神经生物学常用形态学研究方法-桂林医学院[病理学]精品课.ppt

神经生物学常用形态学研究方法,组织材料的处理,1.固定(fixation)目的：防止组织自溶，保护组织免受微生物侵袭，保存组织成份不被破坏丢失，维持组织结构使之正确的反应生活状态。固定剂：4%多聚甲醛（常用）方法：浸泡固定，灌注固定2.切片(section)：石蜡切片，冰冻切片,一、一般染色方法,（一）尼氏染色方法(Nisslstaining)：1.定义：是用碱性染料染神经组织的一种方法，神经组织中可与碱性染料结合的主要成份是核酸，神经元胞体中有大量核糖核酸，主要以尼氏小体的形式存在。细胞核中染色质少，故染色浅，但有明显的核仁。神经胶质细胞的核中染色质较多，着色较深，但胞浆不着色。电镜下尼氏小体是许多规则平行排列并相互够通的粗面内质网以及其间的游离核糖体组成。,焦油紫（cresylviolet）硫堇（thionine）甲苯胺蓝(toluidineblue),2.用于尼氏染色的常用染料有：,石蜡切片或冰冻切片0.1%焦油紫染液375-10min烝馏水洗70%Alc3min95%Alc3min100%Alc1min3次二甲苯5min2次封片。结果:尼氏小体紫色，本底无色。,焦油紫染色法:,DLG,DRG,Cresylvioletstaining,Thioninestaining,Cresylvioletstaining,高尔基技术(Golgitechnique),TheGolgi(andrelated)methodsworkbystainingtissuewithsilvernitratewhichisthenreducedtosilver.Thisproducesuniformdarkcoloringofthewholeneuron.Themorphologyofdendritesandaxoncanbestudiedindetail.,Cerebellumcortexneuron,利用轴浆运输现象追踪神经元之间联系的一种方法。示踪剂：HRP（horseradishperoxidase，辣根过氧化物酶），快蓝（fastblue），荧光金（fluorogold），核黄（nuclearyellow），神经生物素（neurobiotin），生物素化葡聚糖胺（biotinylateddextranamine,BDA）,神经束路示踪,1，HRP的引入：压力注射法，电泳法，缓释法2，Survialtime：（束路长度毫米/350毫米）+1日3，FixationandSection4，IncubationProcedure:a,washsectionsbrieflyinthreechangesofPBb,movethesectionstotheincubatingmedium(0.2%DAB,1%H2O2)keptatroomtemperaturefor30-40min.c,washthreetimesinPBforstopthereaction.d,mountingandobservation.,HRPTracingExperiment,HRPlabellingneuronsinoculomotornucleusofcat,10,40,HRPlabellingneuronsindLGN,40,Double-labellingofHRPandGlutamateinratlateralgeniculatenucleus,荧光染料示踪法,1，荧光染料的配制：2，荧光染料的注射：3，动物存活期：一般存活2-4天。4，灌注固定、取材、冰冻切片。5，贴片后荧光显微镜观察：荧光容易褪色，贴片后应立即观察。,Fastbluelabellingneurons,DRG,Spinalcord,20,20,FastBlueLadellingGanglionCellsofRetina,20,NO(nitricoxide)的生物合成：催化NO生物合成的酶称一氧化氮合酶（NOsynthase,NOS),NOS以L-精氨酸（L-arg)和分子氧为底物，消耗1.5molNADPH和2mol分子氧生成NO和L-瓜氨酸。NADPH:nicotinamideadenindinucleotidephosphateDiaphorase:黄递酶在神经系统大部分区域NADPH-d组织化学染色和NOS免疫组织化学染色一致。,NADPH-diaphorase组织化学染色法,Nos活性：a.协同因子有Ca2+、CaM、NADPH阻断任何一个协同因子结合位点都可抑制Nosb.