罗丹明和香豆素衍生物的合成及光谱性能的研究_硕士学位论文（pdf格式可编辑）.pdf

， _ 4 r 硕f4 学位论史 摘要 近年来，罗丹明和香豆素作为常用的染料，其独特的光化学光物理性质引 起了人们的广泛关注。罗丹明类物质作为荧光团，以其水溶性好，激发波长长， 生物毒性低等优点，越来越多的应用于生物实验中。香豆素类化合物更是一种 具有优异的光学性能荧光染料，既可以单独用作发光染料，也可以被当做能量 转移的供体。 在本实验室以往的研究中，我们相继设计并合成了很多罗丹明衍生物用作 生物体内的探针。但是以往的工作中我们并没有将一系列罗丹明衍生物染料的 发光性能做系统的比较。因而，在此基础上，我们继续合成了一系列各类罗丹 明衍生物的染料，并进行了光谱性能的比较和研究。同时，利用香豆素的各种 性质，设计并合成了香豆素喹啉用作C 0 2 + 和N i 2 + 的开启型探针。最后连接罗丹 明和香豆素结构，通过) P E T 机理，设计合成了F e ”离子探针。 本论文研究目的是希望了解各类香豆素以及罗丹明衍生物的光谱性质，并 利用其光谱性质来设计合成更好的探针。其中香豆素喹啉探针是一个难得的 N i 2 + 和C 0 2 + 的荧光增强型探针的例子。而罗丹明香豆素探针，作为第一个以荧 光共振能量转移为基础的F e ”的比值型荧光探针，具有很低的检测下限，在很 微量的F e ”的存在下，就可以使5 7 5n m 处的荧光显著增强，而4 2 0n m 位置的 荧光发射微弱增强。加入F e ”离子后，位于5 7 5 和4 6 5n m 的发射强度比值从 0 0 1 4 一直增加到1 0 5 ，相当于7 5 倍的提高。这些良好的离子探针可以作为一 种重要的化学工具去研究荧光离子探针在各种生物中的反应。 关键词：罗丹明；香豆素；合成；荧光；染料；探针 I I - 一 罗丹明和香豆索衍生物的合成及光谱十牛能的研究 A b s t r a c t I nr e c e n ty e a r s ，a saC o m m o n l yu s e dd y e s ，t h er h o d a m i n e sa n dc o u m a r i n s h a v ea t t r a c t e di n t e n s ea t t e n t i o no fi t s u n i q u ep h o t o p h y s i c a lp r o p e r t i e s A s f l u o r e s c e n tg r o u p s ，r h o d a m i n e sm o r ea n dm o r eu s e di nb i o l o g i c a le x p e r i m e n t s ， w i t hi t s g o o d w a t e rs o l u b i l i t y , t h ee x c i t a t i o n w a v e l e n g t hl o n g ，n o n - t o x i c i t y a d v a n t a g e s ，m o r ea n dm o r eu s e di nb i o l o g i c a le x p e r i m e n t s I na d d i t i o n ，c o u m a r i n s a r ea l s oe x c e l l e n to p t i c a lp e r f o r m a n c ef l u o r e s c e n td y e s ，t h e ya r eo f t e nu s e da sa s e p a r a t el i g h t - e m i t t i n gd y e sc a na l s ob eu s e da se n e r g yt r a n s f e rd o n o r P r e v i o u ss t u d i e si nt h i s l a b o r a t o r y ，w eh a v ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e da n u m b e ro fr h o d a m i n ed e r i v a t i v e su s e da sp r o b e s H o w e v e r ，i no u rp a s tw o r k ，w e d i dn o t s t u d y a l lt h er h o d a m i n e sd e r i v a t i v e sd y eo fas e r i e s l i g h t e m i t t i n g p r o p e r t i e so fl i g h tt om a k eas p e c i f i cc o m p