（生物化学与分子生物学专业论文）香肠干粉发酵剂的制备研究.pdf

夏小伟：香肠干粉发酵剂的制备研究 于两璺 发酵香肠具有营养丰富，风味独特，耐贮藏的特点，符合当今消费者的需求，开发潜 力被业内人士看好。随着我国发酵肉制品工业的迅猛发展，积极研究并大力开发高效浓缩 型发酵剂，对于推动我国发酵剂产业化进程、促进我国发酵肉制品工业的发展，具有重要 意义。为了获得含有较多活细胞且使用方便的肉制品干粉发酵剂，本文对增殖培养基组分、 培养条件、茵体收集浓缩条件、干粉发酵剂保护剂的筛选等主要步骤进行了研究，制备出 高效浓缩型菌种冻干发酵剂，并对冻干发酵剂在香肠中的发酵效果进行了检验。 本试验以实验室保藏的优良发酵菌株路邓葡萄球菌作为试验菌株，以m s a 培养基作为 基础培养基，通过单因素和正交试验研究了路邓葡萄球菌的增殖培养基成分，确定了增殖 培养基的组成为：在m s a 基础培养基中添加1 5 酵母膏、0 5 吐温8 0 、3 o 番茄汁、 0 2 c a c 0 3 ，按此组合配制的培养基增菌效果可达5 1 6 x1 0 9 c f u m l 。确定了发酵菌株的最 适培养条件：接种量2 、初始p h 值6 5 、温度为3 5 。c 、装液量5 0 m l ( 2 5 0 i n l ) 、摇床转数 1 5 0 r m i n ，确定发酵1 8 - 2 0 小时可为发酵最佳收获期，此时细胞积累量最大。 通过对离心转数和时间的考察，最后确定选择1 0 0 0 0 r m i n 、l o m i n 作为最终离心条件， 在该最适条件下离心，试验菌株的离心收得率为9 6 7 8 。通过对冻干保护剂的单因素和 正交试验，确定试验菌株的最优复合冻干保护剂配比为：以8 n f m 为悬浮基质添加1 0 甘 露醇+ 1 5 l - 谷氨酸钠+ 5 蔗糖+ 1 0 甘油，冻干后的细胞存活率达到为8 9 6 6 。冻干菌粉 的储藏性能研究结果表明发酵剂保存在真空，4 c 左右的条件下活菌数下降最少。 对发酵香肠理化指标的测定表明：对照组、液体发酵和干粉发酵组香肠成熟过程中的 水分含量、p h 值以及水分活度均呈下降趋势。本试验共检测出主要风味化合物7 0 种，其 中包括酸类、醛类、醇类、酮类、酯类、烃类和杂环类分别为7 ，1 3 ，1 2 ，3 ，1 1 ，1 2 ，1 2 种； 液体发酵组、干粉发酵组与对照组相比较而言，检测到的挥发性化合物种类总数之间存在 明显的差异，其中液体发酵组香肠样品检测到的挥发性化合物总数为5 1 种，干粉5 2 种， 而对照组只有3 4 种。发酵香肠感官评价结果表明：液体发酵组和千粉发酵组感官品质上 优于对照组，这两组在整体接受度方面之间没有差异。用液体发酵剂和干粉发酵剂分别制 作发酵香肠，所得的产品在理化指标、挥发性化合物分析测定和感官评价上差异不明显。 综合结果表明，本试验研究制备出的干粉发酵剂可以作为香肠发酵剂用于发酵香肠的生 产。 关键词：增殖培养基；发酵剂；保护剂；冻干存活率；风味化合物 2 扬州大学硕士学位论文 a b s t r a c t f e r m e n t e dm e a t sa r en u t r i t i o u s ，w i t hs p e c i a lf l a v o ra n dal o n gs h e l f - l i f e ，w h i c ha r ep o p u l a r a m o n gc o n s u m e r sa n dh a v eag o o dp o t e n t i a lf o ri n d u s t r i a l i z a t i o n w i t ht h er a p i d l yd e v e l o p m e n t o ff e r m e n t e dm e a tp r o d u c ti n d u s t r y , i ti so fs i g n i f i c a n tf o rp r o m o t i n gt h ei n d u s t r i a lp r o c e s so f s t a r t e r , i m p r o v i n gd e v e l o p m e n to ff e r m e n t e dm e a tp r o d u c t ；i no r d e rt og e td r yp o w d e rs t a r t e r w i t hal a r g en u m b e ro f1i v ec e l l sa n de a s yt ou s e ，t h em e d i u m ，c u l t u r ec o n d i t i o n s ，p r o t e c t i n g a g e n tf o rp o w d e rs t a r t e rw e r es t u d i e di nt h i se x p e r i m e n t h i g hc o n c e n t r a t e df r e e z e - d r i e db a c t e r i a f e r m e n tw