纳米级生物分子测量的新方法和新技术.ppt

纳米级生物分子测量的新方法和新技术,肖忠党国家教育部分子与生物分子电子学重点实验室东南大学，吴健雄实验室东南大学，生物科学与医学工程系杭州2003.9.13,主要内容,生物分子测量的常规手段,生物分子测量技术的发展,生物单分子测量的新技术,存在的问题及展望,X射线衍射中子衍射法,分子晶体,核磁共振法园二色谱法荧光光谱法喇曼光谱法小角散射,溶液状态生物分子,生物分子空间结构测量,生物分子测量的常规手段,生物分子空间结构测量,各种显微镜技术,荧光显微镜,激光共聚焦显微镜,电子显微镜,扫描探针显微镜,近场光学显微镜,生物分子动力学测量,核磁共振法园二色谱法荧光光谱法喇曼光谱法小角散射,快速混合停流谱（MixingStopped-flowSpectroscopy）时间分辨波谱等等,慢反应过程（分钟级）,快反应过程（毫秒级）（如蛋白质折叠）,常规生物分子测量技术的局限性,有限的时间分辨率,分子测量结果为很多分子的平均,有限的空间分辨,生物分子测量技术的发展,1、第三代同步辐射波谱技术,光束线出口在CCD探测器上成像的单色光斑,蛋白晶体衍射图样,同步辐射光具有高亮度、高度单色、高度准直，高稳定性，以及宽波谱等优点，同步辐射波谱具有更高的灵敏度和良好的空间分辨率,中科大国家同步辐射实验室第二代同步辐射,北京高能所同步辐射装置第一代同步辐射,2、超快混合连续流动谱技术,Comparisonofexperimentalmethodsfordetectionoffastproteinfoldingreactionsandtheiraccessibletime-scales,BieriO.,KiefhaberT.,Biol.Chem.380(1999)923,温度跃变只适用于肽类和极少数在合适温区发生冷变形的蛋白质分子,光化学触发需要给蛋白质分子结合上特殊的光敏基团,NMR迟豫以及压力跃变方法只适合分子折叠的转变态,为什么选择超快混合连续流谱技术？,1）超快混合技术是一种通用的手段2）应用超快混合连续流谱技术可以在非常接近蛋白质分子天然状态的情形下研究其折叠过程,BieriO.,KiefhaberT.,Biol.Chem.380(1999)923,连续流动超快混合反应光谱仪结果图,Figure3Deadtimecalibrationofthemixer.(a)PlotofthefluorescencequenchingreactionofNATAbyNBSatdifferentfinalNBSconcentration.NATAfinal=20m.(b)Thesolidlineisafittotheplotofthepseudo-first-orderrateconstantsasafunctionofNBSconcentration.Thisyieldsthesecond-orderrateconstantsfortheNATA-NBSreactionof6.8X10-5M-1S-1.,超快混合连续流谱技术研究免疫球蛋白Im7的折叠中间体,Im7是由53个氨基酸组成的免疫球蛋白分子，具有四个螺旋结构。已经证明其折叠只有一个中间态，但是其折叠途径可能有两个模型。,Figure4.FluorescencechangesduringthefoldingofIm7.Dataonthemicrosecondtime-scalewereacquiredusinganovelmicrocapillarycontinuous-flowrapidmixingdeviceequippedwithaUVsensitiveCCDcamera(builtbyShastryandRoder).Thesedatawerethennormalisedandcombinedwithstopped-flowdataonamillisecondtimescaletocovertheentiretime-courseofIm7folding.Thecombineddataatawiderangeofureaconcentrations(tworepresentativeconcentrationsareshownaslabelled)werethenfittedsimultaneouslytoavarietyofthree-statekineticmodels.Theblacklinesshowthetime-coursepredictedfromthebestfittoanon-pathwaymodel(seetext).Theredlinesshowthetime-coursepredictedfromthebestfittotheoff-pathwaymodel.,正在继续和计划的研究课题,验证其他免疫球蛋白的折叠特性,研究序列的改变对免疫球蛋白折叠的影响,改进微型混合器及检测系统进一步提高灵敏度和降低死时间,3、单分子技术,为什么要研究生物单分子？,单个生物分子行为更可能反应生命的本质现象,现有的系综研究方法不能揭示生物分子的个体行为,生物单分子研究的技术支持,扫描探针显微镜技术（原子力显微镜）,近场光学技术,光镊技术,操纵,检测力性质,表面形貌,特异性,生物单分子测量的新技术,光镊技术,利用激光光束的梯度压力,扫描探针显微镜技术（原子力显微镜）,近场光学技术,生物单分子的研究方法举例,霍乱毒素(80nm),“Y”型IgG抗体分子(250nm),鲁米诺分子叠放在膀胱上皮细胞表面(16nm),原子力显微镜直接获得生物单分子的空间结构,近场光学显微镜探测双色标记的单个DNA分子,HaT.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93(1996)6264,全内反射荧光显微镜直接观察到活细胞表面标记的单个分子移动,UedaM,etal.,Science,294(2001)864,BustamanteC.,BryantZ.,SmithS.B.,Nature,421(2003)423,光钳技术研究DNA单分子的力学性质,光钳技术研究单个Titin蛋白分子的折叠/去折叠转换,KellermayerM.,SmithS.B,etal,Science,276(1997)1112,AFM研究单个多聚糖链的弹性,RiefM,etal.,Science275(1997)1295,AFM研究单个视紫红质去折叠途径,OesterheltF.etal.,Science288(2000)143,AFM研究单个DNA分子解链和复链过程,AlbrechtC.,etal.,Science301(2003)367,KrauthauerR.,NanoLett.,3(2003)493,结合荧光共振能量传递技术研究单个生物分子行为,WeissS.Science,283(1999)1676,生物单分子研究存在的关键问题,空间分辨率低,对单个生物分子的操控不成熟,空间分辨率低,100m,血红细胞,核小体与DNA,DNA片断与RNA聚合酶分子的转录识别,染色体,我们的工作和设想,（1）高分辨AFM针尖,LieberC.M.,et.al,Nature,398(1998)761,LieberC.M.,et.al,J.Am.Chem.Soc.,120(1998)603,型淀粉纤维,IgM分子,一个设想：纳米管针尖,Ajayan,P.M，Chem.Rev.，99（1999）1787,现有制备纳米管AFM针尖方法的缺点,由于无法控制生长点的位置及大小，生长方向也随机，因此制备的纳米管针尖容易是复壁型，更容易形成多针尖，所以制备效率很低,提高AFM的分辨率,减少连接到针尖上的数目,（2）单分子AFM针尖,目标：真正意义上控制生物单分子研究,思路与方案,ChiMingYam,ZhongdangXiao,JiahuaGu,SabineBoutet,andChengzhiCai,J.Am.Chem.Soc.,125(2003)7498,ChiMingYam,ZhongdangXiao,JiahuaGu,SabineBoutet,andChengzhiCai,J.Am.Chem.Soc.,125(2003)7498,定点活化方法选择,ZhongdangXiao,ChiMingYam,SabineBoutet,ChengzhiCai“ActivationofSelectiveAreaontheTopofAtomicForceMicroscopyProbe”,J.Am.Chem.Soc.,submitted.,初步实验结果已显示此方法可有效地控制活化尺寸小至几个纳米,几个构想,AFM操纵生物单分子与荧