a r i s o na ss y s t e m s T h u s ，o nt h i sb a s i s ， w ec o n t i n u eas y n t h e t i cd e r i v a t i v e so fv a r i o u sr h o d a m i n ed y e s ，a n dt oc o m p a r et h e s p e c t r a lp r o p e r t i e s a n dr e s e a r c h M e a n w h i l e ，w eu s ec o u m a r i ni nv a r i o u s p r o p e r t i e s ，d e s i g na n ds y n t h e s i so fc o u m a r i nJ a c q u e l i n ao fC 0 2 + a n dN i 2 + s e n s o r A tl a s t ，w et a k ec o u m a r i na sad o n o ra n dr h o d a m i n ea st h ec h r o m o p h o r ed e s i g n a n ds y n t h e s i so ft h eF e 3 + i o np r o b e T h i st h e s i sa i m st ou n d e r s t a n dt h et y p e so fc o u m a r i na n ds p e c t r a lp r o p e r t i e s o fr h o d a m i n ed e r i v a t i v e sa n dt h en a t u r eo fi t ss p e c t r u mt od e s i g na n ds y n t h e s i z ea b e t t e rs e n s o r A tf i r s t ，w ep r o v i d e dar a r ee x a m p l eo fat u r n o nf l u o r e s c e n c e c h e m o s e n s o rf o rp a r a m a g n e t i cN i 2 + a n dC 0 2 + T h e nw et a k eR h o d a m i n e c o u m a r i n d e v e l o p e da st h ef i r s tr a t i o m e t r i cf l u o r e s c e n ts e n s o rf o rF e + b a s e do nr e g u l a t i o n o fF R E T T h i sc o m p o u n dw a sr e a d i l ys y n t h e s i z e di no n es t e p T h es e n s o rd i s p l a y s as i g n i f i c a n tf l u o r e s c e n te m i s s i o ne n h a n c e m e n ta t5 7 5a mw i t has l i g h tf l u o r e s c e n t e m i s s i o ni n c r e a s ea t4 2 0a mi nt h ep r e s e n c eo fF e ”T h er a t i oo fe m i s s i o n i n t e n s i t i e sa t5 7 5 a n d 4 6 5a m ( 1 5 7 5 1 4 6 5 ) v a r i e df r o m0 0 14t o1 0 5 ，c o r r e s p o n d i n g t oa7 5 一f o l de n h a n c e m e n tu p o nF e ”t r e a t m e n t T h e s eh i g h l yf a v o r a b l ei o np r o b e s c a nb eu s e da sa ni m p o r t a n tt o o lt os t u d yi nv a r i o u so r g a n i s m s K e yW o r d s ：R h o d a m i n e ；C o u m a r i n ；S y n t h e s i s ；L u m i n e s c e n c e ；D y e s ， - 硕I ：学位论文 目录 学位论文原创性声明与学位论文版权使用授权书I 摘要I I A b s t r a c t I I I 第1 章绪论1 1 1 荧光1 1 1 1 荧光发光机理l 1 1 