（细胞生物学专业论文）il22介导肿瘤细胞mapk通路及细胞增殖.pdf

潘芹：i l - 2 2 介导肿瘤细胞m a p k 通路及细胞增殖一1 i l 2 2 介导肿瘤细胞m a p k 通路及细胞增殖 研究生：潘芹 导师：孟松树 ( 扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州，2 2 5 0 0 9 ) 中文摘要 i l - 2 2 是在以i l - 9 刺激的t 细胞小鼠瘤细胞b w 5 1 4 7 中发现的一种新型细胞 因子，是i l - 1 0 家族中的一名新成员，与i l - 1 0 的氨基酸同源性为2 2 。i l - 2 2 由活性t 细胞( 主要包括t h l 7 和t h l 细胞) 产生，并通过与i l - 2 2 受体蛋白的 结合来发挥其生物学功能。1 1 , - 2 2 受体复合物由两条受体链构成：i l - 2 2 r 1 和 i l - 1 0 r 2 ，它们均属于i i 型的细胞因子受体家族。其中，i l - 2 2 r 1 是i l - 2 2 特异性 结合的蛋白分子，而i l - 1 0 r 2 是i l - 1 0 受体复合物和i l - 2 2 受体复合物间的共用 链。i l - 2 2 与其受体复合物结合后主要通过j a k s t a t 通路转导活化信号。j a k l 、 t v k 2 的活化导致s t a t l 、s t a t 3 、s t a t 5 的酪氨酸残基磷酸化。此外，i l - 2 2 也 可激活3 条主要的m a p k 通路：m e k - e r k 、j n k s a p k 和p 3 8 激酶途径。 i l - 2 2 作为一种新型的细胞因子，在细胞中参与多条信号通路，发挥着多种 生物学功能。虽然i l - 2 2 的多种生物学功能，如参与炎症反应、先天免疫系统的 激活、细胞增殖和分化及基因表达已有报道，但i l - 2 2 在肿瘤细胞中的潜在生物 学效应还未深入研究。因此，本实验主要以人结肠癌细胞株s w 4 8 0 和人肺癌细 胞株a 5 4 9 为研究对象，研究i l - 2 2 介导肿瘤细胞的相关信号通路，为进一步研 究i l - 2 2 与肿瘤发生发展关系等方面提供了理论基础。 方法 1 、w e s t e r n 印迹检测i l - 2 2 对肿瘤细胞中m a p k 通路中相关蛋白e r k l 2 、 s r c ( 4 1 6 ) 、j n k 、p 3 8 及其他信号蛋白s t a t 3 、a k t 等的活化及抑制效果。 2 、免疫共沉淀法检测i l - 2 2 活化m a p k 的过程中g a b l 的磷酸化及其与s h p 2 的结合。 3 、w s t - 1 法观察i l - 2 2 对肿瘤细胞株s w 4 8 0 细胞增殖的影响。 扬州大学硕士学位论文 2 一 结果 1 、i l - 2 2 结合其受体复合物能诱导m a p k 通路中相关蛋白e r k l 2 、s r c ( 4 1 6 ) 、 j n k 、p 3 8 及其他信号蛋白s t a l 3 、a k t 等的活化。 2 、以1 0 0 n g m l 的i l - 2 2 刺激s w 4 8 0 细胞，g a b l 的磷酸化水平显著增强，且s h p 2 也被结合到磷酸化的g a b l 。对s w 4 8 0 细胞的进一步研究结果显示，i l - 2 2 能诱 导i l - 2 2 r 1 的磷酸化，且将s h p 2 招募到磷酸化的i l - 2 2 r 1 上，即s h p 2 与i l - 2 2 r 1 相结合。此结果说明g a b l 及s h p 2 可能参与i l - 2 2 介导的信号转导通路。 3 、i l - 2 2 能刺激s w 4 8 0 细胞增殖，相对细胞增长率为1 5 。 关键字：i l - 2 2 ，m a p k 通路，细胞增殖 潘芹：i l - 2 2 介导肿瘤细胞m a p k 通路及细胞增殖 3 一 m a p k p a t h w a ya c t i v a t e db yi l - - 2 2i ns w 4 8 0 a n da 5 4 9c e l l s c a n d i d a t e ：p a no i n s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o fs o n g s h um e n g a b s t r a c t i l - 2 2i san o v e lc y t o k i n ew h i c hi s p r o d u c e db ya c t i v a t e dm o u s etc e l l c a r c i n o m as t i m u l a t e dw i t hi l - 9 i t san e wm e m b e ro ft h ei l - 1 0f a m i l yb a s e do n s e q u e n c ea n ds t r u c t u r a ls i m i l a r i t i e s ，h a sas i m i l i t yo f2 