（生物化学与分子生物学专业论文）拟南芥红光突变体蛋白质组学初步分析.pdf

拟南芥红光突变体蛋白质组学初步分析 摘要 植物功能基因组学研究在本世纪发展十分迅速，然而在转录水平提供的基因 表达的信息确还不能完全确定一个基因的功能。因为基因只是遗传信息的携带者， 蛋白质才是生命功能的真正体现者，且在从基因到蛋白质的转录及翻译过程中， 在不同机体，不同组织，甚至不同阶段都有不同【“。所以广范围研究蛋白质研究 表达和功能模式的蛋白质组学已经成为功能基因组学的重要领域。它旨在阐明生 物体内全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在 方式( 修饰方式) 、结构、功能及相互作用等。蛋白质组是指一个基因组所编码的所 有蛋白质的总和。蛋白质组方法学包括蛋白质组分离技术和蛋白质组鉴定技术。 用于蛋白质分离的双向凝胶电泳技术是蛋白质组研究的核心，而鉴定技术则是蛋 白质组技术的支柱。 为了进一步研究植物红光信号途径，本文利用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术， 分离了红光受体双突变体p h y a p h y b 与c 0 1 4 的蛋白质组，得到了高重复性的双向 凝胶图谱。通过初步的斑点配比，获得了两种材料的差异蛋白质点图谱；并选取5 5 个变化明显的蛋白质点用原位酶解，抽提蛋白质片段进行m a l d i t o f t o f m s 质谱分析，利用肽质量指纹图数据在数据库中进行检索，其中包括普通反应酶、 过氧化物酶、转录因子、绑定蛋白，分子伴侣蛋白等。同时为了发现更多植物红 光信号途径与蓝光信号途径的交叉因子，还以拟南芥野生型( a r a b i d o p s i s ，c 0 1 41 ， 红光受体突变体( p h y b ) 和蓝光受体突变体( c r y l 3 0 4 ) 七天幼苗的全蛋白为材料， 在增溶样品，设定合适的电泳参数，选择适当的s d s p a g e 的凝胶浓度等电泳条 件下，获得了质量较好的s d s 凝胶图谱。 关键词：拟南芥；双向电泳；红光光受体双突变体p h y a p h y b ；野生型c 0 1 4 ：红光 受体突变体p h y b ；蓝光受体突变体c r y l 一3 0 4 i l a b s t r a c t p l a n tf u n c t i o n a lg e n o m i c si sd e v e l o p i n gv e r yf a s ti nt h i sc e n t u r y h o w e v e r , t h e i n f o r m a t i o no fg e n ee x p r e s so nt h et r a n s c r i p t i o nl e v e ls t i l lc a l lh a r d l yc o n f t r mt h e g e n e sf u n c t i o n b e c a u s et h ed i r e c te x e c u t ef a c t o ro fl i f ei sp r o t e i no t h e rt h a nt h eg e n e m o r e o v e r , i nt h ep r o c e s so ft r a n s c r i p t i o na n dt r a n s l a t i o n ，t h ep r o t e i nv a r i e si nd i f f e r e n t o r g a n i s m ，d i f f e r e n tt i s s u ee v e nd i f f e r e n tp e r i o d s o ，p r o t e o m i c sw i t c hw a sal e a d i n g t e c h n o l o g yf o rl a r g e - s c a l ea n a l y s i so fp r o t e i ne x p r e s s i o na n df u n c t i o nh a sb e c o m ea m a j o rf i e l do ff u n c t i o n a lg e o m i c s t h et e c h n o l o g yo fp r o t e o m i c sr e q u i r e dt os e p a r a t e l a r g en u m b e r so fp r o t e i n s ，t oi d e n t i f yt h e m ，a n dt os t u d yt h e i rm o d i f i c a t i o n sa r eb y n o m e a n ss t r a i g h tf o r w