（遗传学专业论文）鹅黑素皮质素受体4基因的克隆及其多态性研究.pdf

摘要 黑素皮质素受体4 ( m c 4 r ) 在哺乳动物中可与瘦蛋白、神经肽y 、q 黑素细胞 刺激素等一起调节动物体重和能量平衡，在禽类的表达与其采食和体内脂肪沉积具有 密切关系。 本研究将m c 4 r 基因作为影响鹅脂肪沉积的侯选基因，通过比较基因组学的方 法，克隆并测序鹅m c 4 r 基因编码区序列，对其进行序列分析和m c 4 r 氨基酸残基 的特性参数分析；选用限制性内切酶h i n f l 和t a q i 检测m c 4 r 基因的r f l p ；建立不 同基因型与鹅重要经济性状之间的关联分析模型，分析不同基因型与鹅重要经济性状 的相关性。 1 首次克隆出鹅m c 4 r 基因编码区序列，其完整的编码区序列长度为9 9 6 b p 。序列 在g e n b a n k 上登录，收录号为d q 4 8 2 5 8 2 。 2 核苷酸序列分析表明：鹅与鸡的m c 4 r 基因同源性最高( 9 5 3 1 ，与其它物种的同 源性在7 5 7 9 之间；构建核苷酸进化树，发现禽类较早地与哺乳类动物分化开来， 灵长类、食草类动物以及食肉类动物之间在分化上表现出明显的特异性。 3 鹅m c 4 r 基因编码3 3 1 个氨基酸，分析该段蛋白质的氨基酸组成，比较不同物种 之间的氨基酸序列的同源性，结果表明：鹅与鸡的同源性最高，与哺乳类和鱼类次之。 4 对鹅m c 4 r 基因密码子使用策略分析显示：不同的氨基酸在该区域采用不同的密 码子使用策略，a l a 偏爱使用g c a ，a r g 使用a g g 、c g c 和c g g ，g l y 使用g g c 和g g g ，l e u 使用c u c 和c u g ，p r o 使用c c u ，显示出密码子使用的非随机性。 比较鹅与其它物种的密码子使用策略的相似性，发现鹅与鸡的密码子使用频率的相似 系数较高( 0 8 0 1 ) ，与人的相似系数为o 6 3 0 ，与其它几种动物的相似系数仅为0 5 加。6 之间，显示出物种之间采用不同的密码子使用策略。 5 分析鹅m c 4 r 氨基酸的亲水性、相应区域位于表面的概率以及电荷密度，结果显 示，m c 4 r8 个亲水性区域和7 个疏水性区域以及正负电荷密度和氨基酸残基位于表 面的概率表现出交替性出现的规律。 6 分析h i n f l 酶切位点产生的不同基因型( a a 型和a b 型) 与生产性能之间的关联性， 结果表明：仅a a 型对提高屠体重、半净膛重和全净膛重具有极显著的效应( p o 0 1 ) ， 对肌胃率和腹脂率具有显著的负效应( - 2 0 0 8 和2 ，2 1 4 ) ，对提高肝脏重和心脏重的效应 也达到了显著水准( p o 0 5 ) ，a a 型对降低胸肌失水率具有显著的效应( p 0 0 5 ) 。 关键词：鹅，m c 4 r ，序列分析，同源性，r f l p a b s t r a c t m e l a n o c o r t i nr e c e p t o r - 4 ( m c 4 r ) c a l l c o o p e r a t ew i t hl e p t i n , n e u r o p e p t i d eya n d m e l a n o e y t e s t i m u l a t i n gh o r m o n et or e g u l a t eb o d yw e i g h ta n df e e d i n gi nm a m m a l s i n p o u l t r y ，m c 4 rg e n ee x p r e s s i n gh a dac l o s er e l a t i o n s h i pw i t hb o d yf a td e p o s i t i n g i nt h i ss t u d y , m c 4 rg e n ew h i c hr e l a t e dt of a td e p o s i t i n gw a ss e l e c t e da sc a n d i d a t e g e n e b yg e n o m ec o m p a r i s o n , t h eg o o s em c 4 rg e n ew a sc l o n e d a n ds e q u e n c e d m e a n w h i l e ，t h em c 4 rg e n es e q u e n c ea n dt h ea m i n oa c i dr e s i d u e sw e r ea l s oa n a l y z e d t h e r f l po fg o o s em c 4 rg e n ew e r ed e t e c t e du s i n gt h er e s t r i c t i o ne n z y m e st a q ia n dh i n f l ， w h i c ha s s o c i a t i o nw i t hi m p o