生物技术-基因工程.ppt

1,第八章基因工程,2,重组DNA技术,3,4,5,6,7,基因工程的应用,8,首字母：大写：细菌属名2-3字母：小写：细菌种名如EcoR14:大写:菌株1，2:分离到的次序,第一节、工具酶,一、限制酶（restrictionenzyme）：限制性内切酶,1类：限制和修饰作用*2类：识别DNA内部位点、切割双链3类：同类,根据酶结构、作用及DNA结合和裂解的特性,1、分类,2、命名,9,10,（2）产生平末端(bluntend):,3.酶的识别和切割位点:,通常4-6bp,具有回文结构(palindrom),（1）产生粘性末端(stickingend)5-末端:EcoR1:5-GAATTC-33-CTTAAG-53-末端:Pst1:5-CTGCAG-33-GACGTC-5,Sma1:5-CCCGGG-33-GGGCCC-5,11,5.同尾酶(isoaudamers):识别序列不同,但产生相同的粘性末端BamH1:GGATCCSau3A1:NGATCN,4.同功异源酶(isochizomers):来源不同,识别和切割位点相同如:BamH1和Bst1,12,1、DNA聚合酶大肠杆菌中第一个发现，MW109KD方向：53还具有53及35外切酶活性.缺口平移法标记DNA时常用,二修饰酶,对DNA或RNA末端进行剪切、补平、连接及化学修饰的酶。,13,两类：禽类成骨细胞性白血病病毒逆转录酶（AMV）moloney小鼠白血病病毒逆转录酶（MMLV）方向：53作用：以RNA为模板合成DNA，构建cDNA文库,2、逆转录酶（reversetranscriptase）,将3-OH与5-P连接形成3,5-磷酸二酯键,3、T4DNA连接酶（T4DNAligase）,14,4、碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）,6、TaqDNA聚合酶和其它耐热DNA聚合酶,去除DNAorRNA5-P，制备载体时可防止载体自身连接，提高重组效率。,5、末端脱氧核苷酰转移酶：末端转移酶作用：在DNA的3-OH上，加上dNTP,PCR时,15,内切酶、碱性磷酸酶、连接酶的作用,16,*分类：克隆载体质粒入噬菌体粘性质粒M13噬菌体表达载体大肠杆菌表达载体哺乳动物表达载体,第二节载体,*本质：DNA携带外源DNA进入受体细胞的运载工具。,17,质粒载体大肠杆菌质粒载体PBR322枯草杆菌质粒载体PNC3酵母菌质粒载体农杆菌Ti质粒载体Ti噬菌体载体噬菌体载体Cos噬菌体载体病毒载体SV40病毒载体乳头瘤病毒载体,18,分子量相对较小，在细菌中稳定存在，拷贝指数高。具有遗传标记：如抗生素性基因半乳糖酶基因（LacZ）具有多个酶的单一切点。称多克隆位点（multiplecloningsites,MCS）如PBR322(人工合成)4.3Kb：含AmP(氨卞青霉素)、Tet(四环素)24个单一切点,一常用的克隆载体,1.质粒（plasmid）：,种类很多，但作为克隆载体须具备。,19,PBR322,20,质粒的构建,21,质粒携带外源基因,22,溶菌性（Lytic）：在细菌中连续增殖直到细菌裂时，释放噬菌体。溶原性（Lysogenic）：将其DNA整入细菌中。*只有双链DNA的噬菌体才具有溶原周期。,2.噬菌体：最大容量：923kb,感染细菌的病毒,根据生活周期分,特点双链DNA分子（线性或环形）两端具有12个nt单链互补粘性末端具非必需区（中间区约1/3长度）可在E.Coli中大量繁殖可克隆15Kb左右的外源基因,23,噬菌体的溶原周期和溶菌周期,24,25,插入型载体：外源DNA克隆到分子上，使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即插入失活效应。如：半乳糖酶失活的插入型载体（蓝白筛选）编码,载体类型（两种）,A:载体中含一个LacZ基因半乳糖苷酶X-gal(无色)X(蓝色)+gal(半乳糖)*其中X为有色基因：（4-溴-5-氯吲哚）与gal结合成无色的X-gal,B:在含X-gal的培养基中，在Lac操纵子诱导物IPTG（异丙硫半乳糖苷）作用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，此菌落为蓝色。