2 荧光参数2 1 1 3 几种类型探针的基本原理3 1 2 香豆素类化合物6 1 2 1 香豆素及其衍生物在荧光探针方面的用途7 1 2 2 香豆素类化合物的合成方法一9 1 3 罗丹明类化合物1 0 1 3 1 罗丹明类化合物的光学性质1 1 1 3 2 常见的罗丹明类化合物合成及应用1 2 1 4 本课题研究的目的以及工作内容1 5 第2 章罗丹明类化合物的合成及光谱性能研究1 7 2 1 仪器与试剂17 2 1 1 仪器1 7 2 1 2 试剂1 8 2 2 实验部分18 2 2 1 溶剂处理18 2 2 2 一系列罗丹明类衍生物的合成1 8 2 2 3罗丹明香豆素F e ”探针的合成2 5 2 3 合成结果与讨论2 9 2 3 1 目标罗丹明类化合物的合成及结构表征2 9 2 4 罗丹明类化合物的光谱性能研究3 0 2 4 1 仪器与试剂3 0 2 4 2 实验部分3 0 2 5 小结4 6 第3 章香豆素喹啉荧光探针的合成及光谱性能研究4 7 3 1 仪器与试剂4 7 一 罗丹忉和香再素衍生物的合成及光谱件能的研究 3 2 1 仪器4 7 3 2 2 试剂4 8 3 2 香豆素喹啉荧光探针的合成4 8 3 2 1 甲氧基香豆素的合成4 9 3 2 2 香豆素喹啉荧光探针的合成4 9 3 2 3 合成分析5 0 3 3 香豆素喹啉荧光探针的光谱性能研究5 0 3 4 小结5 7 结论5 8 参考文献5 9 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录6 4 附录B 合成化合物一览图6 5 附录C 部分化合物的谱图6 7 致谢7 4 V 硕f ：学位论艾 第1 章绪论 荧光，是指一种光致发光现象。当荧光物质在受到能量如光、电和化学能等 激发后，会释放出当电子从基态跃迁到激发态然后回到基态的能量称为荧光。荧 光分子探针一般由荧光团通过连接基与受体相连接而成，常用的荧光团涉及香豆 素类【1 ，2 1 、罗丹明类3 ，4 1 荧光素类【5 ，6 】等化合物。 其中，香豆素类化合物是一种具有优异的光学性能的荧光染料，它们可以单 独作为荧光团分子，也可以做为能量转移的供体。罗丹明类化合物具有发光波长 长，环内电子流动性好，环平面易修饰等优点，是作为荧光团的优质染料。因而 以香豆素类，罗丹明类荧光团为基础的的传感器，在仿生化学、光电化学、分析 化学、医药卫生等领域都具有十分广阔的应用前景，正吸引着人们对它不断深入 地研究。 1 1荧光 1 1 1 荧光发光机理 荧光是一种光致发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光照射，U V 吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光； 而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。即当荧光物质在受到能量如光、 电和化学等激发后，释放出当电子从基态跃迁到激发态然后回到基态的能量称为 荧光。 如图1 1 ，通常情况下，荧光试剂分子处于基态S O ，U V 吸收光后，试剂分子 的电子被激发而处于激发态S 1 或S 2 ，基态和激发态都有单重态和三重态两种类 型。根据不同的性质，电子跃迁大致可以分为两类，第一类，是有着光子放出的 辐射跃迁，这类包括荧光和磷光两个过程；第二类，是非辐射跃迁，它没有光子 放出，能量是以其它形式耗散，包括内转换、热、系之间的跃迁等【7 1 。分子中的 电子从基态到跃迁到激发态比较容易发生，进行很快，约为l0 4 秒，而从基态单 重态到激发态三重态不易发生。荧光过程是指基态电子通过光、电和化学U V 吸 收得到能量到达激发态，当分子从激发态通过发光释放能量并回到基态的过程。 高能量的单重态激发态分子可以与其他同类分子或溶剂分子碰撞通过内转换回到 激发态的最低能级，这一过程为1 0 。1 2 S ，处于激发态最低能级的分子寿命一般为 1 0 4 $ 1 0 培s ，它们会放出光子然后返回基态，这时产生的光就是荧光。磷光过程 则是指从三线态通过发光回到基态的过程。从T l 回到S 0 有两种过程，一个是系 罗丹明御香豆素衍生物的合成及光谱性能的研究 间跨越，无能量释放；另一个是放出光子，即磷光，在1 0 - 4 s l O s 间完成。另外还 有一种特殊的荧光，它是因为某些第一激发单重态与第一激发三重态能级接近的 分子跃迁到三重态后，又被热激发到单重激发态而发射荧光，这种荧光被称为延 迟荧光。延迟荧光虽然与正常荧光有着相同的光谱结构，但是它的寿命很长，速 率非常小。这是它由于经历了三个过程：首先是单重态到三重态，然后是热激发， 最后三重态到单重态。最后，大多数的荧光化合物分子在激发后的衰变过程中主 要通过辐射衰变释放出光子而回复到基态，当然也有少数不会。 