r t a n te c o n o m i ct r a i t si ng o o s ew a sa n a l y z e d t h er e s u l t sa s f o l l o w s ： 1 t h eg o o s em c 4 r g e n ew a sc l o n e da n ds e q u e n c e d t h ee d n al e n g t ho ft h eg e n ew a s 9 9 6 b p ，a n dt h es e q u e n c eh a db e e ns u b m i r e dt ot h eg e n b a n k ，a c c e s s i o nn o ：d q 4 8 2 5 8 2 2 s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eh o m o l o g yb e t w e e ng o o s ea n dc h i c k e nw a s9 5 3 t h eh o m o l o g i e sb e t w e e ng o o s ea n do t h e ra n i m a l sw e r e7 5 t o7 9 t h ep h y l o g e n e t i ct r e e f l o r ad i f f e r e n ts p e c i e so fm c 4 rg e n es h o w e dt h a tt h ed i f f e r e n t i a t i o nb e t w e e nb i r d sa n d m a m m a l ss t a r t e de a r l y , a n dt h ed i f f e r e n t i a t i o na m o n gh e r b i v o r e ，p i g , p r i m a t ea n d s a r c o p h a g iw a se v i d e n ts p e c i f i c i t i e s 3 t h eg o o s em c 4 rg e n ec o d e d3 3 1a m i n oa c i d s t h ep r o t e i nc o m p a r e dw i t ho t h e r1 2 s p e c i e ss h o w e dt h a tt h eg o o s ew a sm o s tc l o s e l yr e l a t e dt oc h i c k e n ，a n dm o r ec l o s e l y r e l a t e dt om a m m a l sa n df i s h e s 4 n ec o d o n u s a g ef r e q u e n c yo f m c 4 rg e n ei ng o o s ew a sc a l c u l a t e d a n dt h ec o d o nu s a g e f r e q u e n c yw a sc o m p a r e dw i t ho t h e r1 2s p e c i e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea l ap r e f e r e dt o g c a ；a r gp r e f e r e dt oa g g , c g ca n dc o g ；o l yp r e f e r e dt og g c a n dg g g ；l e up r e f e r e d t oc u ca n dc u g ：p r op r e f e r e dt oc c u ；w h i c hs h o w e dt h en o n r a n d o m n e s so f c o d o nu s a g e c o m p a r i n gt h er e s u l t s ，c o n s p i c u o u sd i f f e r e n c ew a sf o u n di nt h ec o d o nu s a g eo fd i f f e r e n t s p e c i e s ，n l es i m i l a r i t yc o e f f i c i e n to fc o d o nu s a g eb e t w e e ng o o s ea n dc h i c k e nw a so 8 0 1 ， b e t w e e ng o o s ea n dm a m m a ls u c ha sh a m a n , w a so 6 3 0 a n d0 5 0 4 6 0b e t w e e ng o o s ea n d o t h e rs p e c i e s t h e s es h o w e dt h a td i f f e r e n ts p e c i e sh a dd