,26,C.若LacZ基因被外源DNA插入而破坏，则不能制造半乳糖苷酶，菌落为无色（白色）。,27,取代型载体（又叫替换型载体）图8-4基因工程原理P258,在DNA分子的中央，插入一段DNA片段：具有多克隆位点的反向重复序列当外源DNA插入时其可被置换掉作用：提高了克隆外源DNA的能力。,28,*由DNA的Cos区与质粒构建*环状双链DNA特点；含质粒的抗性标记如Amp，Tet带Cos区，可进行体外包装一个或多个酶切位点分子量小，容量大/筛选AP平板,2、粘性质粒（Cosmid）：容量40-50kb,29,30,31,（1）大肠杆菌噬菌体（2）基因组DNA全长6.5kb（单链）（3）感染后，可复制成双链DNA（RF，DNA）（4）当RF100200后，只有（+）链复制4种常用载体的比较P146表82筛选：蓝白筛选,3、M13噬菌体（M13phage）,32,33,在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体。,二.表达载体（expressingvector）,大肠杆菌表达载体除克隆载体的特性外还含有：,表达系统元件启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号,启动子：常用的有trp-lac启动子（ortac启动子）噬菌体Pc启动子T7噬菌体启动子,34,除含有原核序列：在E-Coli中的复制起始点、便于筛选的抗性基因还包括真核表达元件启动子/增强子克隆位点终止信号和加poly（A）信号,哺乳动物表达载体,原核受体E-Coli受体系统外源基因复制、扩增场所链霉菌受体系统外源基因表达场所酵母菌受体系统真核受体动物（哺乳）细胞受体系统一般只作基因表植物/昆虫细胞受体系统达场所,基因工程的受体系统,35,1.特点：遗传背景清楚利于研究繁殖快易获得大量基因产物（20一代）含质粒利于基因转移表达非E-Coli基因，其潜力几乎是无限的,.E-Coli受体系统,2.缺点：高水平表达基因产物易沉淀、凝集、不易折叠基因产物纯化工艺复杂基因产物易受污染（内毒素）基因产物对受体菌有毒害作用基因产物易被水解从安全角度并不理想缺乏基因产物表达后加工机制,36,特点：安全性大遗传信息和生理状况更适合于真核基因表达基因产物外分泌遗传背景较清楚具基因表达后加工机制,二.酵母菌受体系统,37,目的基因的获得载体的选择与制备目的基因与载体的结合（DNA分子的体外连接）重组DNA导入受体重组体筛选和鉴定目的基因表达基因产物的分离纯化,第三节重组DNA技术的基本过程,七步：,38,.目的基因的制备方法：1.内切酶法2.机械力降解3.化学合成4.cDNA合成5.PCR制备法6.从基因文库中提取,1.限制性内切酶法（鸟枪法或散弹法）用酶降解染色体DNA（esp原核生物），将降解的DNA克隆到载体上，从而得到目的基因优点：原理简单，操作简便，具有一定的应用范围。缺点：随机性有限，盲目性大，筛选麻烦，应用范围有限（只适用于原核生物）,39,2、机械降解法,优点：随机性大缺点：所得基因片段不能直接连接，需加工修饰。,用超声波震荡等机械法使DNA断裂。,3.cDNA合成,cDNA文库（Cdnalibrary）：将一个细胞中，所有cDNA都与载体连接成重组DNA，并列入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，称为cDNA文库。,cDNA的获得：图85七年制P149不同细胞，不同细胞状态，得到的cDNA文库不同。,40,4.PCR（polymerasechainreaction）,3、化学合成法,a.acodeDNA化学合成nt,5.从基因文库中提取,基因文库（genomiclibrary）：因限制性内切酶将基因组DNA切成片段，每一段与一个载体连接成重组DNA，并引入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，称基因文库。