E S 图1 1 荧光原理图 T 1 T 2 具有共轭结构的分子内电荷转移荧光化合物目前成为研究得最为广泛和活跃 的一类化合物之一，由于这类化合物7 【电子的流动性更好，在光照时容易发生分 子整体的激发，从而引起分子内的电荷转移，电子密度重新分布8 1 。 1 1 2 荧光参数 1 1 2 1 斯托克斯位移 斯托克斯位移( S t o k e ss h i f t ) 且O 最大荧光发射波长和最大激发波长之差。它是用 来衡量发射光与激发光能量差值大小的物理量。电子从激发态回落至基态，都是 从能量最低的激发态回到基态。因为荧光物质的荧光发射波长总是大于激发波长， 所以荧光与激发光之间存在一定的能量差别。这种现象是斯托克斯18 5 2 年首次观 察到的，因而被称为斯托克斯位移。 厂一征0 I硕| J 学化论文 1 1 2 2 激发光谱 激发光谱( e x c i t a t i o ns p e c t r u m ) ，就是反应一个物质接收到激发光之后的情况， 反映出该物质对于外来激发光的响应。激发光谱的形状与测量时选择的发射波长 无关，但其相对强度与所选择的发射波长相关。 在激发光谱中，横坐标的波长是指激发光的波长，激发光谱是反映某物质在 不同波长光激发下的发光情况的，纵坐标值越高，说明发光越强，能量也越高。 仪器经光谱校正后，则激发光谱的形状与U V 吸收光谱的形状相似。 1 1 2 3 荧光量子产率 荧光量子产率( ) 是衡量化合物的发光能力的一个重要的参数，也是研究弛豫 过程和光化学历程的重要参数，是指激发态分子中通过发射荧光而回到基态的分 子占全部激发态分子的分数。量子产率取决于辐射和非辐射跃迁过程，即荧光发 射、系间跨越、外转移和内转移等的相对速率。当物质在一定温度下，是分子 结构的函数，但这种函数关系非常复杂，目前只能靠实验方法测定，它是荧光发射 光子数与被物质U V 吸收的光子数之比【9 1 。 1 1 2 4 总荧光量 使用该物质的发射光谱的面积来表示荧光的量，而不是用某一波长的荧光强 度来表示物质发射的荧光的强弱。这样的方法表示出来的荧光的量称之为总荧光 量。 1 1 2 5 荧光寿命 当去掉外界激发光后，分子的荧光强度降到激发时最大荧光强度的e 1 ，所 需要的时间，称为荧光寿命T 。在荧光物质的分子受外界光激发后，振动能级的 电子跃迁到高能态，当处于第一单线态电子激发态最低落至基态并发射出荧光， 平均寿命为l O 培秒。 1 1 3 几种类型探针的基本原理 1 1 3 1P E T 光致电子转移 P E T ( p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ) 这种类型的探针已被广泛地研究。当荧光 团分子团上连接电子供体时，在一定程度上可以控制荧光的发射及淬灭( 如图 1 2 ) 。当该荧光分子所连接的供体的最高占据轨道( H O M O ) 提供电子给荧光分 子本身的H O M O 时，使得本身应由自己的最低空轨道( L U M O ) 激发电子迁移到 分子的H O M O 过程受阻，造成该荧光分子团的荧光猝灭。经阳离子结合后，氧化 还原电位提高，使供体的H O M O 能量比荧光分子团的H O M O 能量低，因此，供 罗丹明和香豆素衍生物的合成及光嘴性能的研究 体将不能再给荧光团提供电子，P E T 不再发生，荧光不再被猝灭。换句话说，荧 光强度增强后阳离子具有更强的约束力。 U 删。十 u 嗍。 斗H 。帕H 渊o Z r w w L U M O H O 豫O 卜嗍。 图1 2P E T 机理图 在大部分的P E T 传感器中，受体如脂肪族、芳香族的胺可以产生猝灭作用。 事实上，人们早就发现，可以用聚酯氨基连接到芳香族碳氢化合物结构上，来产 生P E T 效应，导致荧光猝灭。 多数开关型荧光探针都属于这种情况，另外有一些P E T 机制可以采取过渡金 属离子来进行【lo ，1 1 】。事实上，由于不同金属离子的氧化还原活性不同，荧光分子 团的电子还可以转移到结合的金属离子，反之亦然。在某些情况下，电子交流是 可能的，由非辐射能量转移荧光猝灭的结果根据D e x t e r 机制产生的。 1 1 3 2I C T 分子内电子转移 I C T ( I n t r a m o l e c u l a re l e c t r o nt r a n s f e r ) 分子内电子转移，是指荧光分子团包 含一个电子供体时，当这个电子供体结合到一个吸电子基团时，它经历了分子内 电荷转移后，供体提供给受体电子的能力降低。在一个斯托克斯的微环境的变化 中，这个荧光的变化就取决于偶极矩变化的结果；极性探针就己在此基础上设计 【1 2 】。由此可见，阳离子与供体之间的相互作用，会改变受体基团荧光的光物理性 质，这是因为与共体结合的阳离子影响了分子内电荷转移效率【1 3 。15 1 。 当一个像氨基这样的基团，在与阳离子的交互作用时，降低了荧光电子供体 的供电子性能，这就直接导致共轭程度的减少。