i f f e r e n tc o d o nu s a g e 5 h y d r o p h i l i c i t y , a v e r a g ec h a r g ea n ds u r f a c ep r o b a b i l i t yo fa m i n oa c i dr e s i d u e so fm c 4 r i n g o o s ew e r ea n a l y z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eh y d r o p h i l i c i t y , a v e r a g yc h a r g ea n d s u r f a c ep r o b a b i l i t yo fa m i n oa c i dr e s i d u e sv a r i e dw i t hm c 4 rs e v e nt r a n s m e m b r a n e c h a r a c t e r i s t i c i i 6 b yp c r - h i n f l - r f l p , t w og e n o t y p e s ( a aa n da b ) w e r et e s t e di nw a n x iw h i t eg a n d e r x s i c h u a nw h i t eg o o s e ，r e s u l t so fa s s o c i a t i o na n a l y s i sb e t w e e nt h er f l pa n dt h et r a i t s s h o w e dt h a to n l ya ag e n o t y p eh a ds i g n i f i c a n t l ye f f e c t ( p 0 0 1 ) i ni n c r e a s i n gb o d yw e i g h t , h a l f - e v i s c e r a t e dw e i g h ta n de v i s c e r a t e dw e i g h t ，h a ds i g n i f i c a n t l yn e g a t i v ee f f e c t ( - 2 0 0 8 a n d 一2 2 1 4 ) i ns t o m a c h u sm u s c u l a r i sr a t i oa n da b d o m e nf a tr a t i o ，a l s oh a ds i g n i f i c a n t l y e f f e c t ( p o 0 5 ) i ni n c r e a s i n gl i v e rw e i g h th e a r tw e i g h t ，a ag e n o t y p eh a ds i g n i f i c a n t l y e f f e c t 0 0 5 ) k e yw o r d s ：g o o s e ，m e l a n o c o r t i nr e c e p t o r - 4 ，c l o n e ，s e q u e n c ea n a l y s i s ，h o m o l o g y , r f l p i i i 缩写词 i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：丝! 虱蕊 时间：。口7 年多月 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：杰丝塑夔 导师签名： 1 2 乙终 ? 砷年多月加日 时间：y 7 年z 月h 日 文献综述 黑素皮质素受体- 4 ( m e l a n o c o r f i nr e c e p t o r - 4 ，m c 4 r ) 是黑素皮质素受体5 个 ( m c i 5 r ) 家族成员之一，是由下丘脑腹内侧核( v e n t r o m e d i a ln u c l e u so f h y p o t h a l a m u s v m h ) 分泌的一种肽类物质【l j ，属g 蛋白耦联( g - p r o t e i n c o u p l e dr e c e p t o r s 。g p c r s ) 的跨 膜神经型受体【2 3 l 。在哺乳动物中，m c 4 r 已被证明是一个调节能量动态平衡的重要 的信号分子，可与其内源性配体a 黑色素细胞刺激素( a l p h a - m e l a n o e y t es t i m u l a t i n g h o r m o n e ，a - m s h ) 及拮抗剂a g o u f i 相关蛋i ! t ( a g o u f i - r e l a t e dp r o t e i n ，a g r p ) 的相互作用 一起调节食欲和能量代谢的作用【4 ，5 ，6 】。 