a r d c u r r e n t l yt h eo n l ys e p a r a t i o nt e c h n o l o g yw h i c hp r o v i d e s h i g h l yp u r i f i e dp r o t e i n ss e p a r a t e di nas i m p l ep a r a l l e lp r o c e s si s2 - d e l e c t r o p h o r e s i s i n p r o t e o m ep r o j e c t s ，w h i c ha i mt oi d e n t i f ya n dc h a r a c t e r i z ea l lp r o t e i n se x p r e s s e db ya n o r g a n i s mo rt i s s u e ，t h ei d e n t i f i c a t i o no fp r o t e i n sp l a y sac e n t r a lr o l e t h ep r o t e i n s2 - dm a p so fa r a b i d o p s i sw i l dt y p e ( c o l 4 ) ，r e dl i g h tr e c e p t o rd o u b l e m u t a n t ( p h y a p h y b ) w e r eo b t a i n e db yo p t i m i z i n gc r u c i a lf a c t o r sa n dp r o c e d u r e ss u c ha s s a m p l et r e a t m e n t ，e l e c t r o p h o r e s i sp a r a m e t e r ，a n dg e l c o n c e n t r a t i o n t h er e s u l t s r e v e a l e dt h a ta d a p t i n gl y s e ss o l u t i o nt ot r e a t i n gs a m p l e ，c h o o s i n gm o d e r a t ea m o u n to f s a m p l e ，u s i n gp r e c a s ti m m o b i l i z e dl i n e a rp hg r a d i e n tp h3 102 4 c md r ys t r i p sf o rt h e f i r s td i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s ，1 2 s e p a r a t i o ng e lw e r eu s e dt ot h es d s p a g e e l e c t r o p h o r e s i s f i f t y f i v ep r o t e i ns p o t s ，w h i c hw e r ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e di nt h e p h y a p h y ba n dc o l 4 ，w e r ei d e n t i f i e db yt h em e t h o d ：m a l d i t o f t o f m sp e p t i d e f i n g e r p r i n ta n a l y s i so ft h ep r o t e i ns p o t sa n dp r o t e i nd a t a b a s es e a r c h i n g t h i r t y - n i n eo f t h e mw e r ei d e n t i f i e ds u c c e s s f u l l y i no r d e rt of i n do u tt h en e wf a c t o rw h i c ho p e r a t ei nb o t hr e dl i g h tp a s sw a ya n d b l u el i g h tp a s sw a y , w ea n a l y z e dt h ep r o t e i n se x p r e s s i o no fa r a b i d o p s i sc o l - 4 ， c r y l 一3 0 4a n dp h y bg r o w ni nw h i t el i g h t ，b l u el i g h ta n dr e dl i g h tf o r7 - 8d a y s b ys d s e l e c t