共轭程度的减少，就直接造成U V 吸收光谱蓝移和消光系数下降。相反，阳离子与受体相互作用增强了集团在本组 拉电子性质；因此U V 吸收光谱红移和摩尔吸光系数增加。荧光光谱移动的原则同 U V 吸收光谱转移的原则相同。除了这些变化，在量子产率和寿命的变化往往是 在观察中得到的，没有一定的规律。所有这些光物理性质的变化明显取决于电荷 的阳离子强度和大小。 经阳离子结合的光物理变化也可用偶极矩的相互作用来描述【1 6 】。在只考虑偶 硕I 学化论文 极矩的情况下时，激发态的偶极矩大于基态。然后，当阳离子与供体基团相结合 时，激发态的活动变得更加强烈，从而比基态离子不稳定。因此，发射和激发光 谱均产生蓝移( 但是大多数情况下荧光光谱只是一个轻微的蓝移，这是个重要的 实验现象将由下面讨论) 。相反，当阳离子与受体基团，激发态比基态的离子更 稳定，这导致了U V 吸收和发射光谱的红移( 图1 3 ) 。 h v 团 供电子能力减弱 团 荧光光谱发生蓝移 供电子能力增强 受体 荧光光谱发生红移 图1 3I C T 机理图 1 1 3 3F R E T 荧光共振能量转移 荧光共振能量转移( F o r s t e rr e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ) 是指两个荧光发色基团 在足够靠近时，当供体分子U V 吸收一定频率的光子后，而被激发到更高的电子 能态，在该电子回到基态前，通过偶极子的相互作用，实现了能量向邻近的受体 分子转移。F R E T 是一种非辐射能量跃迁，是通过分子间电偶极相互作用，将供 体激发态能量转移到受体激发态的一个过程，使供体荧光强度降低，而受体可以 发射更强于本身的特征荧光，又称敏化荧光，也可以不发荧光，也称荧光猝灭， 同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与 受体的U V 吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受 体之间的距离等因素都有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足 以下条件：其一是供体受体的激发光要分的足够开：其二是供体的激发光谱与受 体的激发光谱要重叠。 罗丹明和吞豆索衍生物的合成及光谱性能的研究 荧光共振能量转移【是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团( 供体 D o n o r ) 的发射光谱与另一个基团( 受体A c c e p t o r ) 的U V 吸收光谱有一定的重 叠，当这两个荧光基团间的距离合适时( 一般小于10n m ) ，就可观察到荧光能 量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一 个基团发射的荧光。( 图1 4 ) 简单地说，就是在供体基团的激发状态下，由一 对偶极子发出的能量从供体向受体转移的过程。此过程没有光子的参与，所以并 不是辐射传递能量的。如果受体的荧光量子产率为零，则发生能量转移，供体荧 光淬灭；如果受体也是一种荧光发射体，则呈现出接受体的荧光，并造成受体荧 光光谱的增强。 能量供给体一接受体( D A ) 对之间发生有效能量转移的条件是苛刻的，主 要包括：( 1 ) 能量供体的发射光谱与能量受体的U V 吸收光谱两者必须重叠；( 2 ) 能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列：( 3 ) 能量供体、能量受 体之间必须足够接近，这样发生能量转移的几率才会高。此外，对于合适的供体、 受体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能力等方面还有众多的要求。 弋 激发光 口。 荧光分子供体 1 0n l i l 荧光分子受体 - - - - - - - - - - I 卜 1 2 香豆素类化合物 F R E T 、 图1 4F R E T 原理【1 7 l 香豆素( 见图1 5 ) 又名邻羟基肉桂酸内酯，或1 ，2 - 苯并吡喃酮或氧杂萘邻酮， 是广泛存在于自然界中的一种内酯类化合物，是香豆素类荧光增白剂的基本结构。 它最早是用酒精从黑香豆中提取得到的18 1 。它具有抗艾滋、增强免疫、抗肿瘤等 生理活性；并且通过香豆素环上不同位置的取代修饰，可以得到具有不同范围的 硕I ：学位论文 U V 吸收和荧光发射波长，从而显示出不同颜色和具有较强荧光的衍生物。1 8 6 8 年， P e r k i n 用水杨醛与醋酐在无水醋酸钠下缩合，首次人工合成了香豆素【1 9 ，20 1 。香豆 素以葡萄糖苷的形式广泛存在于自然界中，这种糖苷化合物能在酸性、酶或紫外 光照射下分解，产生新鲜甘草气味。因此，香豆素在烟草香精和同化香精中占有 很重要的地位，可作为食品香料调味剂。