2 w i t ht h ei l l 0 i l - 2 2i s m a i n l yp r o d u c e db yt w ok i n d so fa c t i v etc e l l ：t h l 7a n dt h lc e l l s i l - 2 2s i g n a l s t h r o u g har e c e p t o rc o m p l e xc o n s i s t i n go fi l - 2 2 r 1a n di l - 1 0 r 2w h i c hb e l o n g i n gt o t h ec l a s si ic y t o k i n er e c e p t o rf a m i l y i l - 2 2 r 1s p e c i a l l yb i n d st oi l - 2 2 ，a n di l - 1 0 r 2 i st h es h a r i n gc h a i no ft h ei l - 1 0r e c e p t o rc o m p l e xa n dt h ei l - 2 2r e c e p t o rc o m p l e x a f t e rb i n d i n go fi l - 2 2a n dr e c e p t o rc o m p l e x ，t h es i g n a l 仃a n s d u c e st h r o u g ht h e j a k s t a tp a t h w a y ，t h e na c t i v e sj a k la n dt y k 2t op h o s p h o r y l a t et h et y r o s i n eo f s t a t l ，s t a l 3 ，s t a t 5 b e s i d e s ，i l - 2 2c a ns t i m u l a t et h r e em a i nm a p kp a t h w a y s ： m e k - e r k , j n k s a p ka n dp 3 8k i n a s ep a t h w a y s i g n a l i n gt r a n s d u c t i o nw a st h eb a s i s o fc o m m u n i c a t i o nb e t w e e nc e l l so fo r g a n i s m s a san e wt y p ec y t o k i n e ，i l - 2 2 i n v o l v e sm a n ys i g n a lp a t h w a y s a l t h o u g hi l - 2 2h a sb e e nr e p o r t e di n v o l v i n gm a n y b i o l o g i c a la c t i v i t i e s ，i n c l u d i n g i n f l a m m a t i o n r e s p o n s e ，i n n a t e i m m u n es y s t e m a c t i v a t i o n ，c e l lp r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n a t i o na n dg e n ee x p r e s s i o n ，i t se f f e c to n c a n c e rc e l l sw a sl e f tu n e x p l o r e du n t i ln o w w ef o u n di l - 2 2p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei n s i g n a lt r a n s d u c t i o no fs w 4 8 0a n da 5 4 9c e l l s ，a n do u rw o r ks h e dl i g h to nt h er e l a t i o n b e t w e e ni lf a m i l ya n dt h ep r o g r e s s i o no ft u m o r m e t h o d s 1 w e s t e r nb l o ta s s a yw a su t i l i z e dt oa n a l y z ea c t i v a t i o no rr e p r e s s i o ns t a t eo fp r e t e i n s o ft h em a p kp a t h w a y ：e r k l 2 、s r c ( 4 1 6 ) 、j n k 、p 3 8a n do t h e rs i g n a l i n g p r e t e i n s ：s t a t 3 、a k ti nt u m o rc e l lt r e a t e dw i t hi l - 2 2 2 i m m u n o p r e c i p i t a t i