a sm a d ea n df r e e z e d r i e ds t a r t e rc u l t u r e si ns a u s a g ef e r m e n t a t i o nw a st e s t e d u s i n gt h es i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a lt e s t s ，t h ec o m p o s i t i o n so ft h eo p t i m u me n r i c h m e n t m e d i af o rs t a p h y l o c o c c u sl u g d u n e n s i sw a s t h eb a s i so ft h em s am e d i u mw i t h1 5 y e a s t e x t r a c t ，0 5 t 1 ) i ，e e n8 0 ，3 0 t o m a t oj n i c e ，0 2 c a c 0 3 ，t h ec e l ld e n s i t yc o u l dr e a c h 5 16 x10 c f u m li nt h i sm e d i u m w - ed e t e r m i n e dt h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n si s ：2 i n o c u l u m ，i n i t i a lp hv a l u eo f6 5 ，t h et e m p e r a t u r ei s3 5 ，l i q u i dv o l u m e5 0 m l ( 2 5 0 m l ) ，s h a k e r r o t a t i o n15 0 r m i n a n da l s od e t e r m i n et h ef e r m e n t a t i o nf o rl8 2 0h o u r sa st h eb e s th a r v e s tt i m e b yc e n t r i f u g a lr o t a t i o na n dt i m eo fi n s p e c t i o n t h eo p t i m u mc e n t r i f u g a lc o n d i t i o nf o r s t a p h f l o c o c c u sl u g d u n e n s i sw a s1 0 0 0 0 r m i n 1 0 m i n ，t h eh a r v e s tr a t ew a s9 6 7 8 t h eo p t i m u m c o m p o s i t i o n so ff r e e z e d r i e dp r o t e c t a n tf o rs t a p h y l o c o c c u sl u g d u n e n s i sw e r e ：10 m a n n i t o l m a t r i x + 1 5 l s o d i u mg l u t a m a t e + 1 0 g l y c e r 0 1 5 s u c r o s eo nt h eb a s i cc u l t u r eo f8 n f m t h es u r v i v a lr a t ew a s8 9 6 6 f r e e z e d r i e dp o w d e rs t o r a g ep e r f o r m a n c er e s u l t ss h o wt h a t t h ef e r m e n t a t i o na g e n ts t o r e di nav a c u u m ，4 ，u n d e rw h i c hc o n d i t i o n st h en u m b e ro fv i a b l e c e l l sd e c r e a s e da tl e a s t d e t e r m i n a t i o no fp h y s i c a la n dc h e m i c a li n d i c a t o r so ff e r m e n t e ds a u s a g es h o wt h a t ：t h e c o n t r o lg r o u p ，l i q u i df e r m e n t a t i o na n dd r yf e r m e n t e ds a u s a g e sg r o u p sm o i s t u r ec o n t e n t ，p h ，a n d w a t e ra c t i v i t yd e c r e a s e dd u r i n gr i p e n i n g i nt h i ss t u d y ，7 0m a j o rf l a v o rc o m p o u