此外，香豆素还可在工业上用作橡胶塑 料制品的除臭剂和电镀工业的光亮剂2 。香豆素有许多天然衍生物，还有许多合 成衍生物，它们的用途相当广泛。 ；q X 8 l 。 图1 5 香豆素 1 2 1 香豆素及其衍生物在荧光探针方面的用途 香豆素环各位置上取代基的性质对香豆素类化合物的功能影响很大，3 位和 7 位上取代基的作用尤为明显。香豆素类荧光团为苯并吡喃酮结构，具有荧光量 子产率高，光稳定性好，光物理、光化学性质可调和S t o k e s 位移大等优点，是荧 光探针分子设计中的优秀荧光团。对香豆素化合物结构与荧光性能关系的研究表 明，7 位供电基和3 及4 位吸电基性质的变化，可造成香豆素化合物产生从红色 到蓝绿色的蓝移2 2 埘】。各种荧光性能可通过香豆素母体上吸供电子基团的修饰来 实现，通过基团的修饰，来获取我们所需要的香豆素荧光探针。香豆素荧光探针 在阳离子、阴离子和中性分子的识别检测都已经有前人做过大量的研究。下面简 单的介绍几种香豆素的阳离子探针。 1 2 1 1L i + 荧光探针 B l a c k b u r n 等【2 5 1 合成出选择识别L i + 的化合物( 图1 6 ) ，该化合物与L i 络合 后引起荧光量子产率提高并伴有荧光光谱蓝移。其中甲氧基的作用为限制了N 芳基键的旋转，从而减弱了激发态非幅射失活的倾向，也增强了L i + 络合物的稳 定性。 弋 O 图1 6 香豆素L i + 荧光探针 罗J 明和香豆素衍生物的合成及光谱降能的研究 1 2 1 2M 9 2 + 荧光探针 B r u n e t 等【2 6 】设计合成了7 二乙氨基3 ( 3 ，4 亚乙二氧基苯酰) 香豆素。该化合 物仅与第二主族金属离子中的M 9 2 + 络合，并能引起4 6n m 的U V 吸收光谱红移。 由于该化合物的两个羰基与M 9 2 + 结合后，加强了I C T 作用，从而使得结合后光谱 发生红移( 图1 7 ) 。而由于M 9 2 + 在离子半径、电荷密度方面比其它金属离子对体 系存在更好的匹配性，因而该探针对M 9 2 + 有着单一的选择性。 三 一M 9 2 + 图1 7 香豆素M 9 2 + 荧光探针1 及结合机理 而S u z u k i 等合成的香豆素荧光探针【2 7 】M 9 2 + 荧光探针则是在香豆素的3 位连 接乙酰氧甲基而得到如图1 8 的化合物。它可以与M 9 2 + 形成l ：l 的络合物，并 使得U V 吸收光谱红移2 0n m ，荧光光谱红移1 0n m 。它们对M 9 2 + 有很高的选择 性，是市场销售的M g ”荧光探针选择性的2 0 0 多倍。将它们在P C I 2 活细胞中进 行M 9 2 + 荧光成像，结果表明M 9 2 + 主要分布在细胞质部分而不是细胞核部分。 O cA O - J L 图1 8 香豆素M 矿+ 荧光探针2 1 2 1 3H 9 2 + 荧光探针 2 0 0 6 年，Q i a n 小组【2 8 】报道了新型比率H 9 2 + 荧光探针，它是在香豆素的6 ，7 位连接四酰胺而合成出来的，是标准的I C T 机理荧光探针( 图1 9 ) 。在此H g 升 荧光探针中形成了以苯胺两个富电子N 原子为电子供体而羰基和苯并噻唑为电子 受体的I C T 体系。在4 0 当量的H 9 2 + 存在时，可使荧光光谱从5 6 7a m 蓝移至4 7 5 a m ，荧光直接由橙色变为蓝绿色，而1 5 6 7 1 4 7 5 ，更是明显从1 1 9 变化至O 4 之多。 在筛选的金属离子中，只有H 9 2 十在中性缓冲水溶液中可调节其荧光性质。其离子 结合机理是两个去质子酰胺的N 原子和邻苯二胺的两个N 原子与H 9 2 + 形成了四 面体配位，而另两个未络合的酰胺臂则产生了空间位阻限制其自由旋转( 图1 9 ) 。 8 硕 ：学位论文 H 图1 9 香豆素H 9 2 + 荧光探针 H 1 2 1 3F e ”+ 探针 M L a d 6 n k a 等【2 9 1 合成了一系列可以对F e 3 + 或F e 2 + 产生螯合作用的香豆素( 图 1 10 ) 。在研究中，他们利用天然提取以及化学合成的方法，得到了一系列4 甲基 香豆素的衍生物，进而分析他们和铁离子的螯合性能，并与标准铁螯合剂去铁胺 ( D E F ) 进行比较。该铁螯合活动是一个根据光度法简单的检测亚铁离子的方法。 这种检测方法也弥补了D E F 螯合检测铁离子的p H 局限性。 B O H O R C H 3 C C 0 0 A 2 ：R = C H 2 C O O C 2 H s C 1 ：R 2 H A 3 ：R = C H 2 C H 2 C O O C 2 H 5 C 2 ：R 2 C H 2 C O O C 2 H 5 图1 1 0 香豆素F e n + 探针 1 2 2 香豆素类化合物的合成方法 香豆素类化合物是最早发现的具有荧光性质的物质之一，目前这类化合物的 主要合成方法有很多种，现将主要的两种合成方法综述如下： 1 2 2 1P e r k i n 反应 香豆素的经典合成方法是用水杨醛、乙酸酐和乙酸钠作原料，通过P e r k i n 反 应来合成【2 5 ，2 6 】( 见式1 1 ) 。 