【doc】微柱高效液相色谱法测定大鼠脑微透析液中的乙酰胆碱和胆碱.doc

微柱高效液相色谱法测定大鼠脑微透析液中的乙酰胆碱和胆碱2004年1月january2004色谱chinesejournalofchromatographyvo1.22n0.13335微柱高效液相色谱法测定大鼠脑微透析液中的乙酰胆碱和胆碱贾兴元,吴安石,岳云,刘敬忠(首都医科大学附属北京朝阳医院,北京100020)摘要:用所建立的微柱高效液相色谱分离,柱后固定化酶反应器酶解,电化学检测器检测的方法,对用不同浓度异氟醚麻醉前后的大鼠脑微透析液中的乙酰胆碱和胆碱的浓度进行了测定.在乙酰胆碱和胆碱的浓度为102000nmovl时,其浓度分别与各自相应峰高的线性关系良好,两者的检测限(以信噪比为3计)均可达5nmol/l.微透析液中乙酰胆碱和胆碱的含量在大鼠清醒时最高,随着异氟醚吸人浓度的增加,乙酰胆碱和胆碱含量明显降低在大鼠海马和脑皮层中乙酰胆碱浓度的降低与大鼠吸人异氟醚的浓度相关(p<0.05).研究结果表明,异氟醚麻醉剂抑制大鼠大脑皮层和海马中乙酰胆碱的释放程度与其剂量有关.关键词:高效液相色谱法;微柱;固定化酶反应器;乙酰胆碱;胆碱中图分类号:0658文献标识码:a文章编号:10008713(2004)o1003303microborehighperformanceliquidchromatographicmethodformeasuringacetylcholineandcholineinmicrodialysatesfromratbrainjiaxingyuan,wuanshi,yueyun,liujingzhong(beijingchaoyanghospitalaffiliateofcapitaluniversityofmedicalsciences,beffing100020,china)abstract:acetrlcholine(ach)andcholine(ch),twoimportantneurotransmitters,invivomicrodialysatesobtainedfromhippocampusandfrontalcortexofratsweremeasuredbymicroborehighperformanceliquidchromatographywithelectrochemicaldetectioncombinedwithapostcolumnimmobilizedenzymereactor.goodlinearrelationships(=0.990and0.991)betweentheconcentration(102000nmol/l)ofachandchinjectedontothecolumnandpeakheightwerefound.thelevelsofachandchwerefoundthehighestdudngthepedodofwakefuiness,andbecameincreasinglylowerduringanesthetizedperiodsduetotheincreasedconcentrationsofinhaledisoflurane.goodcorrelationbetweenthedecreaseinconcentrati0nofachinhippocampusandfrontalcortexofratsandtheconcentrationofinhaledisofluranewasfoundfp<0.05).theresultsindicatethatisofluraneinducedadosedependentdecreaseinconcentrationofachintherathippocampusandfrontalcortex.keywords:highperformanceliquidchromatography;microborecolumn;immobilizedenzymereactor:acetylcholine;choline乙酰胆碱(ach)是中枢神经系统主要的兴奋性递质之一,参与调节多种神经功能,如意识,学习和记忆等.研究表明,中枢胆碱功能的异常可导致多种疾病,如老年痴呆症等.此外,全身麻醉药对乙酰胆碱系统的影响是其产生麻醉作用的机理之一.