n d sw e r e d e t e c t e dw h i c hi n c l u d e s7k i n d so fa c i d s ，13k i n d so fa l d e h y d e s ，12k i n d so fa l c o h o l s ，3k i n d so f k e t o n e s 1 1k i n d so fe s t e r s ，12k i n d so fh y d r o c a r b o n sa n d12k i n d so fh e t e r o c y c l i c ；c o m p a r e d w i t ht h ec o n t r o lg r o u p t h et o t a lt y p e so fv o l a t i l ec o m p o u n d sd e t e c t e di nt h el i q u i da n dd r y f e r m e n t a t i o ng r o u pa r es i g n i f i c a n td i f f e r e n t ，o fw h i c ht h el i q u i df e r m e n t e ds a u s a g es a m p l eg r o u p o fv o l a t i l ec o m p o u n d sd e t e c t e di nat o t a lo f51s p e c i e s ，d r yp o w d e r5 2s p e c i e s ，w h i l et h ec o n t r o l g r o u po n l y3 4 s e n s o r ye v a l u a t i o ns h o w e dt h a t ：d r ya n dl i q u i df e r m e n t a t i o ng r o u p sa r eb e t t e r t h a nt h ec o n t r o lg r o u p ，t h e s et w og r o u p si nt h eo v e r a l la c e 印t a n c ew e r en od i f f e r e n c eb e t w e e n t h et e r m s c o m p r e h e n s i v er e s u l t ss h o wt h a tt h ed r yp o w d e rp r e p a r e db yt h i se x p e r i m e n tc a nb e u s e da ss t a r t e rc u l t u r e sf o rf e r m e n ts a u s a g ep r o d u c t i o n k e yw o r d s ：e n r i c h m e n tm e d i u m ；s t a r t e rc u l t u r e ；p r o t e c t a n t ；f r e e z e d r y i n gs u r v i v a lr a t e ；f l a v o r c o m p o u n d s 夏小伟：香肠干粉发酵剂的制备研究 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研究成果。 除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果。对 本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由 本人承担。 学位论文作者签名： 剁峰 签字日期：勿夕年6 月9 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。本人授权扬 州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位 论文收录到 吐温8 0 ( b ) 番茄汁( c ) c a c o 。( d ) ，最佳培养基是7 号，其配比为：a 3 b i c 3 d 2 ，即在m s a 基 础培养基中添加1 5 酵母膏、05 吐温8 0 、3 0 9 6 番茄汁、0 2 c a c 如，在7 号培养基中， 路邓葡萄球菌3 5 c 恒温培养2 0 h ，活菌数达到51 6 xl o 。c f u m l ，较对照组提高了47 8 倍。 2 32 增殖培养工艺的研究 2 321 接种量的确定 接种量是指接入的种子液的体积与接种后培养液体积的比例】。将活化过两次的种子 液分别以1 、2 、3 、4 、5 的接种量接入增殖培养基中，于培养箱中恒温培养2 4 h ，以 未接种的培养摹调节分光光度计的0 点，测定样品的吸光度a 。