一。C H H O 一岫垆警q 又m ， 该法一直是工业上生产香豆素的主要方法。长期以来，人们对这一方法进行 了很多研究与改进，如调整反应条件和反应物的配料比，使香豆素的收率由原来 罗丹明和香豆素衍生物的合成及光谱r 丰能的研究 的2 6 逐渐提高到近8 0 i 2 7 1 。P e r k i n 法的催化体系还有钯配合物、氟化钾、聚乙 二醇( P E G ) 、硒、冠醚、无水碳酸钠、无水碳酸钾等催化剂2 8 - 3 3 1 。 1 2 2 2P e c h m a n n 反应 由于一些取代水杨醛的合成比较困难，比如4 位羟基香豆素，它就是香豆素 衍生物中应用最广泛的一种，利用P e r k i n 反应来合成就容易受到限制。而 P e c h m a n n 反应法是制备4 位取代香豆素最常用的方法。其最基本的反应，就是在 浓硫酸的催化下，苯酚与羟基丁二酸( 苹果酸) 、顺丁烯二酸( 马来酸) 或反丁烯二酸 ( 富马酸) 等反应，都可生成香豆素3 4 1 ( 式1 2 ) 。 9 7 。删一g 入 n 2 ， P e c h m a n n 反应还是合成4 取代香豆素的重要方法【3 5 1 。其中邻羟基苯乙酮法 因合成步骤少、污染小、生产工艺简单，具有很好的工业化前景( 式1 3 ) 。 R 9 明 ( 1 3 ) 利用此反应，在无水A 1 C 1 3 催化下，间氨基酚与a 甲酰基苯乙睛缩合反应也 可得到7 氨基3 苯基香豆素( 香豆素1 0 ) 3 6 】( 式14 ) 。 掣瓜 1 3 罗丹明类化合物 C H OA I C l l - - - - - P h N 0 2 H 2 N ( 1 4 ) 罗丹明类试剂属吡喃型碱性试剂，这类试剂均为红紫色粉末，又称为玫瑰红 染料，易溶于水，水溶液呈鲜红色并发出强烈荧光。其基本分子结构如下图所示。 图1 6 罗丹明 硕f ：学化论丈 罗丹明类化合物是以氧杂葸为母体的碱性染料，由于其特殊的结构及相应的 荧光特性，使罗丹明类荧光染料成为化学和生物分析领域中研究较为广泛。 常见的罗丹明有罗丹明B 、罗丹明6 G 和罗丹明1 2 3 等。( 见图1 7 ) H 2 N R h o d a m i n e1 2 3 图1 7 罗丹明B ，罗丹明6 G 和罗丹明1 2 3 由于其出色的耐光性和光物理性能，罗丹明被用作激光染料【3 7 , 3 8 】，荧光量子 产率标准物和荧光偏振标准物【3 9 , 4 0 1 。罗丹明类染料的荧光探针，可以表征聚合物 纳米粒子，脂质膜流动性【4 1 椰】，以及表面在聚合物的生物4 4 1 。其对乳液的研究寡 核苷酸吸附检澳l J l 4 5 , 4 6 1 ，研究了胶束的结构和动力学，以及在活生物细胞内的单分 子成像技术 4 7 , 4 9 】。 罗丹明衍生物也经常作为分子开关的温度探测计或化学探针【5 0 , 5 3 】，特别是化 学探针的使用，可以检测体内的H g ( I I ) ，C u ( 1 I ) ，F e ( I I I ) ，C r ( 1 I I ) ，硫醇等。 G o n c a l v e s 回顾了使用有机生物分子的荧光标记探针，强调了在这些应用中的罗丹 明衍生物的重要性【”J 。 大部分的罗丹明染料中，必须连接到另一分子( 聚合物，寡核苷酸，生物分 子等) 或表面才可以作为探针来使用。为了获得这些罗丹明偶联物，通常是在4 或5 位( 图1 6 ) 进行亲和取代反应，形成罗丹明衍生物。缩合反应是合成罗丹 明染料的方法，必须使用以前进行试剂的活化。另一种办法是对便宜无其他官能 团的罗丹明类化合物进行修饰。在此，我们将对罗丹明染料的合成路径选择的原 因进行讨论。另外为了了解罗丹明类化合物的应用，对罗丹明染料光谱性质的简 介也将包括在内。 1 3 1 罗丹明类化合物的光学性质 根据不同的取代基的R 1 ，R 2 ，R 3 ，R 4 位，甚至在G 位和X 位( 通常是C l ， B r 或C 1 0 4 。) ( 图1 6 ) ，将赋予罗丹明染料在溶液中不同的光物理性质，如U V 吸 收和发射的最大值( 最大绝对值，最大时间，最大荧光寿命和荧光量子产率等) ， 都会产生一定的变化。 罗丹明类染料中苯环间有“氧桥相联，具有刚性平面结构，容易U V 吸收入射 光的能量而发射长波，从而产生荧光。在罗丹明类化合物的光物理性能的差别主要 是由内部转换非辐射失活造成的。内部转换有活性基团和非活性基团【55 1 。在独立 罗丹 仆J 和吞霞素衍生物的合成及光【 鲁件能的研究 的温度下，罗丹明染料在存在氮烷基( 只有一烷基取代的衍生物，通常选择烷基 作为R 4 ) 或氨基酸基团的时候，这些染料的量子产率非常高。