r o p h o r e s e si nt h i sr e s e a r c h c o m p a r e dt h et w om u t a n t sw i t hc o l 一4 ，w ef i n d s e v e r a ld i s s i m i l i t u d ei ne a c hl i g h ts i t u a t i o n k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i s ；2 - de l e c t r o p h o r e s e s ；p h y a p h y b ；c o l - 4 ：p h y b ；c r y l 一3 0 4 i i l 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名： 旁鸟 日期：知唧年5 月刁日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 1 、保密o ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密面。 ( 请在以上相应方框内打“、”) 作者签名： 导师签名： 孝鸟 纠跏 日期：夕。7 年r 月却日 日期：姗年，月o 日 硕士学位论文 第1 章前言蛋白质组学研究新进展 1 1 蛋白质组学研究的目的和任务 生物学在2 0 世纪取得了巨大进展，数理科学广泛而又深刻地渗入生物学的结 果，全面地改变了现代生物学的面貌。随着基因组计划的实施和迅猛发展，数据 库中有关基因的信息骤增，目前已有二十几个物种如大肠杆菌( e c o l i ) 、芽殖酵母 ( s a c c h a m m y c e sc e r e v i s i a e ) 、线虫( c e le g a n s ) 等已完成了基因组的全序列测定，人 类基因组计划也将提前完成。人们在获取了基因的全部序列信息后，也只是解决 了遗传信息库的问题，还远远不是基因组研究的终结。必须进一步了解所有这些 基因的功能是什么，它们是怎样发挥这些功能的，这样基因的遗传信息才能与生 命活动之间建立直接的联系。研究基因组的根本目的在于揭示整个生命活动的规 律。因此，基因组全序列的测定只是认识生命、改造生命力里长征的第一步，人 们必须继续研究所有这些基因的功能。在这样的形势下，科学家们认为，生命科 学已经进入后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组 学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。功能基因组学中所采用的策略，如 新的高通量表达分析方法包括微阵列( m i c r o a r r a r y ) 口】、基因表达序列分析( s e r i a l a n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o n 。s a g e ) 3 1 、基因芯片( c d n ac h i p ) 4 1 等，都是从细胞中 m r n a 的角度来考虑的，其前题是细胞中m r n a 的水平反映了蛋白质表达的水平。 但其实并不完全如此，从d n a m r n a 一蛋白质，存在三个层次的调控和修饰， 即转录水平，翻译水平和翻译后水平。从m r n a 角度考虑，实际上仅包括了转录 水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平1 5 j 。实验也证明，组织中m r n a 丰度 与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。更重 要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质蛋白质 相互作用等几乎无法从m r n a 水平来判断。毋庸置疑，蛋白质是生理功能的执行 者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将自接阐明生命在生 理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、 蛋白质问相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。 虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术 要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命过程1 5 】因此，要解决 这一问题，我们就必需要寻找新的途径。 于是蛋白质组学应运而生。