（），其中（）称为核心酶，2称为夹子，（2）组成复合物，其主要功能是帮助亚基夹住DNA，故称为夹子装配器，该酶DNA合成的持续能力强，主要与该结构有关。另外，该酶合成速度大，活性高，缺失时大肠杆菌因DNA复制抑制而致死。因此认为该酶DNA的真正复制酶。,第十二章核酸的生物合成,DNA聚合酶的异二聚体,前导链的合成,滞后链的合成,DNA聚合酶的-钳子俯视图,DNA双螺旋,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,第十二章核酸的生物合成,3、双链DNA复制的分子机制,前导链,滞后链,冈崎片段,前导链：以35方向的亲代链为模板连续合成的子代链。,滞后链：以53方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。,(1)冈崎片段和半不连续复制,同位素实验，用含3H的dT标记用T4噬菌体感染的大肠杆菌短时间内分离的DNA均为DNA小片段一段时间后检测到DNA大片段。当用DNA连接酶的缺失的变异株时，检测到大量DNA片段的积累。证明DNA复制中有小片段合成。,1968日本学者冈崎：,第十二章核酸的生物合成,冈崎片段和半不连续复制,测定DNA小片段，远远大于合成DNA的一半。似乎两条链都是不连续合成的，后发现是由于U替代dT渗入DNA中，而被尿嘧啶-N-糖基酶切除所致。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中，DNA的U不再被切除，则检测到一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中。,1968日本学者冈崎：,第十二章核酸的生物合成,(2)冈崎片段的RNA引物,DNA复制时不仅需要四种dNTP前体，还需要一个与模板DNA碱基顺序互补的RNA短片（约10bp）段当作引物。RNA引物的合成称引发，由引物体完成。引物体由引物合成酶和另外几种蛋白质共同组成。它可以沿模板链向分叉的方向前进，并断断续续地引发生成后随链的引物RNA短链,第十二章核酸的生物合成,引物合成酶与引发前体,引物合成酶：催化引物RNA的生成,引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n、n和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。,第十二章核酸的生物合成,引发体可以沿模板链53方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。移动和引发均需要ATP提供能量，n蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。,引物合成酶与引发前体,第十二章核酸的生物合成,(3)DNA连接酶：连接DNA双链中的单链切口,作用特点：,大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能连接双链DNA上的粘性切口，而且能连接无粘性末端的平头双链DNA。,DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。,第十二章核酸的生物合成,(4)母本DNA双链的分离,拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶。,第十二章核酸的生物合成,拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。,拓扑异构酶：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。,两类拓扑异构酶作用特点:,二者共同控制DNA的拓扑结构。,第十二章核酸的生物合成,解螺旋酶（解链酶）,通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。,稳定DNA解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。,单链结合蛋白：,第十二章核酸的生物合成,(5).DNA复制的精确性（高保真复制）,DNA复制必须具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/1091/1010，即每1091010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制100010000次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：,第十二章核酸的生物合成,1、碱基的配对规律：模板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/1041/105。2、DNA聚合酶的35外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低1001000倍。3、DNA的损伤修复系统。,第十二章核酸的生物合成,与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中),第十二章核酸的生物合成,参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图,小结:DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）,复制的终止：,复制的起始起始复合物的形成：称为引发RNA引物的合成,链的延伸：,第十二章核酸的生物合成,复制原点oriC和原点的识别：,DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用oriC(或o）表示。大肠杆菌的复制原点oriC由245个bp构成，含两组保守的重复序列：三个13bp的序列（富含A、T的序列）和四个9bp的序列；许多生物的复制原点也都是富含A、T的区段。,复制原点oriC和原点的识别：,从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子（基因组独立进行复制的单位）。,复制原点由DnaA蛋白识别，在原点由DnaB蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链(DNA双链的解开还需DNA拓扑异构酶、SSB),在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。,复制起始,1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、DnaA蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白（HU、ATP参与下,DanA蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。4、DnaB借助于水解ATP产生的能量在DnaC的帮助下沿53方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（DnaG蛋白）开始合成RNA引物。