反之，量子产量和 荧光寿都会随温度的变化而发生改变。光谱激发的过程似乎是由于分子内电荷转 移( I C T ) 引起的，电子由氨基转移到氧杂葸环而产生的【5 引。I C T 的状态通常是 高能的第一激发单重态启动过程的荧光基团与活性和能量较低的基团之间内部转 换的。非激发态的过程包括由C H 健和N H 健的高耗能溶剂频率振动耦合模式的 损耗。其中N H 的振动模式，在羟基溶剂中具有很大的电子能量损耗。罗丹明 1 0 1 和罗丹明B 是其中罗丹明类化合物中最常见的，而且它们与p H 值和溶剂极 性之间有着非常有趣的关系。 在酸性溶液中，罗丹明染料被羧基质子化为阳离子是一般存在形式。然而， 解离发生使得罗丹明染料转换成两性离子。虽然阳离子和两性离子发光形式相同， 但其中一个负电荷的氧杂葸基团的中央碳原子的诱导效应，导致了双方的U V 吸 收光谱最大值和荧光光谱最大值略有减少而且产生蓝移。在特定的染料溶剂中相 互作用时产生的差异还可以解释阳离子和两性离子形式，荧光量子效率和荧光寿 命的细微差异。在低极性有机溶剂中，一个以两性离子染料无色内酯由于中断共 轭而产生荧光。因此，罗丹明内酯U V 吸收发生在紫外光谱区的荧光量子产率和 寿命都非常低。它本身具有醌式结构，能产生颜色，被氧化时，其醌式结构遭破坏，染 料溶液颜色变浅甚至变为无色，为荧光分析和光度分析奠定了理论基础。 1 3 2 常见的罗丹明类化合物合成及应用 罗丹明的基本骨架主要由带有3 ，6 位取代氨基的氧杂蒽母体和9 位碳原子所 连接的两个芳环片段组成。虽然商业罗丹明衍生物的价格昂贵，但它们还是广泛 应用于生物分子和其他化合物的合成中。但是，当合成的目标染料需要的量较大 时，就会由于价格原因限制染料的合成。以下简单的介绍些罗丹明类化合物的合 成方法。 彭孝军等【5 7 】，应用间二乙胺基苯酚和对羧基苯甲醛的缩合合成了罗丹明B 的 4 位羧基的产物( 图1 8 ) 。该合成方法通过一步缩合和氧化的方法，得到了产品， 其优点是产率较高( 9 0 ) 产品单一。 & 人 ) H 图1 8 合成路线 F e 2 ( S 0 4 ) 3 C 广 萝节 硕f j 学化论文 C o r r i e 等人则采用了完全不同的合成路线，合成出了可用于标记蛋白质的光 不稳定罗丹明衍生物【5 引。修改后的非对称若丹明染料是用三甲基多聚磷酸酯在 D M F 中进行缩合。虽然该反应的产率较高( 约为6 0 ) ，但是反应必须在高温下 进行( 图1 9 ) 。 N 二+ 6 H N I N 足b i m e t h y l s i I y I 八OH p o l y p h o s p h a t e 科n I 宵 N v 八N 入 H 图1 9 合成路线 M e n c h e n 和F u n g 是最先合成和使用罗丹明1 0 1 四甲基罗丹明琥珀酰亚胺衍 生物( T M R ) 的。在这个反应中，首先原作者使用二氮琥珀酰亚胺( D C C ) 和4 二甲氨基吡啶( D M A P ) 在D M F 中反应【5 9 】得到产品。后来，C r u i c k s h a n k 和B i t t n e r 提出用N 羟基琥珀酰亚胺( N H S ) 和N ，N 二异丙基乙胺作为一个以人工合成的 核苷酸。【6 0 】标签紫红质衍生物目标1 1 0 偶联剂( D I P C ) 在第2 步略有变化。 另外，非荧光纯染料可能在应用中出现一些问题。事实上，在有些反应中可 能得到的产品是不同的两个异构体的未知比例，因此，一些最终的结果的测定可 能难以精确重现【6 。比如如下反应，C o r r i e 和C r a i k 提供了一种合成方法，即下 图的反应( 图1 10 ) 。 R 1 吖N D 洲+ O O 图1 1 0 合成路线 应该看到，无论是4 位和5 位的异构体均通过缩合反应获得了。然而，为了 准备更好的纯染料，该异构体混合物需要进行分离纯化。然而，由于这两个阳离 子的罗丹明染料的结构极端相似，因此两个异构体的分离非常繁琐，需要长期和 艰苦的纯化过程。 在图1 10 的第一步反应中，只有使用N 二甲氨基的时候，才能和一苯甲酮 反应而获得产物。根据作者在文中的描述，如果在反应l 步或2 步的任一步骤结 晶分离，则可以纯化出一个同分异构体的纯净产品，( 更方便这两个步骤) 。在经 过脱保护基后，只要使用适当的反应条件，胺的衍生物就可以进一步转化为溴， 氯和碘乙酰胺或酰亚胺衍生物【6 2 1 ，因此此产品的应用十分广泛。 另外一种新的罗丹明染料合成方法是由J a c k s o n 小组提出来的。要使用三氯 氧磷来使罗丹明B 或罗丹明1 0 l 的一个或两个基团反应成为磺酰氯磺酸基团。这 种衍生保护基团为氨基二胺，因而当与相应的试剂反应的时候，便可以获得氨基 酸衍生物。因此，酰卤化物，硫醇，肼，磺酰卤和罗丹明乙二马来酰亚胺衍生物 和罗丹明10 l 都可以用此过程合成。但是，此方法有一个一个很大的缺点：那就 是在第一步中，磺酰氯