测定一个有机体的基因组所表达的全部蛋白质的 设想，萌发在1 9 7 5 年2 d e 发明之时，但直至1 9 9 4 年澳大利亚学者w i l l i a m s 才 拟南芥红光突变体岱白质组学初步分析 正式提出了这个问题，而“蛋白质组”的名词则是由w i l k i n s 创造的，发表在1 9 9 5 年7 月的e l e c t r o p h o r e s i s 杂志上。蛋白质组是指“由一个细胞或一个组织的基因组 所表达的全部相应的蛋白质及其存在方式”【6 j 。这是广义上的蛋白质组的定义。蛋 白质组与基因组相对应，但二者又有不同之处：一个有机体只有一个确定的基因 组，组成该有机体的所有不同细胞都共享用一个确定的基因组；而蛋白质组是一个 动态概念，它不仅在同一个有机体的不同组织和细胞中不同，即使在同一有机体 的不同发育阶段，在不同的生理状态下，乃至在不同的外界环境下，同一种细胞 的蛋白质也存在差异。正是这种复杂的基因表达模式，表现了各种复杂的生命活 动，每一种生命运动形式，都是特定的蛋白质群体在不同时间和空间出现，并发 挥功能的不同组合的结果。基因d n a 的序列并不能提供这些信息，再加上由于基 因剪接，蛋白质翻译后修饰和蛋白质剪接，基因遗传信息的表现规律就更加复杂， 不再是经典的一个基因一个蛋白质的对应关系，一个基因表达的蛋白质数目可能 远大于一。对细菌，可能为1 2 1 3 ；对酵母则为3 ；而对人，可高达1 0 。蛋白 质组学是一门在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科， 它以蛋白质组为研究对象，旨在阐明生物体内全部蛋白质的表达模式及功能模式， 其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式( 修饰方式) 、结构、功能及相互作用等。 蛋白质组研究，是为阐明生命活动本质所不可缺少的基因组研究的远为复杂的后 续部分，因此后基因组或蛋白质组的研究，无疑将成为本世纪生命科学研究中继 基因组研究的主要任务。目前，蛋白质组学研究主要包括以下三个方面1 7 】：一是 大规模高通量地鉴定展示在2 一d 胶上的蛋白质，主要是2 d 胶参考图谱的建立； 二是研究各种生理和病理条件下蛋白质组的变化，鉴定差异表达蛋白，从中总结 出生命活动的规律；另外一方面是蛋白质组功能模式( 目前主要集中在蛋白质相互 作用网络关系) 的研究。 1 2 蛋白质组研究技术及其进展 蛋白质组的研究可以追溯到3 0 多年前0 f a r r e l 和k l o s e 各自创建的蛋白质高分 辨双向凝胶电泳( t w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ，2 一d e ) 之时。o f a r r e l 对大肠杆 菌细胞抽提物双向电泳后，分离到“0 0 个蛋白质组分，从此拉丌了蛋白质组研究 的序幕。蛋白质组研究的理论技术路线流程如下( 见图1 1 ) 。 从细胞、体液或组织等生物样品中提取的蛋白质，经2 d e 分离，染色，得到 蛋白质表达谱。采用计算机图像分析技术，可对图谱上的蛋白点进行定位、定量、 图谱比较、差异点寻找等，对胶上蛋白质点的鉴定可以采用两种不同的技术路线。 2 硕士学位论文 i 缒纛黧撇 由卤卤由 图1 1 蛋白质组研究的技术路线流程图( 钱小红，贺福初蛋白质组学：理论与方法 一种是采用膜转印技术，将电泳胶上的蛋白质转印到膜上f 硝酸纤维素膜或p v d f 膜) ，然后采用e d m a n 降解或氨基酸组成分析等传统生物化学的方法进行分析，将 分析的结果输入特定的程序并进行数据库检索，从而实现对蛋白质的鉴定。另一 种是以质谱为基本技术的蛋白质鉴定技术路线。将胶上蛋白质点进行蛋白酶切， 回收酶切肽段，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( m a t r i xa s s i s t e dl a s e r d e s o r p t i o ni o n i z a t i o nt i m eo ff l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y , m a l d i t o f m s ) 测定肽质量 指纹图( p e p t i d em a p p i n gf i n g e r p r i n t ，p m f ) 瞵j ，或者采用电喷雾串联质谱 ( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y , e s i m s - m s l 测定肽序列p j ，分别进行数 据库检索，实现蛋白质的鉴定。如果是蛋白质数据库中不存在的蛋白质，还可以 通过特定的检索程序进行基因数据库的分析检索。