,41,1.粘性末端连接5末端连接（易）3末端连接（难）,二.载体的选择和制备,分离纯化,三.DNA分子的体外连接,（外源DNA与载体连接）P与OH形成二酯键,T4连接酶：载体经酶切后，易自身环化，形成自身载体。处理方法之一：碱性磷酸酶处理5P,42,2、利用人工接头（linker）连接,带有限制性内切酶切点的一段人工DNA片段,43,3、加入同聚体尾连接：,TdT末端加尾的原理,44,45,4.平端连接所用ATP及T4DNA连接酶的浓度比，粘性末端连接要高些（大于2.5倍）,46,转化程序：感受态细胞+质粒DNA42、90sec不含抗生素的培养基热休克37涂布选择性平板37得到细胞的克隆30-60min（合适抗生素）10hr（使质粒扩增）,四、将重组DNA导入宿主细胞,1.转化（transformayion）将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞的过程。,宿主：大肠杆菌感受态细胞（CompetentCell）：E-coli经Cacl2处理（0-5），使细胞膜通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力。,47,DNAE-coli转染动、植物病毒DNA动植物细胞（transfection）噬菌体颗粒E-coli感染病毒颗粒动、植物细胞,2.感染（infection）：也称转导（transduction）,由噬菌体或病毒介导外源DNA进入宿主细胞的过程,有一个：体外包装过程,48,（1）遗传学方法（2）免疫学方法（3）核酸杂交法（4）PCR技术（5）酶切鉴定,1.遗传学方法筛选转化菌：含抗性基因的质粒，转化后，细菌在含这种抗生素的培养基中培养，未被转化的细菌即被杀死，能生长的，就是一转化的。,五、重组体的筛选,49,50,51,A：当M13感染空载宿主后，产生完整的LacZ产物。-半乳糖苷酶XgalX（兰色）+gal（无外源DNA）B：当M13插入了外源DNA后，其LacZ基因被破坏，不能与宿主细胞中LacZ的互补，产生LacZ产物。XgalX（兰色）（含外源DNA重组克隆）C：蓝白筛选：,筛选带有重组体的克隆,插入失活法（insertioninactivation）鉴别：质粒重组体和非重组体适用于：具有两个或两个以上抗生素性标记的质粒。,-互补（-complementation）,M13噬菌体（插入了一段LacZ基因）宿主（删除了一段LacZ基因Lac-,52,2免疫学方法原理：以目的基因在受体细胞中的表达产物作为Ag，免疫动物制备Ab，通过Ag、Ab反应，将带目的基因的克隆筛选出来。方法：放免、化学方法、显色反应等。,53,3.核酸杂交法从基因文库、cDNA文库或重组反应质粒中筛选目的基因。将含有外源DNA的细菌生长在琼脂板上将NC膜或尼龙膜覆盖平板表面NaOH处理膜32P-DNA杂交或RNAX线曝光放射自显影阳性斑点,54,4.PCR技术5、酶切鉴定,55,第四节真核细胞转染,一.基本方法和原理,1.磷酸钙共沉淀法（Calciumphosphateco-pecipitation）,外源DNA或重组质粒DNA与磷酸钙混合，形成微小颗粒，沉积在细胞表面，被宿主细胞摄取。,2.电穿孔法（electroporation）,外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔杯中，在高频电流作用下，细胞膜出现许多小孔，外源DNA进入宿主细胞。,56,3、DEAE葡聚糖（DEAEDextran）法,（带正点荷）,经细胞内吞作用吸入细胞短暂表达,外源DNA（带负电荷）,4、脂质体(liposome)介导基因导入,阳离子脂质体（膜成分）DNA负电荷,与细胞膜溶合外源DNA被释放到胞浆短暂表达,57,5、显微注射法（microinjection）,将外源基因通过毛细玻璃管，再显微镜下注释到受精卵的细胞核内的方法。,58,tktk转入