以时问为横坐标，吸光度 为纵坐标，作出不同接种量对路邓葡萄球菌细胞增殖的影响图，结果如图21 图21 接种量对路邓葡萄球菌生长的影响 m g2 1e f f e c t o f i n o c u h n ns i z eo l l g r o w t ho fs t a p h y l o c o c c u s l u g d u n e n s n 图2 - 1 显示，在培养的前2 h 内，接种量为1 的曲线的吸光度值增加较慢，而其余四 条曲线的吸光度值增加较快，即说明1 的接种量存在相对较长的延迟期，较大的接种量 适当的缩短了延迟期。这恰好体现了大接种量的优点。但是。无限量的加大接种量也是不 可取的。如图2 一l 中3 、4 、5 接种量的曲线，在培养的前4 h 内培养液的细胞浓度最 大在4 h 后，细胞积累量落后于2 接种量的曲线，8 h 后落后于1 接种量的曲线，这可 能是因为接种时种子液带入了相对较多的代谢产物，减弱了培养液的缓冲能力，致使细胞 夏小伟：香肠干粉发酵荆的制备研究 的积累量偏少。细胞积累最多的是2 峨女种量的曲线。 23 22 最佳初始p h 值的确定 微生物在生长的过程中，一方面要求培养基有适宜的p h 值，另一方面由于它们的代 谢作用又会改变培养基的p h 值。当培养基的p 1 1 值发生改变时，会影响微生物的正常生长。 所以在配制培养基时，不仅要调节培葬基的初始p h 值，使其符合微生物生长的需求，而且 要考虑如何加强培养基的缓冲能力，使其p h 值在较小的范围内变化，而不至于较早的抑 制微生物的生长。 将增殖液体培养基p h 调至6 0 、6 5 、7 0 、75 、80 的不同p h 值梯度系列，将活化 两代的试验菌株接种于其中，3 5 培养，每隔2 h 测定其o d 咖值，阻未接种的培养基调节 分光光度计的0 点，测定样品的吸光度a 。以时问为横坐标，吸光度为纵坐标，作出不同 初始p h 值对路邓葡萄球菌细胞增殖的影响图，结果如图22 图2 _ 2 初始p h 值对路邛葡萄球菌生氏的影响 f i 9 2 - 2 e f f e c t o f i n i t i a l p h v a l u e o n p w t ho f s t a p h y l o c o c c u s l u g d u n e n s 由图2 - 2 可知，初始p 】 对菌株生长情况影响大，初始p h 值过低或过高，都不利于蒴 体的生长。初始p h 为6 5 时，培养2 0 h 吸光值达最大，为19 7 2 ，由此可以确定p h 为65 为晟佳初始p h 值。 2323 最佳温度的确定 温度是影响微生物代谢活动的重要因素之一。微生物生长是一系列复杂化学变化反应 扬州大学硕l 学位论空 的结果，而温度的改变必然影响微生物体内所进行的许多生化反应。进而影响它们的生长 速率。每种微生物都有自己的最适生长温度范围，只有在最适生长温度下，菌数才能达到 最大。为了确定菌体生长的最佳温度，我们测定了在培养温度分别为2 0 、2 5 、3 0 、 3 5 、4 0 的菌体2 4 h 生长曲线。结果如图23 所示。 图2 - 3 不同培养温度对路邓葡萄球菌生长的影响 f i g2 - 3 e f f e c t o f d i f f c 就n t t 锄d 啪m 他衄g r o w t ho f 且a p h y l o c o c c u s l u g d u i s 由图23 可知，菌株在不同温度下的生长速度差异显著，温度从2 0 上升至3 5 的 过程中，生长速度随温度的上升加快，温度继续上升，生长速度反而下降。2 0 c 条件下菌 株生长速度受到明显影响，在2 0 c 、2 5 c 、3 0 c 、3 5 c 、4 0 c 下培养，菌体譬三长至稳定 期吸光值分别为l _ 2 4 5 ，l3 7 5 ，1 4 3 2 ，18 6 1 ，17 2 3 。因此，确定3 5 c 为菌体细胞生长的最 佳温度。 2 324 装液量对菌体生长的影响 对大多数微生物来说，溶氧是进行能量代谢展重要的气相底物，并且通常是发酵的限 制性因素。培养基的供氧情况影响氧化还原电位值，不同的氧化还原电位值有可能使代谢 途径发生改变，从而影响菌体的生长与产物的形成。故在发酵过程中要不断供给氧气满足 菌体对溶解氧的需要，满足菌体生长的最佳通气条件。 为了进一步探究装液量和振荡频率对菌体生长的影响，本项试验分别设计了不同的装 液量与摇床振荡频率，分别以培养时间和吸光度 为横坐标和纵牮标。绘制生长曲线，结 夏小伟；香肠干粉发酵剂的制各研究 果见表2 - 4 和2 r 5 图2 - 4 不同装液量对路邓葡萄球菌生长的影响 f i g2 4e f f e c t o f d i f f e r e n tv o l m e o f m e c l i 岫0 n g r o w t ho f s t a p h y l o c o c c u s l u g d u n e r u i s 图2 5 不同振搞频率对路邓葡萄球菌生长的影响 f i g2 5e f f e c to f d i f f e r e n t8 h a k i n g f r e q u e n c yo n g r o w t h o f s t a p h y l o c o c c u s l u g d u n e n s i s 由图2 4 可知，咀2 5 0 m l 三角瓶进行发酵，不同的装液量对苗体的生长有一定的影响 培养2 0 h 后，装液量为5 0 r a l 时苗体产量最大，装 葭量超过5 0 m l 时，苗体浓度有所降低 扬州大学硕士学位论文 而当装液量低于5 0 m l 时的菌体浓度也小于装液量为5 0 m l 的菌体浓度，由此，选择5 0 m l 为最佳装液量。 