而当今蛋白质组研究能够蓬勃 发展，主要归功于以下三大技术突破：( 0 8 0 年代固相化p h 梯度( i m m o b i l i z e dp h 拟南芥红光突变体蛋白质纽学初步分析 g r a d i e n t s ，i p g ) 的发明和完善，改善了双向凝胶电泳的重复性和上样量；( 2 ) 8 0 年代 后期电喷雾质谱( e t e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y , e s i m s ) 和基质辅助激 光解吸飞行时间质谱( m a t r i x a s s i s t e dl a s e r d e s o r p t i ni o n i z a t i o nt i m e o ff l i g h tm a s s s p e c t r o m e t r y , m a l d i t o f m s ) 技术的发明，以及它们在蛋白质分析中的成功应 用；( 3 ) 蛋白质双向电泳图谱的数字化和分析软件的问世，不少物种的双向电泳和 蛋白质数据库、基因组数据库的相继建立和完善。除了上述蛋白质组研究的基本 技术外，还有许多蛋白质组研究技术也不断出现，如用于定量蛋白质组学研究的 同位素编码亲和标签技术( i s o t o p e c o d e da f f i n i t yt a g s ，i c a t ) 【1 0 】和双色荧光技术【i l l 等：用于蛋白质一蛋白质相互作用研究的酵母双杂交技术【i ”、复合物免疫分离与 质谱鉴定技术【”l ：用于大规模蛋白质分离与鉴定的多维色谱一质谱联用技术【1 4 】、 用于翻译后修饰如磷酸化、糖基化蛋白之图谱展示与检测技术 1 5 , 1 6 以及蛋白质芯 片技术i ”1 等。 1 2 1 主要蛋白质分离技术 1 2 1 1 双向凝胶电泳( 2 d e ) 双向凝胶电泳的基本原理首先是根据蛋白质的等电点不同在p h 梯度胶中等电 聚焦分离，然后按分子量的不同用s d s p a g e 进行第二向分离，把复杂的蛋白质 混合物展现在二维平面上。自从双向电泳的方法被阐明以来( s m i t h i e sa n dp o u l i k 1 9 5 6 ) ，这种技术的分辨率已经从1 5 个蛋白质点发展到1 00 0 0 个蛋白质点( k l i s e a n d k v o b a l z1 9 9 5 ) ，具有较高的分辨率。发展过程中的一个里程碑是r a y m o n d ( 1 9 6 4 ) 将聚丙烯酰胺凝胶引入双向电泳。另一个里程碑是1 9 7 3 年s t e g e m a n n 等将等电聚 焦( i e f ) 和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s - p a g e ) 相结合。o f a r r e l ( 1 9 7 5 ) k l o s e ( 1 9 7 5 ) 和s c h e e l e ( 1 9 7 5 ) 首先结合这些技术在分辨率上取得了巨大的进步。 2 - d e 面临的挑战是高分辨率和可重复性。高分辨率确保蛋白质最大程度的分 离，高重复性允许进行凝胶间配 = k ( m a t c h ) ，对2 - d e 而言，有三种方法分离蛋白： 1 ) i s o d a l t ( i s o e l e c t r i cf o c u s ) 以0 f a r r e l l s 技术为基础，第一向应用载体两性电 解质( c a r r i e ra m p h o l y t e ，c a ) ，在管胶内建立p h 梯度，但该方法随着聚焦时问的延 长，p h 梯度不稳，易产生阴极漂移，重复性差，上样量低，不利于不同实验室间 进行图谱比较。2 ) i p g d a l ，t 发展于8 0 年代早期，使用固相载体两性电解质 i m m o b i l i n e s ( 丙烯酰胺衍生物1 与丙烯酰胺共聚，从而建立起具有p h 梯度的凝胶( 固 相p h 梯度胶，i p g 胶) 。i p g 胶条的p h 梯度比较稳定，不依赖于外加电场，重复 性较好，上样量也提高到毫克级，基本上克服了传统的等电聚焦的主要缺点，通 过使用预先制备好的凝胶也可提高重复性。在最适条件下，不同凝胶中蛋白质点 的位置的指认在大多数情况下是明确的，正如b a k e r 等( 1 9 9 2 ) 通过比较在柏林、慕 尼黑和伦敦得到的人类心脏2 d 胶图谱中已鉴定的蛋白质点所证明的那样。目前 4 顾士学位论文 可以精确制作线性、渐进性和s 型曲线，范围或宽或窄的p h 梯度，酸性p h 3 5 或碱性p n 6 11 的i p g 凝胶梯度联合p h 4 7 的梯度可对蛋白质形成蛋白质组重叠群 ( p r o t e o m i c sc o n t i g s ，见1 2 2 7 ) 从而有效分离，商品化胶条基本上解决了双向凝胶 电泳重复性的问题。