o na s s a yw a sa p p l i e dt od e t e c tt h ea c t i v a t i o no fg a b la n di t s b i n d i n gw i t hs h p 2i nt h ep r o c e s so ft h a ti l - 2 2a c t i v a t e sm a p kp a t h w a y 扬州大学硕士学位论文 4 3 w s t - 1a s s a yw a su s e dt od e t e c tt h ee f f e c to fi l - 2 2o nc e l lp r o l i f e r a t i o no fs w 4 8 0 c e l l s r e s u l t s 1 i l - 2 2a c t i v a t e st h em a p kp a t h w a y ：e r k l 2 、s r c ( 4 1 6 ) 、j n k 、p 3 8a n do t h e r s i g n a l i n gp r e t e i n s ：s t a q 3 、a k ti ns w 4 8 0 a n da 5 4 9c e l l s 2 i l - 2 2a c t i v a t e st h ep h o s p h o r y l a t i o no fg a b la tt h ec o n c e n t r a t i o no f1 0 0 n g m l ， w h i l es h p 2w a sr e c r u i t e dt og a bl i nr e s p o n s et oi l - 2 2 1 1 _ , - 2 2i n d u c e st y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o no fi l - 2 2 r 1a n ds h p 2b i n d st oi l - 2 2 r 1 t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a t g a b la n ds h p 2m a y b ei n v o l v ei nt h es i g n a lp a t h w a ya c t i v a t e db yi l - 2 2 3 i l - 2 2a l s oi n d u c e sc e l lp r o l i f e r a t i o no fs w 4 8 0c e l l sa n di t sr e l a t i v ep r o l i f e r a t i v e r a t ei s1 5 k e yw o r d s ：i l - 2 2 ，m a p kp a t h w a y , c e l lp r o l i f e r a t i o n 扬州大学硕士学位论文 缩写 a k t b s a d n a d m e m d m s o d n a e c l e d t a e g l a e r k f b s g h g a b l h r p k g i g m j n k k d m 佾p k l m m m l m m w s t 符号说明 英文 p r o t e i nk i n a s eb ( p k a ) b o v i n es e r u ma l b u m i n d e o x y r i b o n u c l e o t i d ea c i d d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i u m d i m e t h y l s u l f o c i d e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d e n h a n c e dc h e m i l u m i n e s c e n o e e t h y l e n e d i a m i n e n ，n ，n ，n - t e t r a a c e t i ca c i d e t h y l e n eg l y c o l - b i s ( 2 一a m i n o e t h y le t h e r ) - n 、n 、 n 、n t e t r a a c e t i ca c i d e x t r a c e l l u l a rs i g n a l - r e g u l a t e dk i n a s e f e t a lb o v i n es e r u m g r a m h o u r g r b 2 一a s s o c i a t e db i n d e r 1 h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e i m m u n o g l o b u l i ng i m m u n o g l o b u l i nm c - j u na m i n o t e r m i n u sk