l 黑素皮质素受体4 ( m c 4 r ) 的结构与功能的研究 1 1 早期的探索 m c 4 r 的内源性配体黑色素细胞刺激素与促肾上腺皮质激素( a d r e n o c o r t i c o t r o p i c h o r m o n e ，a c t h ) 等共同起源于同一个前体前阿黑皮素( p r o o p i o m e l a n o c o r t i n ，p o m c ) ， m s h 和a c t h 有部分的相同的氨基酸序列及某些相似的中枢功能【7 ，8 t 9 】。t a t r o 等在检测 中枢系统是否存在a c t h 受体时发现它们还能够结合于共同的受体，因此，专家们把 a c t h 和m s h 的共同受体称为黑素皮质素受体 1 0 , 1 1 1 。根据h n a t o w i c h 与t a t r o 等的研究结 果发现，中枢内表现出一定程度的异源性黑皮素配体结合特性，提示脑内可能存在多 种具有药理学特性的黑素皮质素受体 1 2 , 1 3 1 。r o s e l l i r e h f u s s 等用人m s h r 探针等与人 的基因组d n a 进行s o u t h e r n 杂交分析推测，黑皮素受体家族至少存在5 , - , 5 个成员【1 4 】。 迄今为止，研究已经发现5 个m c r 成员( m c i r - m c 5 r ) 1 5 1 ，m c 4 r 是其中之一。 1 。2 结构特点及生理分布 人类m c 4 r 基因是一个由9 9 9 个碱基对构成的单一外显子，编码3 3 3 个氨基酸1 1 6 1 。 m c 4 r 属g p c r s ，具有七次明显的跨膜结构【2 捌。其蛋白的n 一末端在细胞外，c 末端在 细胞内，每两个跨膜区形成一个袢区，m c 4 r 的结合区在跨膜区，通常在第3 5 和第7 跨膜段内。跨膜区是相当保守的，在同一类受体中几乎是相同的。研究表明n 末端和 c 末端的第三跨膜段和第二个胞内袢是与g 蛋白发生作用的重要位点【1 7 1 ，在第二、第 三胞内环和羧基末端存在蛋白激酶作用的磷酸化位点。l a g e r s t r o m 等f l s l 发现m c 4 r 在 1 m 2 和t m 3 之间可以插入金属锌，这和其他g p c r 相似；通过他们创造的m c 4 r 分子 模型发现t m 3 的旋转对于m c 4 r 的功能是重要的，推测结合位点的改变或氨基酸残基 的不同可能引起m c 4 r 功能的改变。 区别于m c r 家族其他成员的是m c 4 r 不存在于肾上腺皮质、毛囊及胎盘内【1 6 “虬”， 而是大量存在于中枢神经系统的各个区域中，包括：大脑皮质、丘脑、下丘脑、脑干 和脊索。m o u n t j o y 等【2 1 1 通过原位杂交技术发现大鼠脑内m c 4 r 在下丘脑腹内侧核 ( v m h ) 和弓状核，中央隆凸和内侧系带核分布高密度，而在下丘脑背内侧核和大脑前 区的分布密度较低，通过限制摄食可上调上述部位m c 4 r 密度，而摄食诱导肥胖可下 调受体密度。可见，m c 4 r 是神经组织特别是下丘脑中占优势的受体亚型，因此它被 认为在下丘脑食欲控制过程中起到关键作用。 1 3m c 4 r 生理功能及其作用机理 m c 4 r 的中枢神经体重调节功能主要为抑制摄食，导致血糖降低、低胰岛素和瘦 素水平，从而减少体脂，降低体重。通过对引起鼠肥胖的单突变基因o b e s e 、d i a b e t e s 和a g o u t i 的克隆和鉴定，增加了人们对能量稳态的了解。尤其是o b e s e 和d i a b e t e s 基因的 克隆，导致人的l e p t i n ( o b e s e 基因产物) 和l e p t i n 受体( d i n b e t e s 基因产物) 基因的发现和功 能阐明，从而提出了具有调控采食和代谢作用的神经通路一中枢黑素皮质素系统( t h e c e n t r a lm e l a n o e o r t i ns y s t e m ，c m s ) 2 2 - 3 1 。 c m s 包括前阿黑皮素原( p o m c ) 、神经肽y ( n p 、黑素皮质素拮抗物a g o u t i 相关 蛋1 刍( a g o u t i - r e l a t e dp r o t e i n ，a g r p ) 及黑素皮质素受体( m c r s ) t 3 2 。】。研究表明，c m s 在 采食行为、体重和能量稳态调控中具有重要作用，其中任何环节的异常都可能导致肥 胖。通过研究人的肥胖机理，作为能量平衡和体脂调节通路之一的m c 4 r 受体系统已 被阐明 3 4 - ”】。m c 4 r 受体系统是人类食欲下丘脑调节途经中比较靠后的一个环节，其 作用机理是：脂肪组织中分泌的瘦蛋i 刍( 1 e p t i n ) 4 0 l ，是反馈性抑制脂肪合成的激素，可 通过血脑屏障进人下丘脑弓形核，通过调节减少阿黑色素原( p o m c ) 的表达量，减少 p o m c 衍生的促黑素细胞激素m m s h ) 等神经肽类在下丘脑与其受体m c 4 r 结合，从 而启动抑制食欲的生理效应( t h e n , 1 9 9 6 ) 2 ”。