3 ) n e p h g e ( n o n e q u i l i b r i u mp hg r a d i e n te l e c t r o p h o r e s i s ) 用于分 离碱性蛋白质( p h 7 0 ) ，如果达到平衡状态，碱性蛋白质会离开凝胶基质而丢失。 因此，在等电区域的迁移必须在平衡状态之前完成，但很难控制。 为了更好的使细胞内低组分蛋白在2 - d e 胶中得以成像，蛋白的染色技术就显 得至关重要。研究人员从有研究兴趣的组织中提取出蛋白质并进行二维电泳，结 果会得到一系列多达几千的点，每个点包含一种或多种蛋白质的凝胶，该凝胶只 有经过染色才能观察到被分离的蛋白点，因此凝胶的染色、显色是一个重要的步 骤，蛋白质组学分析对2 - d e 后的染色技术要求很高，除了标准的敏感性外，还要 求染色技术的线性和均一性。由于不同染色方法对设备和仪器要求不同，在实验 中要综合考虑各种因素，以选择最佳方法。常用的方法有考马斯亮蓝染色和银染， 除此之外，还有负染和荧光染色。 目前，常用的适用于质谱鉴定的凝胶蛋白染色方法为考马斯亮蓝染色其灵敏 度为1 0 0n g 。考马斯亮蓝染色是传统的蛋白染色方法，由于其操作简单、花费少 而一自受到各国研究者的青睐。考染的优点是染色过程简单，所需配制的试剂少， 操作简便，无毒性，染色后的背景及对比度良好，与下游的蛋白质鉴定兼容。在 样品量允许的情况下，考染是一个比较好的选择。 银染是非放射性染色方法中灵敏度最高的，其灵敏度可达2 0 0p g 。银染主要 有两种方法：酸性硝酸银法和碱性二氨银法。酸性硝酸银法对胞内恒量蛋白染色 的灵敏度较低，但对酸性蛋白的灵敏度较高，故较适合于2 - d e 胶的染色。碱性二 氨银法由于n h 2 + 易挥发，只适用于瞬时染色，不太适合于i p g 染色。酸性硝酸银 法是口前最常用的2 - d e 胶染色方法反相染色。由于银染成本低，在目前仍然是差 异蛋白质组分析中最常用的显色方法，但由于银染过程中醛类的特异性反应使得 对凝胶酶切肽谱提取存在困难。一般都是采用银染凝胶进行图谱分析，然后加大 上样量，进行考染并将凝胶切下由于下游鉴定。由于银染和考染的特异性不同， 使得这两种不同的方法所得到的二维电泳图谱可比性不好，这样不利于蛋白质组 研究的高通量筛选。改进银染方法，使之适于胶内酶切及质谱鉴定，己成为蛋白 质组研究的迫切要求。 1 2 1 2 多维l c m s m s 途径 为克服2 - d e 在分离p i 过大或过小以及疏水性强的蛋白质的局限性，使得人 们重新思考其他途径来研究蛋白质组。液质联用( l c m s m s ) 是近几年来发展迅速 的新方法。蛋白质混合物直接通过液相色谱分离，然后进入m s 系统获得肽段分 拟南芥红光突变体蛋白质组学初步分析 子量，再通过串联m s 技术，得到部分序列信息，最终通过计算机联网查询，就 可以对该蛋白质进行鉴定。 o p i t e c k 等首次报道多维色谱( l c l c ) 整合m s m s 技术分析蛋白质混合物。 l i n k 等人进一步提出蛋白质复合物直接分析( d i r e c ta n a l y s i so fp r o t e i nc o m p l e x e s d a l p c ) 方案。d a l p c 技术根据蛋白质独特的物理性质( 带电性与疏水性) 先于m s 分离多肽复合物，然后使蛋白质复合物变性、酶解后，直接加到强离子交换柱 ( s t r o n gr a t i o ne x c h a n g e ，s c x ) 上，梯度洗脱进入反相液相色谱( r e v e r s e d p h a s el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , r p l c ) 上，再洗脱进入m s m s 系统进行肽段分析。 最近，w a s h b u r n 等人在这方面取得了较大的突破。他们在多维l c m s m s 的 基础上提出了m u d p i t ( m u l t i d i m e n s i o n a lp r o t e i ni d e n t i f i c a t i o nt e c h n o l o g y ) 方法， 成功的分离和鉴定了酵母( s a c c h a t o m y c e sc e r e v i s i a e ) q b1 4 8 4 种蛋白质，其中包括一 些低丰度的调控性蛋白激酶。 当然，多维l c m s m s 技术尚处于探索阶段，目前还无法完全代替2 - d e 途 径进行蛋白质组研究。但它能够弥补2 - d e m s 的一些技术上和方法上的缺陷，如 蛋白质在分离过程中的丢失、上样量的限制、较窄的分离范围等，而且该方法没 有偏向性，即能等同分离高丰度和低丰度的的蛋白质。一般来讲，低丰度蛋白往 往又是一些关键性的调控蛋白，如转录因子、蛋白激酶等，而这些调控蛋白质也 是我们重点研究的对象。