i n a s e 1 【i l o d a l t o n m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e l i t e r m i n u t e m i l l i l i t e r m i l l i m o l e l i t e r 中文 丝苏氨酸激酶 牛血清白蛋白 脱氧核糖核酸 6 一 二甲基亚砜 脱氧核糖核苷酸 增强型化学发光底物 乙二二胺四乙酸 已二醇双( 2 氨乙基醚) 四乙 酸 胞外信号调节激酶 胎牛血清 克 小时 辣根过氧化物酶 免疫球蛋白g 免疫球蛋白m j u n 氨基末端激酶 千道尔顿 丝裂原活化蛋白激酶 升 分钟 毫升 毫摩尔升 ( 2 - ( 4 - 碘苯基) 一3 一( 4 - 硝基苯 基) 一5 - ( 2 ，4 一二磺酸苯基) 2 氢 四唑盐) 潘芹：i l - 2 2 介导肿瘤细胞m a p k 通路及细胞增殖 m h c 咖 n c p b s p i g p m s f p s r p m s s d s s d s p a g e m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x n a n o m e t e r n i t r o c e l l u l o s e p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e h y d r o g e ni o nc o n c e n t r a t i o n p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o f i d p e n i c i l l i n - s t r e p t o m y c i n r o t a t i o np e rm i n u t e s e c o n d 主要组织相容性复合体 纳米 硝酸纤维素 磷酸盐缓冲液生理盐水 氢离子浓度 苯甲基璜酰氟 青链霉素 辕| 食 秒 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e - p o l y a c r y l a m - i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s t h ep r o t o - - o n c o g e n ec - s r c s i g n a lt r a n s d u c e r sa n da c t i v a t o r so ft r a n s c r i p t i o n s t e r i l ew a t e r 1 r r i s b u f f e r e ds a l i n e m i c r o g r a m m i c r o l i t e r v o l t 7 一 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺 凝胶电泳 癌基冈蛋白质c 信号转导和转录活化因子 超纯水 i r i s 缓冲生理盐水 微克 微升 伏特 k 俄 w 璐 g ， 跏 跚 跚 侣 腭 皿 v 潘芹：i l - 2 2 介导肿瘤细胞m a p k 通路及细胞增殖 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的 研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经 发表的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：潘昔 l 签字日期：跏 年6 月f 日 f 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和 借阅。本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授 权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 学位论文作者签名港考 导师签名：乞 签字日期：如7 年1 月i f 日 签字日期：力刁年月，夕日 扬州大学硕士学位论文 8 一 第一章i l 2 2 研究进展 1 白细胞介素简介 2 0 世纪8 0 年代以来，陆续发现多种来源于白细胞的细胞因子，统称为白细 胞介素( 简称白介素，i n t e f l e u k i n s ，i l ) ，是免疫细胞与非免疫细胞产生的一类能 够介导白细胞与其它细胞相互作用的细胞因子，涉及免疫和炎症反应的每个方 面。 目前发现的人类白介素己多达3 5 种。自介素1 0 家族就是其中的一种，迄今为 止已发现的白介素1 0 家族成员包括i l - i o 、i l - 1 9 、i l - 2 0 、i l - 2 2 、i l - 2 4 、i l - 2 6 、 i l - 2 8q 、i l - 2 88 和i l - 2 9 1 1 1 。它们均由一类结构极其相似的基因编码。