2 3 2 5 摇床转数对菌体生长的影响 由图2 - 5 可知，以2 5 0 m l 三角瓶装液量5 0 m l 进行菌种发酵，不同的振荡频率对菌体 的生长有一定的影响。转速在1 5 0 r m i n 时吸光度值最高，转速太高或太低，都不利于菌 体生长和繁殖，这可能是由于菌体细胞的生长对氧含量有一定范围的要求。而不同的振摇 频率使氧的溶解量不同，只有在1 5 0 r m i n 时氧的溶解度刚好达到饱和。由此本试验选择 1 5 0 r m i n 作为最佳振荡频率。 2 3 2 6 最佳培养时间( 收获期) 的确定 为了解路邓葡萄球菌在优化发酵培养基中的生长情况，从而掌握发酵菌体最适收获 期。因此进行了2 4 h 生长曲线测定。间隔2 h 测定0 d 啪，并绘制生长曲线，如图2 6 。 图2 6 路邓葡萄球菌发酵过程生长曲线 f i 9 2 - 6t h eg r o w t hc u r v eo f s t a p h y l o c o c c u sl u g d u n e n s i s 由图2 - 6 的生长曲线可看出，发酵菌种在4 小时内吸光度值缓慢增加，在4 小时后快 速增长，进入对数生长期，2 0 小时后到达高峰，吸光度值几乎不再增加2 0 h 后开始进入 生长稳定期，吸光度值基本保持不变。因此，发酵1 8 2 0 小时可确定为发酵最佳收获期。 此时细胞积累量最大，而高浓度细胞还可形成菌胶团的保护层，相对降低了菌体细胞暴露 在介质中面积，提高抗冷冻干燥能力。 夏小伟：香肠干粉发酵剂的制备研究 1 9 2 4 讨论 筛选并培育具有优良性状的菌种或菌株是制备高效浓缩型冻干发酵剂的基础，其菌种 或菌株应具有良好的生长特性、产香特性、水解蛋白和脂肪特性以及后熟特性等发酵性能。 肉制品发酵剂生产一般采用真空冷冻干燥法，因此要求优选菌株必须有较强的抗冷冻干燥 能力。 获得菌株能够大量生长的增殖培养基是制备高效浓缩型直投式发酵剂的前提，采用真 空冷冻干燥技术制备发酵剂，工艺要求生长培养基选择必须基于原料易得、价格低廉、菌 体细胞产量高，同时容易分离收获细胞。路邓葡萄球菌属于化能异养型微生物，它缺乏对 许多有机化合物的合成能力，必须由外界提供多种营养物质才能良好的生长、发育。因此 对培养基的营养要求比较苛刻。其增殖培养基除了含有碳源、氮源、无机盐等营养因子外， 还应含有一定的促生长因子。因此，增殖培养基应具有如下特点：适合菌体生长，繁殖 速度快，在较短时间内可得到大量高活力细胞；菌体与培养基易分离；成本低廉，最 好能反复利用。刘云鹤等( 2 0 0 2 ) 2 5 - 2 6 1 研究结果表明，肉品发酵剂增殖培养基的最佳配方是 2 蔗糖、o 5 蛋白脉、1 0 大豆粉、o 5 玉米浸提液，添加0 5 的磷酸氢二钾可以促进乳 酸菌的增殖，于3 7 5 培养1 7 h 后收获菌体，植物乳杆菌的菌体细胞浓度可达4 5 5 l o g c f u m l , 熊晓辉( 2 0 0 4 ) 2 7 1 优化了乳酸菌发酵高密度培养基为葡萄糖：乳糖( 1 ：1 ) 2 、牛 肉膏1 0 9 6 、缓冲盐a 0 5 ，氯化钠0 2 5 、硫酸镁0 1 ，p h 值自然，此培养基增菌效果明 显，但缓冲盐的具体配方未列出。本试验中选择的蕃茄营养丰富，有文献显示1 2 钉，每百克 蕃茄中含糖2 2 9 ，维生素b 。0 0 3 m g ，维生素b ：o 0 2 m g ，尼克酸0 6 m g ，维生素c 1l m g 、胡 萝卜素0 3 l m g ，钙8 m g 磷3 7 m g ，铁o 4 m g ，此外还有锰、铜、碘等要微量元素。严维凌 u o 等采用两歧双歧杆菌等发酵以番茄汁为主的的蔬菜汁，取得了良好的效果。孟样晨【3 i 】 等在优化青春双歧杆菌增菌培养基时，加入了5 番茄汁，培养基增菌效果明显。因此， 根据我国国情及低酸发酵肉制品发酵剂培养条件，积极寻求来源广泛、经济易得的廉价原 料，优化筛选适合肉制品发酵剂菌株增殖的促生长因子 3 4 - 4 羽。由于时间有限，只能对部分 生长因子进行了试验，本试验主要是从菌株生长所需的各种促生长因子方面对菌体细胞进 行增殖培养。本研究对路邓葡萄球菌进行细胞生长试验，结果显示，菌株在增菌培养基中 培养细胞产量达5 1 6 l o g c f u m l 以上，增殖效果显著。 同样，培养条件 a g - 5 2 】( 接种量、初始p h 值、培养温度、溶氧情况等) 也是影响菌株 生长的重要因素，菌株在最适条件下培养能够提高生物量，所以有必要对试验菌的生长条 件进行研究。 扬州大学硕士学位论文 接种量大小会影响目的菌株的生长繁殖。较大的接种量有利于缩短菌体繁殖达到高峰 的时间，接种量过大将会带进过多的有害代谢产物，且会使营养成分消耗过快，影响菌体 后期的生长以及产物的合成。