因此当m c 4 r 基因突变时，通过m c 4 r 抑制食欲的过程被阻断，个体表现出极度肥胖。随后的实验发现合成的m c 4 r 激动剂 和抑制剂分别抑制食欲引起消瘦和促进食欲导致肥胖p “。而m c 4 r 基因敲除小鼠则表 现出极度肥胖【4 2 i ，进一步证实了m c 4 r 在食物摄取和体重调控方面的重要性。 1 4m c 4 r 信号系统的调节 1 4 1q m s h a m s h 起源于p o m c ，是m c 4 r 的内源性配体，介导生理性饱足信号。动物实验 表明，在小鼠脑室内注射a m s h 或其人工合成类似物能抑制摄食，而这个效应可被特 异的c 【一m s h 接抗物所阻断，提示内源性a - m s h 在食欲控制上有重要作用h 3 州胴。 1 4 2a g o u t i 蛋l 刍a g o u t i 相关蛋i 刍( a g r p ) a g o u t i 蛋白和a g r p 已被证实能刺激小鼠摄食。a g o m i 蛋白是由1 3 1 个氨基酸残基 组成的蛋白质，主要在毛发滤泡细胞中表达。在a g o u t i 基因位点自发突变的小鼠，由 于a g o u t i 蛋白在脑内异位表达，拮抗了m c 4 r 的作用，导致多食、肥胖及体长度的增 ) 3 f 1 1 4 6 4 ”。a g r p 是含1 3 2 个氨基酸的多肽，结构上与a g o u t i 蛋白同源，主要在下丘脑表 达。a g r p 是内源性m c 3 r 和m c 4 r 的拮抗物，在转基因小鼠中过度表达可导致多食 和肥胖，而在脑室内直接注射a g r p ，可明显增进小鼠食欲 4 8 , 4 9 , 5 0 】。 2 研究表明，使用对m c 4 r 具有更强选择性的拮抗剂( 如h s l 0 4 和h s 0 2 4 ) 增加了饱食 大鼠的白昼摄食量，如长期在脑室内注人这两种拮抗剂，随着摄食量的增加，大鼠的 体重逐渐增加而致肥胖】。在m c 4 r 调控的研究中，o o s t e r o m 等发现2 6 8 位密码子t y r 决定了激动剂与拮抗剂的共同选择性【5 2 i 。 1 4 3l e p t i n o b e s e 基因的表达产物瘦蛋i ；1 l e p t i n 作用于下丘脑的l e p t i n 受体，发挥调节能量平衡 的作用哪。l e p t i n 受体m r n a 在p o m c 和a g r p 神经元都高度表达口一。l e p t i n 通过增 j b m c a r 激活物a - m s h 及降低拮抗物a g r p 水平来调节m c 4 r 信号系统，且l e p t i n 在调 节p o m c 及a g r p 基因表达上起协同作用。 1 5m c 4 r 信号系统对代谢的影响 l e p t i n 通过刺激交感神经活性来介导解偶联蛋白的表达，后者介导棕色脂肪组织 产热，s a t o h 等研究表明m c 4 r 是这个过程中重要的中介物，因为通过中枢给予m c 4 r 拮抗物可抑制l e p t i n 介导的小鼠棕色脂肪组织中解偶联蛋白m r n a 表达，而l e p t i n 及m c 4 r 激动剂可刺激小鼠中的交感活性i ”1 。 为明确m c 4 r 对代谢的影响，m a r i e 等在小鼠中进行了一项对照研究。结果表明 m c 4 r 对代谢有调节作用，同时表明在m c 4 r 缺陷小鼠中，能量代谢缺陷是肥胖的主 要原因。该鼠在完：全抵抗l e p t i n 介导的进食抑制前，就对l e p t i n 介导的能量代谢不敏感， 提示多食可能是小鼠体重增加后抵抗l e p t i n 的抑制摄食作用所致。m c 4 r i i 起失小鼠比同 等体重的野生型小鼠氧耗量减少2 0 ，进一步证实了该假设嗍。在该项研究中还发现 l e p t i n 介导的解偶联蛋白反应可完全被中枢m c 4 r 拮抗剂s h u l1 9 所阻断，这与s a t o h 等 的结论一致，因此m c 4 r 可能在l e p t i n 介导的交感激活作用中是一个重要的中间参与 物。 人和小鼠在能量代谢及中枢黑皮素系统方面有许多类似，但人类m c 4 r 突变患者 中是否存在能量节俭尚不明确。近来研究表明，m c 4 r 突变的杂合子高加索人种基础 代谢率正常，但在印度，巴基斯坦个体m c 4 r 突变的纯合子或杂合子存在基础代谢率 降低【5 9 l 。 2 基因结构及多态性研究进展 2 1m c 4 r 的基因的克隆定位 随着分子生物学的发展，在脑内黑皮素结合位点研究取得进展的同时，m c r 基 因相继被克隆并被定位。1 9 9 2 年到1 9 9 3 年间陆续克隆了小鼠的m c r 基因系列 1 1 , 1 6 删， 随后g a n t z 等克隆出人的黑皮素受体m c 4 r ，他们进一步用荧光标记原位杂交的办法 将m c 4 r 定位于第1 8 号染色体( q 2 1 3 ) 1 6 l 。