底物:L-ArgNADPH-d活性:a:不需CaM、Ca2+作为协同因子，只需NADPHb；底物：NBT(亚硝基四唑氮蓝）,NOS与NADPH-d活性的比较,NOS活性NADPH-d活性,使用NOS抑制剂后不能用NADPH-d组化染色来分析NOS活性。NADPH-d组化染色阳性细胞中可含有NOS,但不能说明有NOS活性，NADPH-d组化染色阴性细胞中一般不含NOS.,a:冰冻切片b:0.05MTris缓冲液漂洗c:于含0.2%Tritonox-100的Tris缓冲液中室温下预孵育510min.d:在含0.3%Tritonx-100,1mg/mlNADPH,0.5mg/mlNBT的Tris缓冲液中37孵育11.5小时.e:Tris缓冲液漂洗，中止反应。,NADPH-d组化染色,NADPH-dStainingInCaudateNucleus,40,NADPH-dstaining,nNOS-ir,40,40,NADPH-dstaining,nNOS-ir,40,40,利用特异性抗体对神经组织中某种特异成份(抗原)进行抗原-抗体反应,达到检测组织细胞内是否有此特异性物质.其本质就是用标记的抗体追踪抗原(以确定组织细胞内的某种化学物质).,免疫组织化学(Immunohistochemistry),应用与评价,应用：a.用已知抗体探测未知抗原：受体、酶、递质、肽类、细胞骨架蛋白等。b.示踪:示踪物抗体与示踪物反应。c.用已知抗原探测未知抗体。d.原位杂交的后续部分。结果评价:有阳性产物，说明细胞内有此物质，但是否由此细胞产生不能完全肯定。定量:阳性细胞数、灰度值或光密度值。,1.Tissuuepreparation:perfusion,section2.Blocking:封闭，异种蛋白质间会有非特异性结合，常用正常羊血清（NGS）或牛血清白蛋白（BSA）封闭。3.Incubateinprimaryantibody:最佳浓度需摸索，为提高抗体向组织内穿透，可在抗体稀释液中加入0.1%0.3%TritonX-100。需长时间孵育时应加入0.01%0.3%NaN3防腐。产生一抗的动物一定要知道，以便选择二抗。,Immunohistochemicalprocedures,4,Washing:去掉非特异性结合5,Incubateinsecondantibody:浓度1/100200,二抗必须针对一抗动物种属，二抗上结合的物质不同，显色用不同方法：ABC，PAP，荧光显色，IGSS。ABC，PAP经典、产物稳定，荧光法不需三抗，不需脱水透明。但荧光易淬灭。IGSS非常敏感，不用DAB做反应，但背景难以控制。,7，ABC复合物（avidin-biotincomplex)orPAP复合物（peroxidase-anti-peroxidasecomplex)孵育，浓度1:100（或200）。8，ReactwithDAB:DAB能致癌，在强光下可氧化（应尽量避光），68分钟出现阳性产物，镜下控制反应。,对照实验,1.阴性对照：a、NGS或缓冲液代替一抗b、去二抗c、吸附实验：一抗加入后，再加入相应抗原，将抗体与过量的抗原一起孵育一段时间后，此混合液再作免疫组化染色2.阳性对照：,PBS洗片0.5%3%H2O215min(灭活内源性过氧化物酶)PBS洗片5-10%NGS(或510%BSA)+0.2%TritonX-100孵育12h(封闭)一抗4过夜PBS洗片5min3次二抗24h室温PBS洗片5min3次ABC12hPBS洗片10min3次DAB显色,GAP-43-irneuronsinspinalcord,NSgroup,Anti-BDNFgroup,20,20,NeuN-ir,40,S-100-irofsciaticnerve,20,S-100-irofSchwanncells,C-FOS-ir,20,20,Neuronalstemcellspheres,10,Nestin-ir,10,10,Map-2ir,Map-2-ir,40,40,GFAP-ir,40,40,40,40,40,TH-ir,ChAT-ir,GAD-ir,GABAAR-ir,NF200-irofsciaticnerve,Brdu-irofretia,10,10,GFAP-ir,P75-ir,40X,40X,原位杂交(INSITUHYBRIDIZATION),原位核酸分子杂交技术（Insitunucleicacidmolecularhybridization)简称原位杂交技术。是用标记的NDA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内待定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交。