i l - 2 8a 、 i l - 2 8b 和i l - 2 9 是i l - 1 0 家族最年轻的成员，也属于干扰素家族，它们的氨基酸序 列更类似于i 类干扰素细胞因子家族。i l - 1 0 家族成员的编码基因位于人类基因 组的三个部位，i l - i o 、1 i , - 1 9 、i l - 2 0 和i i 厂2 4 的编码基因定位于染色体l q ，i l - 2 2 和i l - 2 6 的编码基因定位于染色体1 2 q ，i l - 2 8 a 、i l - 2 8 b 和i l - 2 9 的编码基因定位于 染色体1 9 q 1 2 | 。 所有的白介素1 0 家族成员均通过结合它们的受体复合物r 1 链和r 2 链发挥生 物学功能，这些受体位于细胞外膜上，属于i i 类细胞因子受体家族f 1 1 。研究发现 i l - 1 0 家族成员受体复合物有一些特殊的生物学特征。首先，r 1 链并不是i l - 1 0 家 族成员的主要结合链。i l - 1 9 、i l - 2 0 和i l 2 4 首先结合的是r 2 链。第二，细胞因子 与受体之间并非一一对应关系，虽然i l - i o 家族包括9 种细胞因子，但这些细胞因 子却只有r 1 和r 2 两条受体链。i l - 1 0 家族的一些成员都存在受体共享的情况。例 如，多年来i l - 1 0 r 2 链一直被认为是i l - 1 0 受体的特有链，但是，它也同样作为 i l - 2 2 、i l - 2 6 、i l - 2 8 a 、i l - 2 8 b 和i l - 2 9 受体复合物的一条链。此外，不同的i l - 1 0 家族成员不仅共享单一的受体链，甚至共享受体复合物。例如，i l - 1 9 ，i l - 2 0 和 i l 广2 4 就共享i l - 2 0 r 1 和i l - 2 0 r 2 受体复合物。事实上，有关i l - i o 家族中受体分配 的问题越来越复杂，因为一些细胞因子确实能跟不止一个受体复合物结合。i l - 2 0 和i l - 2 4 的信号通路就通过结合i l 2 0 r 1 i l 广2 0 r 2 和i l 2 2 r 1 i l 广2 0 r 2 受体复合物来 介导。 表1 总结了i l - i o 家族成员的一些基本特征，包括细胞来源及介导的信号转 导通路。i l - i o 结合i l - 1 0 r 1 和i l - 1 0 r 2 受体复合物后激活j a n u sk i n a s e l ( j a k l ) 潘芹：i l - 2 2 介导肿瘤细胞m a p k 通路及细胞增殖 9 一 和t ”o s i n ck i n a s e 2 ( t y k 2 ) 、信号转导和转录活化因子 ( s i g n a l t r a n s d u c e r sa n da c t i v a t o r so f t r a n s c r i p t i o n ，s t a t l 和s t a t 3 ) 。 i l - 1 9 于2 0 0 0 年被发现，与i l - 1 0 的氨基酸同源性为2 1 1 3 1 ，通过结合i l - 2 0 r 1 和 i l - 2 0 r 2 ，激活s t a t l 和s t a t 3 ，介导信号通路，目前，i d l 9 的生物学功能还不 十分清楚。i l - 2 0 与i l l 9 一样，其信号通路也是通过结合i l 2 0 r 1 i l 2 0 r 2 二聚体， 但是，i l - 2 0 也能结合由i l - 2 0 r 1 和i l - 2 0 r 2 组成的受体复合物。这些受体复合物 均通过j a k s t a t 通路发挥其生物功能，i l - 2 0 r 主要表达于正常皮肤角质细胞和睾 丸，心脏、肺、胎盘、肾上腺和卵巢也有表达。i l - 2 0 可能是与皮肤发育和病变 有关的细胞因子。i l - 2 2 结合i l - 2 2 r 1 和i l - 1 0 r 2 ，诱导j a k l 和t y k 2 的活化，从而激 活s t a l 3 。l l 2 4 又称为黑色素瘤分化相关基因7 ，主要由抗c d 3 抗体和i l 4 诱导 的t h 2 细胞、l p s 刺激的单核细胞和黑素细胞瘤产生，i l 广2 4 与i l 2 0 r 1 和i l 2 0 r 2 组成的受体复合物结合后可激活细胞内信号分子s t a t 3 。i l 广2 4 对t h l 型细胞因子 的诱导作用可被i l - 1 0 抑制，提示i l - 1 0 家族细胞因子之间可能存在相互拮抗作用 1 4 0 l 。i l - 2 6 结合一个独特的受体复合物：i l - 2 0 r 1 和i l - 1 0 r 2 链，结合后激活s t a t l 和s t a t 3 。而i l - 2 8 和i l - 2 9 的受体复合物均是i f n l r l 和i l l 0 r 2 ，能激活j a k l 、 s t a t l 、2 、3 、5 ，其功能可能是以自分泌的方式维持t 细胞的生长。 