到目前为止，已有人( n m 0 0 5 9 1 2 ) 、猪 ( d q 3 8 8 7 6 7 ) 、牛( n m _ 1 7 4 1 1o ) 、狗( d q 0 8 4 2 1 0 ) 、小鼠( a y 4 0 1 1 0 8 ) 、大鼠( n o r w a yr a t ， 3 n m _ 0 1 3 0 9 9 ) 、鸡( a y 5 4 5 0 5 6 ) 、食蟹猴( a b 0 8 3 3 1 7 ) 、斑马鱼( d a n i or e d o ，z e b r a f i s h , a y l 6 1 8 5 0 ) 、河豚( a y 3 3 2 2 4 0 ) 、东方纯( a y 2 2 7 7 9 4 ) 和金鱼( a j 5 3 4 3 3 7 ) 等多种动物的 m c 4 r 基因被克隆。 2 2m c 4 r 基因的表达调节 c e c i l e 等在研究m c 4 r 基因启动子时，分析发现人脑显示m c 4 r 拥有两个主要转录 启始位点，分别在翻译启始密码子上游1 3 9b p 和4 2 6 b p ，和多个辅助转录启始位点， 从2 1 3 到3 6 6 b p 范围内。在主要转录启始位点上游3 3 b p 和9 4 b p 处分别发现一个似t a t a 盒和典型的c 从t 序列( 反义链上) ，而大多数g p c r 启动子少t a t a 盒和富含g c 。比较 小鼠和人m c 4 r 基因启动子的分析显示两个物种间只有信号传感器和激动剂的转录 位点、神经锌指反应单位和c 钆”盒是保守的【6 ”。此外，还发现以c a a t 盒开始的3 0 b p 的核酸序列在人和鼠是完全一致的，同样的结果出现在猪和大鼠之间。这些结果表明 m c 4 r 基因表达的调节至少涉及到此序列外的另一阻遏子，因为这些组织特异性阻遏 子的突变将导致m c a r 基因转录的增加，它们是不可能成为人类严重肥胖的原因。 2 3m c 4 r 结构特点与功能的关系 人m c 4 r 是膜两侧重要信号蛋白通路的核心成分，正常情况下，m c 4 r 与其配体 a - m s h 结合将启动g 蛋白耦联的信号系统，活化腺苷酸环化酶，引起细胞内c a m p 上 升，介导细胞的一系列生理生化活动，而缺陷m c 4 r 蛋白此能力下降。通过检测细胞 裂解液中c a m p 的变化幅度并与表达正常蛋白的细胞比较可以鉴定突变蛋白的功能缺 陷。m c 4 r 突变蛋白可能通过以下几种方式影响受体功能1 6 z - # 5 i ：受体在细胞表面表 达缺陷，受体与配体亲和力下降，受体与配体结合后g 蛋白耦联过程异常，无法 产生相应c a m p ，受体与o - m s h 亲和力下降但与其拮抗物a g r p 的亲和力保持不 变。 y a n g 等嘲对m c 4 r 基因进行的定点突变诱导实验，使2 6 1 位氨基酸由苯丙氨酸变 为丙氨酸( e p f 2 6 1 a ) ，结果表明m c 4 r 第2 6 1 位氨基酸( 苯丙氨酸) 的改变大大降低了 m c 4 r 与a - m s h 的亲和力，而m c 4 r 第5 及第6 跨膜区同时也是g 蛋白结合及激活的必 要结构域。到目前为止，在m c 4 r 第6 跨膜区已报道有4 种错义突变( v 2 5 3 i ，l 2 5 0 q ， a 2 4 4 q ，g 2 5 2 s ) t 1 9 , 6 7 - 6 9 。y e o 等对v 2 5 3 i 突变基因进行了体外转染试验，结果表明 v 2 5 3 i 突变基因表达的受体与配体的亲和力基本正常，但跨膜信号传导能力却受损， 即不能产生相应的c a m p 。l u b r a n o 。b e r t h e l i e r 等1 7 0 1 的研究表明：l 2 5 0 q 突变导致m c 4 r 在细胞膜表面的表达大大降低。邵新宇等1 7 。j 研究f 2 6 1 s 突变发生在中国人群的m c 4 r 第6 个跨膜结构域，由一极性中性氨基酸( s ) 代替了非极性疏水芳香族氨基酸( f ) ，这一 突变使m c 4 r 与a m s h 结合产生c a m p 的能力有缺陷，从而导致介导的信号转导能力 下降。 2 , 4m c 4 r 基因多态性研究进展 4 2 4 1m c 4 r 基因突变与人的肥胖 m c 4 r 是第一个发现的与人类显性遗传疾病性肥胖相关的靶位点【6 ，】。y e o 等1 7 2 1 和 v a i s s e 等 7 3 1 首次在2 例早发性肥胖患者中发现了m c 4 r 基因移码突变后，m c 4 r 在人类 能量和体重调节中的重要性逐渐地被揭示。人m c 4 r 突变研究表明其显性遗传多由于 单体不足所导致，在极少数个体中也可出现隐性遗传的错义突变。m c 4 r 基因突变属 常染色体显性遗传，因此该基因具有表型的突变在人群中的发生率较高，迄今有近8 0 例m c 4 r 基因突变导致肥胖的病例报道l ，4 l ，据估计b m i 大于4 0 的极度肥胖人群中有约 1 4 是由于m c 4 r 基因突变所致1 。在人类f l a m c 4 r 基因突变引起的肥胖症其表现 型多种多样，除了多食、肥胖外，并不伴发其他的内分泌代谢异常，甲状腺、肾上腺 和生殖功能正常，不同于其他类型的单基因突变性肥胖【7 6 1 。