,链的延长（冈崎片段的合成）,真核生物的冈崎片段为：100-200bp原核生物的冈崎片段为：1000-2000bp,DNA链的延伸,在DNA聚合酶的催化下，以四种5-脱氧核苷三磷酸为底物，在RNA引物的3端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行前导链和滞后链的合成。两条链方向相反。,冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:,前导链和滞后链的合成（DNA聚合酶的异二聚体催化）,复制的终止,顺时针终止陷阱,逆时针终止陷阱,Ter:终止陷阱，引起复制终止的特定区域，20bp的序列，终止利用物质Tus可识别并结合，从而导致DNA复制的终止。,大肠杆菌DNA复制的终止,四、真核生物DNA复制的特点,1、真核生物染色体有多个复制起点，称为自主复制序列（ARS）或复制基因(replicator);多复制眼，呈双向复制，多复制子。,2、冈崎片段长约100-200bp。,第十二章核酸的生物合成,4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核生物染色体DNA复制中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点使总体复制速度比原核生物更快。,3、真核生物DNA复制速度比原核慢，速度为10003000bp/min(仅为原核生物的1/201/50）。,第十二章核酸的生物合成,真核DNA复制特点,5、真核生物线性染色体两端有端粒结构，它是由许多成串的重短复序列组成，端粒功能是稳定染色体末段结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链5-末段在消除RNA引物后造成的空缺，使染色体保持一定长度。端粒酶是含一段RNA的逆转录酶.,第十二章核酸的生物合成,7、RPA：真核生物的单链结合蛋白；RNaseH1和MF-1切除RNA引物，DNA聚合酶填补缺口。,6、真核生物有多种DNA聚合酶,DNA聚合酶（）是真正的复制酶，在PCNA存在下有持续的合成能力。PCNA称为增殖细胞核抗原，相当于大肠杆菌DNA聚合酶的-夹子，RFC蛋白相当于夹子装配器。,第十二章核酸的生物合成,真核细胞内有五种DNA聚合酶,第十二章核酸的生物合成,五、反转录作用（reversetranscription）,1970年Temin等和Baltimore分别从劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分离出逆转录酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆转录酶。,定义:以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA的过程称为逆转录，由逆转录酶催化进行。,第十二章核酸的生物合成,用特异抑制物（放线菌素D）能抑制致癌RNA病毒的复制，而对一般RNA病毒的复制无影响。已知放线菌素D专门抑制以DNA为模板的反应，可见致癌RNA病毒的复制过程必然涉及到DNA。所以Temin于1964年提出前病毒的假说。,第十二章核酸的生物合成,以前病毒形式整合到宿主细胞DNA中而使细胞恶性转化单链病毒RNARNA-DNA杂交分子双链DNA（前病毒）,逆转录酶也和DNA聚合酶一样，沿53方向合成DNA，底物为四种dNTP,并要求短链RNA作引物。,致癌RNA病毒的逆转录过程,第十二章核酸的生物合成,核糖核酸酶H的活性，专一水解RNA-DNA杂交分子中的RNA，可沿53方向起核酸外切酶的作用；无校对功能，错误率高，易产生变异。,第十二章核酸的生物合成,逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性：,RNA指导的DNA聚合酶活性；,DNA指导的DNA聚合酶活性；,逆转录病毒的生活史,cDNA：反义DNA几乎所有真核生物mRNA分子的3末端都有一段polyA,当加入寡聚dT作为引物时，mRNA就可作为模板，在逆转录酶催化下在体外合成与该mRNA互补的DNA，称为cDNA。,逆转录酶发现的理论与实践意义：,第十二章核酸的生物合成,1983年,发现人类免疫缺陷病毒(humanimmunedeficiencevirus,HIV),感染T淋巴细胞后即杀死细胞,造成宿主机体免疫系统损伤,引起艾滋病(acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS)，该病毒为逆转录病毒。,第十二章核酸的生物合成,不能把“中心法则”绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到DNA。促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。,因发现逆转录病毒的遗传物质而获1975年诺贝尔奖的三位科学家,六、DNA损伤的修复,DNA在复制时产生错配，病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，都可能使DNA的结构及功能发生改变。从而引起生物突变，甚至导致死亡。,DNA的损伤与DNA突变：,第十二章核酸的生物合成,DNA突变：DNA的核苷酸顺序永久性的改变称为DNA的突变。其主要形式有：1.点突变：DNA分子中一个碱基对替代另一个碱基对称为点的突变。2.插入作用：DNA分子中插入一个或几个碱基称为插入作用。3.缺失作用：DNA分子中缺失一个或多个碱基对称为缺失作用。,第十二章核酸的生物合成,DNA突变可能导致肿瘤的发生:,沉默突变：突变影响非必需的DNA或突变对一个基因的功能的影响可忽略，称为沉默突变。,回复突变：一些突变可以克服第一次突变造成的影响，这类突变称为回复突变。,动物细胞的突变与癌的发生有强烈的相关性。,第十二章核酸的生物合成,着色性干皮病：对嘧啶二聚体和大的DNA损伤修复酶的缺失而产生的一种皮肤癌。,通常生物体DNA的损伤有一系列的修复机制，如：错配修复、碱基的切除修复、核苷酸的切割修复、直接修复、重组修复等。,第十二章核酸的生物合成,DNA损伤的修复机制:,1、参与错配修复的酶与蛋白质Dam甲基化酶;MutH、MutL、MutS蛋白;解螺旋酶;DNA聚合酶;外切酶、；RecJ核酸酶DNA连接酶；SSB,（一）错配修复,第十二章核酸的生物合成,MutS识别并结合与碱基错配处,MutH-Mut二聚体结合后沿两个方向移动，形成DNA环，直至遭遇半甲基化的CTAG。,MutH在CTAG的5-端切开一个切口，核酸外切酶、沿35方向切除含配错碱基的新链,DNA聚合酶补缺，DNA连接酶连接切口。,高度耗能的错配修复,碱基的切除修复,（1）DNA糖基化酶切除损伤的碱基产生无碱基酸,（2）无碱基核酸内切酶在无碱基酸处切开产生切口。,（3）DNA聚合酶将无碱基酸切除并填补缺口。,（4）DNA连接酶连接切口。,核苷酸的切除修复,DNA解螺旋酶,核苷酸切除修复（2）,光解酶,uvrB、uvrA蛋白