表1i l - i o 家族受体和信号通路 ( 该表引自s c o t tc o m m i n s ，m d ，p h d ，j o h nw s t e i n k e ，p h d ，a n dl a r r yb o r i s h ，m d t h e e x t e n d e di l - 1 0s u p e r f a m i l y ：i l - 1 0 ，i l - 1 9 ，i l - 2 0 ，i l - 2 2 ，i l - 2 4 ，i l - 2 6 ，i l - 2 8 ，a n di l 一2 9 a l l e r g yc l i ni m m u n 0 1 2 0 0 8 ，1 2 1 ：1 1 0 8 1 1 1 1 ) i l - 1 0 家族：受体和信号通路 成员细胞来源受体 激活的信号通路 i l - 1 0 单核细胞，b 细胞，t 淋巴细胞 i l - 1 9 单核细胞 i l 2 0 单核细胞，皮肤表皮细胞 1 1 - 2 2 活化t 细胞，死亡细胞，t h l 7 细胞 i l 2 4 黑素细胞瘤，单核细胞，t h 2 淋巴细胞 1 1 2 6 单核细胞，t 细胞 ：i 厂l - 2 2 9 8 树突细胞 i l - 1 0 r 1 i l - 1 0 r 2 ：了怒b n a s 叱 i l - 2 0 r1 i l - 2 0 r 2 s t a t l ，s t a t 3 岂l - 2 0 r 1 i l - 2 0 r 2 ，j a k s t a t 2 2 r 1 i l - 2 0 r 2i l 。“ i l 2 2 r 1 i i ，1 0 r 2s t a t 3 i i ，2 0 r 1 i l 2 0 r 2 ， i i ，2 2 r1 i l 2 0 r 2s t a t 3 ( s k i no n l y ) i l 2 0 r1 i i ，1o r 2s t a t l s t a t 3 i f n l r l i l - 1 0 r 2j a k l ，s t a t l 、2 、3 和5 扬州大学硕士学位论文 i b l 0 家族成员都有促炎和抗炎的潜在作用，具体作用由免疫细胞存在和对 细胞因子的反应决定。但是，不同成员介导不同活性，包括免疫抑制、抗菌和抗 病毒免疫、抗肿瘤活性以及免疫疾病的自我调节。 2i l - 2 2 的来源、分布、分子结构及编码基因 1 9 9 9 年d u m o u t i e r 等【4 】在以i l - 9 刺激的t 细胞小鼠瘤细胞b w 5 1 4 7 中发现了一 种新型基因，编码一种q 螺旋状的蛋白质【1 1 】。由于其结构类似于抗炎和抑制免 疫力的i l - 1 0 ，因此将其命名为白细胞介素1 0 相关的t 细胞衍生的可诱导因子 ( i l - 1 0 r e l a t e dtc e l l d e r i v e di n d u c i b l ef a c t o r ，i l - t i f ) 。之后，x i e 等1 5 j 也发现 了小鼠i l - t i f 的人同源体。由于其结构类似于i l - 1 0 ，而且与i l - 1 0 有相似的受体 复合物，并在免疫细胞中也有表达，故称之为白细胞介素2 2 。i l - 2 2 是i l - 1 0 家族 中的一名新成员，与i l - 1 0 的氨基酸同源性为2 2 。 m - 2 2 由活性t 细胞产生，主要是t h l 7 和t h l 细胞【2 6 1 。在多种慢性炎症疾病中 i l - 2 2 都有高水平的表达，如肠炎、间质肺病、牛皮癣、类风湿性关节炎患者的i l - 2 2 表达量都有所增加【2 4 , 3 0 , 3 5 , 4 1 l 。起初，这些疾病都被认为是由n 1 引起的，但近来 的研究证实t h l 7 细胞导致了这些疾病。t h l 7 细胞是一种炎症t 细胞。i l - 1 7 a 是这 个细胞家族中最先定义的细胞因子，在招募嗜中性白细胞和诱导产生抗微生物肽 的过程中有重要作用，j 下如慢性炎症疾病中上调i l 广2 2 一样【4 2 】。虽然共同表达于 t h l 7 ，但i l - 2 2 的表达明显不同于i l - 1 7 a 和其他t h l 7 相关的分子。i l - 1 7 a 的表达 需要t g f 1 3 和其他炎症刺激物的参与，而i l 广2 2 的表达只需i l - 6 的诱导即可【矧。事 实上，伴随着i l - 1 7 a 高表达水平的t g f 1 3 表达量的增加会降低i l - 2 2 的表达水平。 最近发现的转录因子芳烃受体可部分解释这种基因调节机制【删。芳烃受体有助于 i l - 2 2 的表达，而对t h l 7 的其他细胞因子则无效应。因此，不同的转录因子和其 他潜在的调控因子调节i l - 2 2 和i l - 1 7 的表达。i l - 2 2 不仅表达于c d 4t 细胞，还表 达于其他免疫细胞，女h c d 8t 细胞、活性n k 细胞和y6t 细胞【矧。此外，i l - 2 2 不仅表达于适应性免疫系统，而且表达于内在免疫系统【4 4 , 4 5 】。i l - 2 2 在体外可由 i l - 9 或c o n a 诱导的胸腺淋巴瘤、t 细胞、肥大细胞、b 细胞及嗜酸性粒细胞产生 【刀 o d u m o u t i e r 等1 6 j 最先报道了关于人、小鼠i l - 2 2 的基因定位和结构。