,基本原理,碱基互补配对原则待测mRNA:探针(probe):digoxin-AGTCTAGT-+-UCAGAUCA-一定温度、时间与条件-AGTCTAGT-UCAGAUCA-+digoxin抗体digoxin碱性磷酸酶-AGTCTAGT-UCAGAUCA-碱性磷酸酶digoxindigoxin抗体+NBT显色,探针的类型,1.cDNAprobe：杂交反应有较高的专一性。因其为双链结构，需加热变性解链。解链后只有半数DNA链与特定的mRNA杂交，另一半DNA链则与mRNA竞争，并导致DNA链的自我“退火”（既重新形成双链）。2.mRNAprobe（互补的RNA）：为单链结构，杂交反应专一性高，杂交链稳定，制备复杂。3.Oligonucleotideprobe:由DNA合成仪合成，制备简单，由于链不长，又是单链，较易穿过组织，操作方便，但杂交链因其链短而不够稳定。,ProceduresofInSituHybridization,1.Preparationoftissue:a.组织取材：尽可能新鲜，由于组织RNA降解较快，新鲜组织和培养细胞最好在本30min内固定。取材时应戴手套，防止外源性RNA污染。b.固定：4%多聚甲醛，灌注固定时固定剂的用量一般为动物体重的2倍，浸泡固定时，组织与固定剂的体积比不低于己于1:10。C.切片：冰冻切片或石蜡切片。,2.prehybridizationtreatment,增强组织的通透性和探针的穿透性：a.稀酸和酸酐(0.2NHCL,0.25%aceticanhybdride)处理：防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合。b.去污剂(0.010.3%TritonX-100)处理：增强组织的通透性，利于探针进入组织细胞。c.蛋白酶(proteinaseK)处理:消化包围靶核酸的蛋白质，使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探针对靶核酸的可及性。,Prehybridization,杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育一定时间，以阻断标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到降低背景的目的。为防止外源性RNA酶污染，杂交前处理过程中都需要戴消毒手套，实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一天置高温（180）烘烤，杂交前及杂交时所用的溶液均需经高温消毒处理。,Hybridization,1.cDNA探针需变性解链：95100，510min，探针变性后要马上进行杂交反应。2.杂交液：除含一定量的标记探针外，还含有较高浓度的盐类（高度Na+可使杂交率增加，减低探针与标本之间的静电结合）；甲酰胺（可使杂交温度降低）；硫酸葡聚糖（能与水结合，减少杂交液的有效容积，提高探针有效浓度）；BSA、载体DNA与RNA（变性鲱鱼精DNA、酵母转运RNA）（阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，减低背景）。,杂交温度：,当杂交液含50%甲酰胺，盐浓度为0.75mol左右时,cDNA探针杂交温度约为42,mRNA探针为5055,寡核苷酸探针约为37杂交时间:一般为1620h,杂交反应时间不要超过24h,反应时间过长,形成的杂交体会自动解链,杂交信号反而减弱,杂交后处理:,系列不同浓度、不同温度的盐溶液的漂洗，除去未参与杂交的过剩的探针，除去探针与组织标本之间的非特异性结合。杂交体的检测：非放射性核酸杂交，可用酶检测系显色（同免疫组织化学）,原为杂交的对照,阳性对照1、已知阳性组织对照2、Northern或Southern印迹反应3、免疫组织化学阴性对照1、已知阴性组织2、正义RNA(SenseRNA)探针3、省去探针4、杂交前用RNA酶或DNA酶处理标本5、检测系统的阴性对照,GAP-43mRNApositiveneuroninspinalcord10,NSgroup,Anti-BDNFgroup,Theexpressionofsynapsin1mRNAinthespinalcordanteriorhorn,40,SynaptoptophysinmRNApositiveneuronsinhippocampus,10,C-retmRNApositiveneur