本试验中确定最佳接种量为2 。每种微生物都有自己的p h 值适应范围。微生物细胞对p h 值的改变是很敏感的，环境中氢离子浓度如果超过了微生 物的适应范围，就会抑制这些微生物的生命活动。为了确定菌株适宜的p h 值范围，加快 菌体细胞的生长繁殖，本试验测定了菌株在不同初始p h 值的培养基中的菌体浓度变化， 确定p h 为6 5 为最佳初始p h 值。温度也是影响生物有机体代谢活动的重要因素之一。由 于生物体的生命活动可以看作是连续进行的酶反应，其任何一个反应都与温度有关。通常， 在生物学范围内每升高l o ，生长速度就加快一倍，当超过最适生长温度，生长速率随 温度升高而下降。每种微生物都有不同的最适生长温度，同种微生物在不同培养基中生长 的最适温度也有差别。因此在其他条件一定的情况下，选择一个适宜的培养温度，对细胞 的增殖培养及应用有重要意义。试验菌的最佳培养温度为3 5 。装液量和摇床转数主要 改变溶氧量来影响菌株生长，本试验中确定的装液量和摇床转数分别为5 0 m l ( 2 5 0 m l ) 、 1 5 0 r m i n 。 菌体细胞的收获一般在对数生长末期或稳定期进行，所以有必要对菌株在最佳生长下 的生长情况进行测定，结果表明1 8 2 0 h 为路邓葡萄球菌的最佳收获期。 2 5 本章小结 1 以m s a 培养基作为基础培养基，通过单因素试验研究了路邓葡萄球菌的增殖培养基 成分，确定作为试验菌株较好的增殖因子为酵母膏、番茄汁、吐温8 0 、c a c 0 3 。 2 通过进一步正交试验确定了各成分之间的配比，增殖培养基的组成为：在m s a 基础 培养基中添加1 5 酵母膏、0 5 吐温8 0 、3 0 9 6 番茄汁、0 2 c a c o ，按此组合配制的培养 基增菌效果可达5 1 6 x1 0 9 c f u m l 。 3 确定了发酵菌株的最适培养条件：接种量2 、初始p h 值6 5 、温度为3 5 。c 、装液 量5 0 m l ( 2 5 0 i i l l ) 、摇床转数1 5 0 r m i n 。 4 对路邓葡萄球菌在增殖培养基中最佳培养条件下的生长变化曲线进行了测定，确定 发酵1 8 - 2 0 小时可为发酵最佳收获期，此时细胞积累量最大。 夏小伟：香肠干粉发酵剂的制备研究 第三章收集浓缩条件及生物保护剂的选择研究 3 1 引言 2 1 发酵剂制备的关键需要有良好的收集浓缩条件，生物保护剂的选择尤为重要，为了达 到合乎要求的含菌量，必须把菌体从培养基中收集起来，通过离心，浓缩成适于冷冻干燥 的悬浮液，而且这样可使菌体与代谢物中产生的毒物分开，对提高冷冻干燥存活率有益。 在4 条件下，以离心转数和离心时间为参数选择最佳离心条件。 菌体细胞浓缩物在冷冻干燥过程中，由于细胞内外水分结冰对细胞膜造成较大的损 伤，菌体细胞死亡率很高，得不到浓缩菌体细胞的目的。因此，我们试图寻找一种介质， 将菌体细胞悬浮在该介质中，可以减缓冷冻对细胞的损伤作用。 3 2 材料与方法 3 2 1 实验材料 3 2 2 1 菌种 路邓葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sl u g d u n e n s y s ) 由本实验室保藏 3 2 1 2 原料与试剂 牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乳糖、蛋白胨、吐温8 0 、甘露醇、甘油、抗坏血酸( v c ) 、l 一 谷氨酸钠、谷胱甘肽( g s h ) 3 2 。1 3 培养基 见2 2 1 3 ； 3 2 1 4 主要仪器 生化培养箱：s p x - 2 5 0 b - z ，上海博迅实业有限公司 水平流超净工作台：z h j h 一2 1 0 9 3 ，上海智城分析仪器公司 p h s - 3 c 型精密p h 计：上海精密科学仪器有限公司 5 8 0 4 r 型冷冻离心机：德国e p p e n d o r f 公司 电子天平：赛多利斯中国有限公司； 扬州大学硕士学位论文 3 2 2 试验方法 3 2 2 1 菌种活化、传代、纯化与接种扩培 3 2 2 2 菌种保藏 见2 2 2 2 3 2 2 3 活菌计数 见2 2 2 3 3 2 2 4 菌体的冷冻干燥工艺 见2 2 2 5 3 2 2 5 冻干存活率的计算 见2 2 2 4 3 2 2 6 菌体细胞离心浓缩分离参数的选择 将经过两次活化的路邓葡萄球菌以2 的接种量接种于优化的增殖培养基中培养，即 m s a + i 5 酵母膏、0 5 吐温8 0 、3 o 番茄汁、0 2 c a c 0 3 ，按照最适培养条件，即3 5 恒温培养1 8 h ，将茵悬液移入无菌的离心管中，分别采用不同离心转数、离心时间浓缩分 离菌体细胞，检测离心前初始活菌数、离心后沉淀中活菌数，计算离心收得率，从而选择 最佳的离心参数。 3 2 2 7 冻干保护剂及其复合配方的优化筛选 菌株细胞浓缩物在真空冷冻干燥过程中，由于细胞内外水分结冰会对细胞造成较大的 损伤，增大了细胞死亡率，影响菌体细胞的浓缩效果。本试验对冻干保护剂进行研究及其 复合配方的优化筛选，提高冷冻干燥后浓缩型发酵剂的活菌含量，制备高效浓缩型冻干发 酵剂。 ( 1 ) 悬浮基质及其浓度的选择 分别选择1 0 0 5 脱脂乳、1 0 9 6 蛋白胨、1 0 0 5 可溶性淀粉作为备选的大分子保护剂，以生理 盐水为对照，按照冻干工艺将试验菌进行冷冻干燥，比较这三种物质对试验菌的保护效果。 夏小伟：香肠干粉发酵剂的制备研究 脱脂乳浓度的选择：分别配置6 、8 、1 0 、1 2 、1 4 浓度的脱脂乳保护剂，按照冻 干工艺将试验菌进行冷冻干燥，比较这五种不同浓度的脱脂乳对试验菌的保护效果。 ( 2 ) 单因子冻干保护剂的筛选 分别加入不同种类的单因子制成保护剂，将浓缩好的菌体细胞与保护剂等量混合均匀 装入小瓶，进行真空冷冻干燥，检测冻干前后的活菌数，计算冻干存活率。 ( 3 ) 菌株复合保护剂配方的优化 以上述试验筛选出的单因子保护剂为因素项，以添加量为水平项设计l 9 ( 3 4 ) 正交试 验，配制出9 种复合保护剂配方，优化筛选葡萄球菌复合保护剂。检测冻干前后活菌数， 确定葡萄球菌的复合保护剂。 3 2 2 8 冻干发酵剂的贮存试验 冷冻干燥后的菌粉立刻封好口，分别在常温、4 c 、- 2 0 c 及真空和常压两个状态下储 藏，研究发酵剂保存过程中菌数变化。 3 3 结果与分析 3 3 1 菌体细胞浓缩分离条件的选择 菌体细胞的浓缩分离是制备高效浓缩型冻干发酵剂的重要中间环节。浓缩分离的方法 有超滤和离心。研究表明，超滤效果优于离心，但离心比超滤操作简便、设备清洗和消毒 方便、不易污染，其应用较超滤普遍。 为了达到合乎要求的菌细胞浓度，缩短冷冻干燥时间、提高冻干存活率，必须把菌体 细胞从培养基中收集浓缩出来，通过离心可以浓缩成适合冷冻干燥的菌悬液，而且还可以 分开菌体细胞和代谢毒物，提高菌体细胞的冷冻干燥存活率。 将试验菌路邓葡萄球菌经m s a 培养基活化两次后，接种于优化的增菌培养基中，3 5 恒温培养1 8 h ，分别采用不同的离心转数、离心时间浓缩分离菌体细胞，检测离心前初 始活菌数、离心后活菌数，计算离心收得率，通过研究离心转数、离心时间等因素对试验 菌的离心收得率的影响，寻求获得较高菌体收得率的离心参数。结果见表3 1 扬州大学硕士学位论文 表3 - 1 离心转数和离心时间对路邓葡萄球菌离心收得率的影响 t a b 3 - 1t h ee f f e c t so f e e n t r i f u g i n gf o r c ea n dt i m eo nt h eh a r v e s t i n gr a t e so f s t a p h y l o c o c c u sl u g d u n e n s i s 注：同一参数的均值后标注小同的字母存在显著差异( p 甘露醇( a ) 甘油( d ) 蔗糖( c ) ；最优复合冻干保护剂为6 号，其配比为：a 2 8 3 c 1 d 2 ，即 以8 n f m 为悬浮基质添加1 0 甘露醇+ 1 5 l 一谷氨酸钠+ 5 蔗糖+ 1 0 甘油，冻干后的细胞存 活率达到为8 9 6 6 。 3 3 3 冻干发酵剂保藏条件的选择 将真空冷冻干燥后的浓缩发酵剂分别在室温、4 c 、一2 0 。c 及真空和常压两个状态下贮 藏，定期检测其活茵数，其贮藏结果见表3 5 。 表3 - 5 发酵剂保存过程中菌数变化( 1 0 1 1 c f u g ) t a b 3 - 5t h ec h a n g eo fb a c t e r i u mc o u n td u r i n gc o n s e r v a t i o n 保存条什原菌数 一个月两个月 真室温 4 9 84 2 5 3 9 7 4 4 9 84 5 3 4 2 9 空 - 2 0 4 9 8 4 6 54 4 5 常室温4 9 8 3 6 83 1 9 4 4 9 83 9 63 3 2 压 一2 0 4 9 84 0 4 3 3 6 夏小伟：香肠干粉发酵剂的制备研究 2 9 由表3 - 5 可知，冻干菌粉发酵剂在室温、4 和- 2 0 c 条件下贮藏时，发酵剂中活菌数 均呈下降趋势，但在测试期内干粉发酵剂的活菌数仍在1 0 c f u g 水平，真空包装条件下 菌数要高于常压保存；一2 0 c 的保存条件效果略优于4 c ，但二者差别不大，常温保存条 件菌数相对较低，从生产应用及降低成本综合考虑，发酵剂应保存在真空，4 c 左右的条 件下。 3 4 讨论 菌体细胞的分离技术是制备高效浓缩型冻干发酵剂重要的中间工艺环节。离心浓缩分 离细胞是收获菌体的简便方法，被多数研究者采用。通过离心试验，研究影响菌体离心存 活率的主要因素，一方面，尽量减少残留在上清液中的细胞；另一方面，改善离心力机械 作用所造成的伤害，避免细胞死亡，寻求获得活细胞最高收得率的最佳离心条件。如果离 心工艺掌握不当，菌体死亡率和损失率随之增高，使活菌收得率大大降低，直接导致发酵 剂的活菌含量下降。本试验研究了离心转数、离心时间对离心收得率影响，确定路邓葡萄 球菌的最适离心条件为：1 0 0 0 0 r m i n ，l o n i n 。在该最适条件下离心，试验菌株的离心收得 率为9 6 7 8 。 