但是ach从突触前膜分泌后,就迅速地被胆碱酯酶分解,导致细胞外液中ach的含量极低,而且由于ach和胆碱(ch,它既是合成ach的前体,也是ach的代谢产物)分子中都没有生色基团,荧光基团和电活性基团,所以对它们的分析检测很困难.过去1o年间,文献报道了多种检测ach的方法,但灵敏度令人不甚满意一.微柱电化学检测法是一种灵敏度较高的方法,用其来检测ach可以获得满意的结果.本文报道了我们所建立的微柱高效液相色谱(hplc)一柱后固定化酶反应器(imer)一电化学检测(ed)法,并将其用于测定用不同浓度异氟收稿日期:2oo3ll3作者简介:贾兴元,男,助理研究员,硕士,主要研究方向为分子生物学和药物学,tel:(010)85231375,e-mail:jxingyuan163?corn?34?色谱第22卷醚麻醉前后的大鼠不同脑区微透析液中ach和ch的浓度.1实验部分1.1仪器和试剂hplc仪为美国beckman公司产品,带p一125泵,六通进样阀,接20l进样环.微型actvch多聚分析柱(530mm1mmi.d.,颗粒大小10m)及柱后imer(55mm1mmi.d.,颗粒大小10m,含有乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶,多聚材料作为载体)由美国bas公司提供.检测器为美国bas公司lc-4c安培型电化学检测器,铂金工作电极,ag/agc1参比电极.数据的采集,储存,处理和打印均在色谱工作站(色谱资料分析软件为beckman公司提供的goldnouveauchromatographydatasystemversion1.7)上完成.微透析所用的主要仪器有:立体定位仪(美国bas公司),微量注射泵(cma/102,瑞典cma/microdialysis公司),微透析探针(cma/10,瑞典cma/microdialysis公司)(透析内径0.05mm,长1mm,能通过最大分子的相对分子质量为20000),冷藏自动收集器(cma/170,瑞典cma/microdialysis公司).标准品ach盐酸盐(achc1),标准品ch盐酸盐(chc1)和防腐剂proclin由bas公司提供,乙二胺四乙酸(edta)等其他试剂为国产分析纯.1.2色谱条件等度洗脱的流动相组成为含有0.005%(质量分数)proclin,50mmol/lnail,po,0.5mmol/lna2edta的溶液,用naoh调ph至8.50,流速为130l/min.参比电极的电位设置为+500mv,灵敏度为5nafs.色谱分析在室温(25)下进行.1.3标准储备液的配制精确称取achc135.3mg,chc127.9mg,分别溶于100.00ml含0.005%proclin的0.05mol/l乙酸标准稀释液(用稀naoh调ph值为5.3)中.再从中分别取1.00ml,均用标准稀释液稀释至50.00ml,制成各自的标准储备液(40mol/l).1.4标准曲线的制备将10.o0ml的ach标准储备液与l0.00ml的ch标准储备液混合(浓度为20mol/l),精确加入前述标准稀释液,配成10,40,100,400nmol/l和2mol/l的混合标准工作溶液系列,分别用0.22m滤膜过滤,进样10l.1.5微透析液样品的采集将体重为300350g的5只雄性spraguedawley大鼠用异氟醚麻醉后,固定在鼠立体定位仪上,并继续令其吸入2%(体积分数,以下同此)异氟醚.以大鼠囱门为零点植入微透析导引管,插入大鼠大脑皮层的坐标为:往前1.5mm,往右2.0mm,深度1.0mm;插入其海马的坐标为:往后8.5mm,往右4.5mm,深度3.0mm.术后第3天开始实验.实验时将微透析探针插入到导引管中,灌注ringer氏液(组成为nac1147mmol/l,kc14.0mmol/l,cac122.2mmol/l,内含新斯的明10mol/l),流速为2l/min.平衡2h后用冷藏自动收集器(4oc)收集样品.对每只自由活动大鼠,每间隔20min收集一次,每次持续l0min,共收集3次.将3次测定的结果取平均值作为基础值:然后,再将这5只大鼠用异氟醚麻醉后,调整其吸入异氟醚的浓度依次为0.6%,1.0%和1.4%,每一浓度下平衡20min后各收集一管.停止吸入异氟醚1h后再各收集一管.取样后立即进样10l测定:2结果与讨论(1)有关微柱hplc一柱后imered法分析ach和ch详细的机理和适宜条件已有报道.:样品中的ach和ch经前述分析柱分离后,在含有乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶的imer中,ach被水解为ch,水解产生的ch和样品中原有的ch先后被氧化生成过氧化氢后在检测池中被检测,用外标法进行定量.