另外，m c 4 r 基因多态性 也可能与体脂分布及脂代谢相关，体型缺陷m c 4 r 导致的肥胖为青少年发病型，且女 性的严重程度高于男性，其中大多数患者体脂分布有女性化倾向m 】。r o s m o n d 等 7 7 1 在瑞典人群中的研究表明，m c 4 r 基因v a l l 0 3 i l e 多态性与腹内脂肪、胰岛素水平、血 糖水平及脂代谢水平相关。 m c 4 r 基因突变率及其表型有种族差异 5 9 , 7 8 】，且大部分研究是在欧美国家中进行。 鉴于此，国内蔡姝冰等”选取b m i 3 0k g m 2 的无亲缘关系的上海地区中国人2 5 6 例 为研究对象，结果在肥胖患者中发现m c 4 r 的一种错义突变，第2 6 1 位氨基酸发生 p h e 2 6 1 s e r 改变，突变携带者皆超重或肥胖，突变纯合子肥胖程度大于杂合子。突变 携带者不伴有其它内分泌异常。这一突变在国内外均为首例报道。接着邵新宇等【7 l 】 对这一突变是否造成m c 4 r 蛋白功能改变进行验证，证明p h e 2 6 1 s e r 突变使m c 4 r 介导 的信号转导能力下降，且此突变与中国人早发性肥胖有关。 2 4 2m c 4 r 基因突变与动物生产性能的关系 关于m c 4 r 基因突变对动物生产性能的影响，主要集中在猪和鸡上，在其他动物 上的多态性研究报道不是很多。 m c 4 r 基因在控制人和鼠采食行为和体重方面的重要作用阐明，导致了m c 4 r 作 为猪重要生产性状候选基因的研究。猪m c 4 r 基因已被克隆并被定位于l 号染色体 q 2 2 2 7 处，与猪l 号染色体上的数个标记明显连锁，用两点连锁遗传分析得到的两个 离m c 4 r 基因最近的微卫星标记是s 0 3 11 3 和s 0 0 8 2 1 s 0 1 。序列分析表明，猪m c 4 r 基因 第7 跨膜结构功能域的一个高度保守区内发生了一个错义突变( g - a ) ，产生- f t a q l 酶切 位点的改变，在人和猪中这一突变使m c 4 r 蛋白第2 9 8 位氨基酸发生天冬酰胺代替天 冬氨酸的错义突变，因此m c 4 r 可分为a a 、a b 、b b 三种基因型。这一发现已由k i m 等1 在数个猪品系的1 ，8 0 0 个样本中检测，生产肥育性能测定分析记录显示m c 4 r 基 因型与一些品系的背膘厚和生长率以及所有品系的采食量呈强相关。a a 基因型背膘 比b b 基因型薄9 9 6 ，b b 基因型猪日增重与a a 基因型猪差异显著。国内刘桂兰等【叼人选 5 择大白猪和梅山猪杂交建立的资源家系为实验材料，采用p c r - r f l p 分析技术，其所 得结论与k i m 等的报道相一致。近来李长龙等【8 3 1 在3 个猪群中的检测结果与上述报道 也相一致，近一步证明m c 4 r 名e 猪生产肥育性能方面的重要性。 鸡的m c 4 r 基因已被克隆并被定位在2 号染色体的1 2 区带【b 钔，提示与人的m c 4 r 有 一定的同源性。目前对鸡的参考系利用p c r - r f l p 方法分析，发现在m c 3 r 编码区有 多态性，m c 3 r 基因对鸡体重和公鸡的腹脂有显著影响i s ”。据仇雪梅等【8 6 】新近研究检 测到鸡的m c 4 r 基因5 调控区的c t 的转换突变，导致此处多了一个n f - e 2 蛋白结合 位点和一个转录启始因子c a p 信号，因此，b b 基因型转录因子和蛋白结合位点的增加 及其位置的改变可能会影响m c 4 r 基因的表达量 s t , s s ) ，结果分析显示，m c 4 r 基因5 调控区、编码区上的突变对鸡的体重、屠体性状有显著影响，但对腹脂没有显著的影 响。这和大多文献表明哺乳动物m c 4 r 基因主要影响体重和肥胖的结论不十分一致 m 1 ”，但或许证实了t a k e u c h i 等人川的结果：即鸡的m c 4 r 基因在脑、脂肪、肾上 腺和生殖腺等组织表达，而哺乳动物m c 4 r 仅在脑组织表达，二者基因表达与调控存 在着较大的差别。 3 本研究的目标和技术路线 3 1 研究目标 1 克隆鹅m c 4 r 基因并测知该基因编码区序列。 2 将其与其它物种m c 4 r 进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较，构建进化关系树， 了解鹅在核酸进化树上的所处的位置。 3 比较分析鹅与其它物种m c 4 r 氨基酸的密码子使用特点，分析鹅m c 4 r 氨基酸的 亲水性、所带电荷和表面概率，对蛋白质序列、结构和功能作出预测。 4 并运用p c r r f l p 技术，选用限制性内切酶对鹅m c 4 r 基因进行多态性分析。旨在 检测试验鹅群m c 4 r 基因r f l p 位点，通过统计分析，筛选与鹅主要经济性状显著相 关的基因型，为鹅的遗传改良提供理论基础。 