对于绝大多数菌的冷冻干燥成功的关键在于有效保护剂的使用，保护剂可以改变生物 样品冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保 持原有的各种生理化学特性和生物活性。为了提高菌种冻干后的存活率，加入保护剂是必 须的，明确冻干保护剂的保护机理可以使我们有针对性的选择适宜的保护措施陋5 9 1 。 脱脂奶粉、可溶性淀粉等高分子保护剂，能溶于水溶液可呈过冷状态，即在冰点以下 的相同温度下该溶液中的溶质( 电解质) 浓度较小，蛋白质的盐析变性也较少，另外，它们 能减少细胞暴露于氧气和介质中的面积，同时在菌体表面形成保护层，减少由于细胞壁损 坏而引起的胞内物质泄漏，从而起到保护作用 6 0 l 。干燥时，乳清蛋白能在菌体外形成蛋白 膜，对细胞加以保护，并可以固定冻干的酶类，防止由于细胞壁蛋白质损坏而引起的胞内 物质泄漏。甘油、低分子糖和醇【6 1 1 等，它们具有5 个以上的羟基，可以与菌体表面自由基 联结起来，避免菌体暴露在介质中，还可与蛋白质形成氢键以取代水，保证了蛋白质的稳 定性；在溶液中它们易结合水分子，发生水合作用，减少了游离水的含量并增加了溶液的 粘性，从而减缓晶核的生长过程，使形成的冰晶较细小，以达到保护细胞的目的 6 2 , 6 3 t 。本 试验选择的1 0 种不同类型的冻干保护剂中，甘露醇、l 谷氨酸钠、蔗糖和甘油对试验菌 株的冻干保护效果较好，冻干存活率在3 0 以上。复合型的保护剂相对单一保护剂，冻干 3 0 扬州大学硕士学位论文 保护效果更好。通过对复合冻干保护剂的正交试验，确定试验菌株的最优复合冻干保护剂 配比为以8 脱脂奶粉为悬浮基质添加1 0 甘露醇+ 1 5 l - 谷氨酸钠+ 5 蔗糖+ 1 0 甘油，冻干 后的细胞存活率达到为8 9 6 6 。 保藏条件是影响高效浓缩型冻干发酵剂贮藏稳定性的重要环境因素。由于冻干产品为 多孔疏松吸湿性很强的物质，因此生产上通常在真空状态下直接密封样品，或充入不活泼 气体如n 2 、c 0 2 等进行包装；因氧化反应、酶的活力和脂肪酸的氧化反应均有高度的温度 依赖性，故产品多在低温条件下保存，虽然采用一4 0 。c 进行冷冻保藏是一种成功的保存方 法，- 1 9 6 c 液氮冷冻是仍最好的冷冻保存方法。不过因提供液氮设备成本高，作为工业化 的保存方法还有待于考虑；产品在干燥和保存期间，会产生一些有害的过氧化物自由基， 致使细胞死亡，加入自由基的清除剂或抗氧化剂( 如谷氨酸钠) 可减轻这种伤害。目前，国 外商品化的高效浓缩型冻干发酵剂采用真空封存、4 c 冷藏，保藏期可达1 年以上。本文 利用筛选出的优良复合保护剂制成冻干发酵剂，以不同封存方式( 常压、真空封存) 进行包 装，在不同温度( 室温、4 c 、一2 0 ) 下贮藏，定期检测冻干发酵剂的活菌数，确定冻干发 酵剂的保藏条件为：真空，4 c 左右的条件下活菌数下降最少。 3 5 本章小结 1 通过对离心转数和时间的考察，最后确定低温高转速对保护菌体有利，选择 1 0 0 0 0 r m i n 、l o m i n 作为最终离心条件，在该最适条件下离心，试验菌株的离心收得率为 9 6 7 8 。 2 比较了不同悬浮基质及其浓度对菌体细胞冻干存活率的影响，确定选择8 的脱脂 乳作为试验菌的悬浮基质。 3 冻干保护剂在冷冻干燥过程中菌体细胞的损伤具有一定的保护作用，本试验选择的 1 0 种不同类型的冻干保护剂中，甘露醇、l 一谷氨酸钠、蔗糖和甘油对试验菌株的冻干保 护效果较好，冻干存活率在3 0 以上。 4 复合型的保护剂相对单一保护剂，冻干保护效果更好。通过对复合冻干保护剂的正 交试验，确定试验菌株的最优复合冻干保护剂为6 号，其配比为：a 2 8 3 c 1 d 2 ，即以8 n f m 为悬浮基质添加1 0 甘露醇+ 1 5 l - 谷氨酸钠+ 5 蔗糖+ 1 0 甘油，冻干后的细胞存活率达到 为8 9 6 6 。 5 冻干菌粉分别在常温、4 、一2 0 及真空和常压两个状态下储藏，研究发酵剂保存 过程中菌数变化，结果表明发酵剂保存在真空，4 c 左右的条件下活菌数下降最少。 夏小伟：香肠干粉发酵剂的制备研究 4 1 引言 第四章冻干发酵剂在发酵香肠中的应用 3 l - 一 冷冻干燥法生产的发酵剂以其活菌存活比例高、接种量小成为干燥发酵剂菌种的方法 中最具有潜力的方法，其单位剂量的活菌数和液体发酵剂中活菌数在同一数量级( 即活菌 损失极小) 。 本章采用试验筛选的路邓葡萄球菌菌株按照前面工艺进行增殖培养、离心收集、添加 保护剂制成冻干发酵剂生产发酵香肠，与自然发酵和液体发酵剂进行比较，探讨发酵香肠 的生产过程中香肠p h 值、a w 值和挥发性物质组成的变化和差异，结合感官评价对冻干发 酵剂的生产给予理论基础。 4 2 材料与方法 4 2 1 材料 4 2 1 1 试验菌株 路邓葡萄球菌( s t a p h y o c o c c u sl u g d u u e n s j s ) 由本实验室保藏 4 2 1 2 培养基 增殖培养基( 配方同第二章) 4 2 1 3 主要试剂 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、吐温一8 0 、琼脂、d 一甘露醇、