图1为标样和样品中ach和ch的色谱图.由图1可知几乎没有其他杂质峰的干扰(2)以乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶的浓度l,分别对其峰高进行线性回归,结果发现,在浓度为102000nmol/l时,ach的回归方程为y=5.23510x(r=0.990),ch的回归方程为y=5.35410.x(r=0.991).最低检测限(以信噪比为3计)均可达5nmol/l.用该方法分析ach和ch,其灵敏度明显高于生物分析法,放射免疫分析法,气相色谱火焰离子检测法,气相色谱一质谱联用法和常规柱的hplced法.常规柱hplced法分析ach和ch的检测限也只达到50fmol/l(在进样20l的条件下):.(3)imer中乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶的活性都比较高,能充分转变底物成过氧化氢,因此本实验可在室温条件下进行.对于一个新的酶柱而言,提高柱温作用不大,但当酶柱接近失效期时,提高柱温至3537可以延长它的有效时间.由于细菌产生的酶可以使过氧化氢很快被清除,因此在整个分析过程中,要始终注意除菌和防止细菌的生长,第1期贾兴元等:微柱高效液相色谱法测定大鼠脑微透析液中的乙酰胆碱和胆碱?35?以免因细菌的繁殖而影响检测结果.该方法重复性良好,我们在室温条件下5次进样l0nmol/l的ach和ch标准溶液,测得的相对标准偏差(rsd)分别为6.9%和6.7%;而5次进样100nmol/l的ach和ch标准溶液,测得的rsd分别为2.4%和2.1%.微透析探针在室温条件下,对体外ach和ch的回收率(:5)分别为(71.33.7)%和(64.54.6)%.用不同浓度异氟醚麻醉大鼠后,其大脑皮层和海马微透析液中ach和ch的变a12a/l,1ool5,/min化测试结果见表1.在本实验条件下测得的自由活动大鼠的ach和ch的清醒基础值与前人在相近条件下所得的结果基本一致.大鼠海马和大脑皮层微透析液中ach和ch的水平在自由活动状态下明显高于异氟醚麻醉状态下的水平,并且随吸入异氟醚浓度的增加而逐渐降低,在停止吸入1h后逐渐恢复,但未恢复至基础水平.本研究表明,异氟醚麻醉剂抑制大鼠大脑皮层和海马中ach的释放程度与其剂量有关.o0l52o,/min图1乙酰胆碱和胆碱的色谱图fig.1chromatogramsofacetylcholine(ach)andcholine(cha.mixturestandards;b.micr0dialysatefromanesthetizedrats.iach:2.ch.表1被不同浓度异氟醚麻醉的大鼠的大脑皮层和海马微透析液中ach和ch的变化(均值标准差)(n:6)table1contentsofachandchinmicrodialysatesfromhippocampusandfrontalcortexofratsanesthetizedbydifferentconcentrationsofisoflnrane(meansd)(n=6)nmol/l参考文献:2345tsaith.jchromatogr,b:biomedsciappl,2000,747(1?2):1】yeweiling,maxiaofeng,meizhentong.chinesejournalofchromatography(叶惟泠,马晓峰.梅镇彤色谱),1998,l6(5):375tsaith.chencf.neuroscilett.1994,l66(2):l75yasumatsum,yazawat,otokawam,kuwasawak,hasegawah.iiharay.compbiochemphysiol,parta:molintegrphysio1.1998.12la(1):l3carteraj,kehrj.jchromatogr,b:biomedsciappl,l997.692(1):207678910shiyl,chenwybrainres,l999.850(12):l73marrosuf.porlasc,masciams,casuma.fam.gi?agheddum.imperatoa,gessagl,brainr