CRISPR_Cas9 基因编辑技术简介ppt课件.ppt

,基因编辑技术CRISPR/Cas9,1,1987年，日本大阪大学（OsakaUniversity）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。2002年才正式命名为成簇的规律间隔性短回文重复序列CRISPR(Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats).,2013年之后，研究者们在science和nature等国际著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精准的基因修饰。,1.CRISPR/Cas系统概述,2,已测序的接近90%的古细菌和40%的细菌的基因组或是质粒中至少存在CRISPR基因座。,根据Cas基因核心元件序列的不用，CRISPR/Cas免疫体统分为3中类型：型、型和型。型和型CRISPR/Cas免疫系统需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而型CRISPR/Cas9免疫系统只需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链，目前型系统是被改造的最成功的人工核酸内切酶。,1.CRISPR/Cas系统概述,1.1CRISPR的分布与分类：,3,CRISPR/Cas系统是很多细菌和大部分古细菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。,1.2CRISPR系统获得：,1.CRISPR/Cas系统概述,4,2.CRISPR/Cas系统结构,2.1CRISPR/Cas主要由两部分组成：,5,2.2CRISPR结构：,CRISPR是一种特殊的DNA重复序列家族，广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21-48bp，重复序列之间被26-72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列(spacer)与靶基因进行识别。,2.CRISPR/Cas系统结构,6,2.3Cas家族：,Cas(CRISPRassociated)存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guideRNA引导下对靶位点进行切割。它与fokI酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。,2.CRISPR/Cas系统结构,7,CRISPR基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）,当该噬菌体再次入侵细菌时，CRISPR簇首先转录为长的crRNA前体，然后逐步加工成小的成熟的crRNA.,CRISPR/Cas系统活性的发挥或外源遗传物质的干扰,crRNA结合相关的Cas蛋白后，形成crRNA-Cas蛋白复合体，通过碱基互补配对精确地与目标DNA相结合，随后Cas蛋白对目标DNA进行断裂和降解。,3.CRISPR/Cas9系统作用机制,8,4.CRISPR/Cas9系统,Type因其简单性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具-CRISPR/Cas9。现在广泛使用的CRISPR/Cas9系统来源于酿脓链球菌。,TypeII系统具有以下特点：,在CRISPR/Cas基因座上游会表达tracrRNA;,tracrRNA会参与crRNA的加工，这个工程亦需要RNaseIII的参与；,tracrRNA会与crRNA形成二聚体指导Cas对双链DNA的切割。,9,Cas9是一种核酸内切酶,其具有：RuvC和HNH两个内切酶活性中心,Jinek等发现Cas9在细菌和试管里对双链DNA具有强烈的切割能力,但是这种切割能力需要的crRNA和tracrRNA介导。,4.CRISPR/Cas9系统,10,Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA链,使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明,这条嵌合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用的都是crRNA和全长tracrRNA融合体,简称sgRNA(singleguideRNA),4.CRISPR/Cas9系统,11,4.CRISPR/Cas9系统,酿脓链球菌,12,4.CRISPR/Cas9系统,13,CRISPRDesignTool:/,E-CRISPR:,ZiFiT:/,Cas9Design:,Cas-OFFinder:,CCTop:http:/crispr.cos.uni-heidelberg.de/,4.CRISPR/Cas9系统,gRNA在线设计工具：,14,4.CRISPR/Cas9系统,15,基因敲除或者敲入；,基因修复；,基因调控；,文库筛选。,4.CRISPR/Cas9系统,CRISPR/Cas作用：,16,5.CRISPR/Cas9脱靶效应,2013年，研究者们发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，但CRISPR/Cas9目前仍存在一个很严重且无法避免的问题，即潜在的脱靶效应不可消除。,CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处10-12bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识别影响不大。,Cas9蛋白不具特异性,17,沈彬，2015,6.降低脱靶效应,Cas9切口酶,通过点突变的方法，使Cas9只有单链切割活性，类似于切口酶,18,YuHisanoetal.2014,6.降低脱靶效应,添加同源臂(homologyarm,HR),19,NicolasWyvekensetal.2015,FoKI-dCas9,6.降低脱靶效应,20,FengZhangetal.2015,6.降低脱靶效应,CRISPR/Cpf1系统,Cpf1系统更简单一些，它只需要一条RNA。Cpf1酶也比标准SpCas9要小，使得它更易于传送至细胞和组织内。,Cpf1以一种不同于Cas9的方式切割DNA。Cas9切割留下“平端”（bluntends）。,Cpf1复合物生成的两条链切口是偏移的，在裸露端留下了短悬端（ov