3 2 技术路线 实验鹅群的构建一血样的采集与处理一鹅基因组d n a 的提取一设计引物一鹅基 因组d n a 的p c r p c r 产物的纯化、连接、转化及测序一根据克隆得到的鹅m c 4 r 基因序列设计引物一克隆试验鹅群所有个体m c 4 r 基因一对个体m c 4 r 基因序列进 行p c r - r f l p 分析一检测试验鹅群m c 4 r 基因r f l p 位点一统计分析r f l p 位点与 鹅主要生产性状的相关性一得出结论。 6 1 引言 鹅胴体中肌肉含量高，营养价值丰富，深受国内外人们的青睐。我国养鹅业发 展迅速，随着优良品种的不断问世和杂交利用的大力推广，养鹅业已成为我国畜牧业 的重要组成部分。随着生活水平的不断提高，人们不仅对肉仔鹅及其加工产品需求量 增大，而且对食品的安全与对人体影响要求越来越严格。消费需求量的不断增加，对 肉的品质要求的不断提高，为鹅的育种、饲养提供了更大的机遇，同时也提出了更高 的要求。而传统家禽育种者和饲养者只注重鹅生产性能，以快速提升产肉量，这种方 式所带来的弊端是直接导致肉质下降和饲料利用率降低。传统的杂交方式带来的品种 的优化效用已经很小，如何从分子遗传水平上对鹅的生产性状进行优化、改良，以改 善肉的品质，已成为当前育种工作者们关注的热点问题。 动物的体重维持和能量稳态受高级中枢神经系统控制，能量的摄入与消耗是维 持其平衡的两个关键因素。当摄入超过维持需要时，多余的能量就转化为脂肪沉积下 来，而脂肪是影响肉质性状的一个重要因素，定含量的皮下脂肪使胴体外观较好， 肌间脂肪( i n t r a m u s c u l a rf a t ，i m f ) 被认为与肉质及口感呈正相关，特别是影响肉的嫩 度。黑素皮质素受体4 ( m c 4 r ) 是下丘脑腹内侧核( v m h ) 分泌的一种神经型受体，在 调节动物采食量和能量平衡中起重要作用。 分子标记辅助选择( m a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o n ，m a s ) 为解决这一问题提供了新的 思路。随着数量遗传学、分子遗传学等学科的发展，发现畜禽许多数量性状不仅受微 效多基因控制，而且还受一个或几个主效基因的影响。选择与数量性状位点相连锁的 分子遗传标记即可实现对基因型的直接选择。将传统和现代的遗传学方法结合起来， 运用于家禽育种实践，必将极大地提高选择效率及进一步提高鹅的生产性能。候选基 因法是根据已有的生理生化知识及对复杂数量性状的剖析，来推断哪些基因可能参与 了性状的形成和变异，通过分子生物学试验检测这些基因及其分子标记对特定数量性 状的效应，筛选出对数量性状有影响的基因和分子标记。 目前在g e n b a n k 上已经报道了人、鸡、猪、牛、狗、小鼠、大鼠、食蟹猴、斑马 鱼、河豚、东方纯、金鱼等的m c 4 r 基因序列，而鹅m c 4 r 及其基因序列的研究还未 见报道。 因此，本研究将m c 4 r 基因作为影响鹅脂肪沉积的候选基因，利用引物扩增目的 基因的方式，克隆、测知鹅m c 4 r 基因编码区序列，并将其与其它物种进行核苷酸和 氨基酸序列同源性比较；构建进化关系树，了解鹅在核酸进化树上的所处的位置；分 析鹅m c 4 r 氨基酸的亲水性、所带电荷和表面概率，对蛋白质序列、结构和功能作出 预测；并运用p c r r f l p 技术，选用限制性内切酶对鹅m c 4 r 基因进行多态性分析。 7 2 材料与方法 2 1 试验材料 2 1 1 试验动物及性状测定 试验用的鹅来自皖西白鹅与四川白鹅的杂交f l 群体，翅下静脉采集血样，血样 加入a c d 抗凝剂于2 0 冻存。 所有供试鹅于6 0 日龄进行屠宰测定，宰前1 2 h 停止采食，但充足饮水，宰前称 测体重。屠宰采用颈部放血，血放净后，拔羽及绒，称重。去内脏，仅留肺和肾，剥 离腺胃、肌胃、心、肝、脾等内脏。从第一颈椎处分割头，从踝关节处分割脚，剥离 左侧胸肌和腿肌。 测定按照全国家禽育种委员会1 9 8 4 年颁布的“家禽生产性能与计算方法”进行， 测定包括屠体重、半净膛重、肝脏重、心脏重、腺胃重、肌胃重、腹脂重、全净膛重、 胸肌重、腿肌重。通过计算获得胴体性状比率的有：屠宰率、半净膛率、肝脏率、心 脏率、腺胃率、肌胃率、腹脂率、全净膛率、胸肌率、腿肌率、胸腿肌率。 胸( 腿) 肌失水率、胸( 腿) 肌( 宰后4 5 m i n 时) 、胸( 腿) 肌纤维直径、胸( 腿) 肌粗脂肪、脂肪酸组成成分及相对含量、胸肌不饱和脂肪酸含量、胸肌饱和脂肪酸含 量、胸肌脂肪酸比。 2 1 2 菌株与克隆载体 菌株选用d h 5 a ，由本室保存。 p m d 1 8t 载体购自大连宝生物公司 2 1 3 药品和酶 t a q d n a 聚合酶、d n t p 、d l 2 0 0 0 m a r k e r ：大连宝生物公司 d n a 凝胶回收试剂盒：a x y g e n 公司 n n 二甲基甲酰胺氨苄青霉素( a m p ) ：南京生兴生物技术有限公司 胰蛋白胨、酵母粉：o x o i dl t d e n g l a n d t r i sb a s e ：n o v o n 公司 h i n f l 和t a q i 限制性内切酶、p r o t e a s e k p r o m e g a