人白介素 2 2 基因定位于染色体1 2 q 1 5 ，其g e n e b a n k 登录号为n t 一0 2 9 4 1 9 。i l - 2 2 与i l - 1 0 家族 潘芹：i l - 2 2 介导肿瘤细胞m a p k 通路及细胞增殖 1 1 大多其他成员有着相同的结构基础，外显子1 5 长度分别为2 3 9 b p 、6 6 b p 、1 4 4 b p 、 6 6 b p 和6 3 2 b p 。外显子1 最初的5 3 b p 个核苷酸编码5 端为不表达区域，外显子1 的 其余核苷酸、外显子2 到4 及外显子5 最初的7 5 b p 的核苷酸编码可读框部分，外显 子5 其余的5 5 4 b p 核苷酸编码3 端为不表达区域，包括6 个单一和两个重叠的 a t i t a 模体的拷贝。这样的序列在细胞因子基因的3 端未翻译的区域被不断发 现，研究显示其参与r n a 稳定和翻犁1 1 l 。i l - 2 2 j i 羹 序列可读框眭t 5 3 7 b p 个核苷酸 组成，编码1 7 9 个氨基酸。此外，除了这5 个外显子，d u m o u t i e r 掣矧于2 0 0 0 年还 在其下游发现2 2 个核苷酸组成非编码外显子。小鼠i l - 2 2 编码基因定位于染色体 1 0 q 2 ，它的结构类似于人的基因， g e n e b a n k 登录号为n t0 4 9 0 4 5 和n m0 1 6 9 7 1 。 与人i l 广2 2 一样，小鼠i l - 2 2 的可读框部分也是由5 3 7 b p 个核苷酸组成，编码1 7 9 个 氨基酸长的蛋白。该长度极其类似于i l - 1 0 的编码蛋白( 1 7 8 个氨基酸) 。除去一 段信号肽，人i l - 2 2 编码1 4 6 个氨基酸i s 】。对氨基酸序列的研究表明人i l - 2 2 与人 i l - 1 0 的同源性为2 2 8 ，与小鼠i l - 2 2 的同源性为8 0 8 。 2 0 0 2 年有学者报道了人重组i l - 2 2 的晶体结构f 1 5 l ，其每个单域包含6 个a 螺 旋。i l - 2 2 包含1 7 9 个残基、一个n 端疏水信号肽、两个2 0 k d a 大小的二硫键及三 个潜在n 连接糖基化位点【矧。2 0 0 5 年，于昆虫细胞表达蛋白中证实也报道了i l 2 2 的晶体结构，并未发现i l - 2 2 的整体结构有明显变化【1 4 l 。虽然i l - 1 0 家族成员之间 在氨基酸水平上只有很少的同源性( 相对于整个蛋白质序列不超过1 5 2 5 ) ，但 它们的二级结构却有很强的相似性。事实上，所有的细胞因子都有6 、7 个a 螺旋 结构。i l - 2 2 - - 级结构的a 螺旋不在平行的区域，x 衍射观察到，其十分类似于i l - 1 0 家族的成员i l - 1 9 ，据此推测下来，i l - 2 0 和i l 广2 4 可能与此类似【1 4 , 1 5 】。人i l - 2 2 理论 上的分子量是1 6 7 k d a ，但是，真核细胞表达中由于蛋白的重组，其分子量已达 至1 1 7 k d a 。在i l - 2 2 序列中的3 个潜在的n 端糖基化位点都发现了糖基化：一个位 于螺旋a ( a s n 5 4 a r 9 5 5 t h r 5 6 ) ，一个位于a b 环( a s n 5 4 a r 。9 5 5 t h r 5 6 ) ，第三 个位于螺旋c 上( a s n 9 7 p h e 9 8 t h r 9 9 ) 1 9 , 1 8 】。从i l - 2 2 糖基化与非糖基化蛋白的x 衍射数据观察到糖基化与i l - 2 2 的三级结构的变化并没有关系。但是，a s n 5 4 的糖 基化与i l - 2 2 与i l - 1 0 r 2 的结合有重要影响，而对与i l - 2 2 r 1 的结合则没有影响1 1 8 l 。 3i l 2 2 受体复合物 i l - 2 2 主要通过i l - 2 2 受体蛋白的介导来发挥其生物学功能。i l - 2 2 受体复合物 扬州大学硕士学位论文 由两条受体链构成：i l - 2 2 r 1 和i l - 1 0 r 2 。而i l - 1 0 r 2 - - 直作为i l - 1 0 受体复合物的 第二条链被研究【引。i l - 2 2 r 1 最初被命名为c r f 2 9 。它们均属于i i 型的细胞因子 受体家族【叭。其中，i l - 2 2 r 1 是i l - 2 2 特异性结合的蛋白分子，而i l - 1 0 r 2 是i i , - 1 0 受体复合物和i l - 2 2 受体复合物间的共用链，这在i i 类细胞因子受体家族中是首 例f 2 1 。i l - 1 0 r 2 链在各种细胞内几乎均有表达，但i l - 1 0 的活性却仅限于造血细胞， 可能是因为i l - 1 0 与其他受体分享了i l - 1 0 r 2 链。1 i , - 2 2 受体复合物与i l - 1 0 受体复 合物只有2 7 的同源性，极低的同源性预示着只能有一条链可以共享。 i l - 2 2 和i l - 1 0 受体的共享使i l - 2 2 和i l - 1 0 有一些共同的信号通路，如它们都能 诱导j a k l 和t y l ( 2 的活化，从而诱导三种转录的信号通路活化子：s t a t l 、s t a t 3 和s t a t 5 的磷酸化。但是i l - 2 2 和i l - 1 0 介导信号通路也有区别：i l - 2 2 可激活3 条 主要的m a p k 通路：m e k - e r k 、j n k s a p k 和p 3 8 激酶途径，而且i l 2 2 能诱导 s t a t 3 的7 2 7 位丝氨酸残基的磷酸化，而i l - 1 0 并不能产生这些生物学效应1 1 0 1 。因 此，1 i _ , - 2 2 和i i _ , - 1 0 虽然结构相似，共享一条受体链，但这些细胞因子介导的信号 通路并不完全一致。 两条受体链都能与i l - 2 2 单独结合，但是，受体复合物与i l - 2 2 的结合能力明 显强于单独一条链与其结合的能力，这是1 1 _ , - 2 2 受体复合物的一个特征。i l - 2 2 首 先与i l - 2 2 r 1 的胞外域结合，构象发生改变，进而i l - 1 0 r 2 与i l - 2 2 i l 。2 2 r 1 表面结 合【1 8 舶l ，随后即可通过j a k s t a t 和m a p l 通路进行信号转导。 人i l - 2 2 r 1 基因位于染色体l q 3 6 1 1 。i l - 2 2 r 1 为5 7 4 个氨基酸的细胞膜蛋 白，胞外区域2 2 8 氨基酸，存在3 个n 连接糖基化部位，即a s n x t h r s e r ，信 号肽含1 7 个氨基酸，跨膜结构域含2 3 个氨基酸，胞浆结构域含3 2 3 个氨基酸， 至少存在8 个潜在磷酸化的酪氨酸残基，对i l - 2 2 r 1 胞内区域t y r 位点氨基酸序 列的分析表明i l - 2 2 r 1 胞内域内有4 个潜在的s t a t 3 招募部位的存在，即磷酸 t y r - x a a x a a g i n 序列( y x x q ) 1 6 j 。i l - 1 0 r 2 编码基因定位于2 1 q 2 2 1 1 。细胞外 区域含有4 个n 端糖基化位点。i l - 2 2 r 1 和i l - 1 0 r 2 具有类似的结构，包括7 个 外显子，外显子2 7 分别编码长为5 7 4 和3 2 5 的氨基酸蛋白。跨膜区域由外显子 6 相应基因编码。 1 i , - 2 2 受体高表达于组织细胞中，如消化道和皮肤的表皮细胞，但不表达于 免疫细胞。因此，i l - 2 2 受体对免疫反应无直接效应。i l - 2 2 特异性结合链i l - 2 2 r 1 潘芹：i l - 2 2 介导肿瘤细胞m a p k 通路及细胞增殖里 主要表达于胰、肝、结肠、小肠、肾组织，以及结肠腺癌s w 4 8 0 、肺癌a 5 4 9 、 黑色素癌g 3 2 1 、肝癌h e p g 2 和肾癌c a k i 1 等肿瘤细胞系1 1 3 l ，而i l - 1 0 r 2 广泛分布 于全身各组织。 4 i l - 2 2 的结合蛋白 细胞表面与i l - 2 2 相结合的不仅有其受体复合物，还存在一种可溶性的、单 链的i l - 2 2 受体，称为i l - 2 2 结合蛋白( i i 厂2 2 b p ) 。i l - 2 2 结合蛋白( b p ) 是一 种由i i 类细胞因子受体家族的成员克隆而来的新型受体，与i l - 2 2 r 1 有3 4 的同 源性【1 2 l 。与大多可溶性受体一样，它是细胞受体的断裂形式，由蛋白酶水解断裂 而成，通过替代剪接m r n a 产生，通过病毒基因组编码且在病毒感染后分泌。 i l - 2 2 b p 是由一个独立的基因编码的，该编码基因缺少膜锚定序列。 人i l - 2 2 b p ( i l - 2 2 r a 2 ，g e n e b a n k 登录号为n t0 2 5 7 4 1 ) 编码基因定位于 染色体6 q 2 4 1 ，大约位于i l - 2 0 r 1 编码基因下游1 5 2 k b 处。它的6 个外显子分布 于长为2 9 8 k b 的区域剥1 9 ，删。外显子1 和外显子2 的一部分核苷酸编码5 端的 不翻译区域，外显子2 的其余核苷酸编码信号肽，成熟蛋白是由外显子3 、4 、5 和外显子6 的一部分核苷酸编码的，外显子6 的其余核苷酸编码3 端的不翻译区 域。i l - 2 2 b p 的可读框部分为6 9 6 b p ( 2 3 7 9 3 2 位) 核苷酸，编码2 3 1 个氨基酸， 信号肽为2 1 个氨基酸，成熟蛋白2 1 0 个氨基酸，存在5 个n 连接糖基化部位 ( a s n x - t h r s e r ) 和4 个保守的c y s 2 2 1 。 i l - 2 2 b p 的m r n a 表达于人类的一些组织，包括女性生殖系统( 胎盘、乳 腺、子宫内膜) ，淋巴组织( 胸腺、脾、淋巴结) ，胃肠系统( 胃、小肠、食管、 胃食管、胰腺、十二指肠、回肠和结肠) ，肺以及皮肤。原位杂交显示i l - 2 2 b p 的主要表达细胞是单核细胞和上皮细胞【2 2 , 3 1 , 3 2 , 3 3 】。 可溶性的细胞因子受体能与细胞表面的受体竞争结合游离的细胞因子分 子，i l - 2 2 b p 能直接结合i l - 2 2 ，阻断i l - 2 2 与功能性