因此，尽管多维l c m s m s 技术目前只能作为2 - d e 的 有益补充，但由于其具有自动化程度高、重复性好等优点，有理由相信，在不久 的将来，随着技术上的突破，多维l c m s m s 途径很有可能取代2 - d e m s 途径在 蛋白质组研究中的核心地位。 1 2 2 蛋白质组技术的支柱鉴定技术 目前分离蛋白质组的最好技术是2 - d e ，对其产生的上千个蛋白点用传统的方 法如e d m a n 降解法等进行分析将是一个很艰巨的任务。目前，所选用的技术包括 对于蛋白质鉴定的图象分析、微量测序、进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组分 分析和与质谱相关的技术。 1 2 2 1 图象分析技术( i m a g ea n a l y s i s ) 2 - d e 的图像分析作为基于2 - d e 的蛋白质组技术中的另一步骤，其作用是评 价和量化电泳结果。在蛋白质组研究中，从样品制备、第一向i e f 、第二向 s d s p a g e ，2 - d e 图像分析到质谱分析，整个技术过程环环相扣。在各个环节中， 图像分析既要对上游各步的结果作出定性和定量的评价，将一个直观的蛋白质二 维图谱数字化，还要为下一步的分析提供依据。特别是在表达蛋白质组研究中， 需要用图像分析软件通过正常和异常细胞或组织等电泳图谱间的匹配，找出差异 蛋白点：哪些点消失了? 哪些点是新出现的? 哪些点是相同的，而表达水平有差 6 硕士学位论文 异等等。将这些目标点切下，通过氨基酸组成分析、n 端测序或质谱分析，确定 是何种蛋白质，再结合图像分析数据和与内部及外部数据库比较的结果做出结论。 由此可见，2 - d e 图像分析在蛋白质组研究中是必不可少的【1 ”。 随着2 - d e 电泳技术不断出现突破性进展，2 - d e 凝胶的分辨率也越来越高。 在这种情况下，简单的图像比较是远远不能满足研究的需要的，图像采集系统和 分析软件必须能够检测到最小的差别和获取最多的信息。随着计算机技术的发展， 2 - d e 图像分析系统的性能有了很大的提高。在图像的获取上，即可用高分辨率 高速度的扫描仪如i m a g e s c a n n e r ，s t o r ms c a n n e ：和m o d e l g s 一7 1 0i m a g i n g d e n s i t o m e t e r 等，也可用高像素的数码摄像机和凝胶图像分析仪。在软件分析上， 出现了一些新的功能强大的软件如i m a g i n g m a s t e r2 d ，p d q u e s t ，p h o t e t i x2 d 和 m e l a n i ei i 等，为大规模分析做好了准备，但其缺点是需要很多图像的手上校对， 费时且耗费人i t 培i 。 1 2 2 2 微量测序e d m a n 降懈法测n 末端序列 经凝胶分离的蛋白质直接印迹在p v d f 膜或玻璃纤维膜上，染色，切割，然 后直接置于测序仪中。序列以4 0m i n 个氨基酸的速率产生。与质谱相比，e d m a n 降解法测序速度慢，费用偏高，灵敏度偏低，不适合成百上千的蛋白质鉴定，但 它测定的肽序列非常准确。近来，c o r d w e l l 等【l9 j 应用细径( 内径0 8m m ，流速 4 0 ) l m i n ) 的h p l c 柱，能够在1 0 0 飞摩尔( f i n 0 1 ) 的产率下测得约5 一l o 个氨基酸残 基的序列；g o o l e y 等【2 0 1 设计一种叫“s a m p l ec a r t r i d g ec a r o u s e l ”的硬件，能自动将样 品输入序列仪，进行样品平行测序，加快了测序进程，也降低了费用：c h a i t 等1 2 】 发展了一种称为“p r o t e i nl a d d e rs e q u e n c i n g ”的方法，通过对e d m a n 降解法的修 改，产生一系列肽片段，用m a l d i m s 测得这些肽片段的相对分子质量，以此为 依据推断肽序列，并联合蛋白质其他属性或与其他数据库连接，更加可信的鉴定 蛋白质。总之，随着e d m a n 降解法在测序、速度、灵敏度等技术的突破，它在蛋 白质组研究中可发挥重要作用。类似e d m a n 降解的c 端化学降解法研究多年，并 有自动化仪器问世，但它的反应效率低，通常需要n m o l 样品。 1 2 2 3 质谱技术 质谱技术的发展解决了e d m a n 降解法速度缓慢的难题。它需三个步骤，首先 通过离子化装置将分子转化为气态离子，接着通过质谱分析器按照质荷比( m z ) 的 不同进行分离，最后转化到离子检测装置【2 2 1 。目前，用来分析蛋白质和多肽样品 离子化技术主要包括基质辅助激光解吸收离子化质谱( m a l d i ) 和电喷射离子化质 谱( e s i ) 。m a l d i 通常与飞行时间质谱( t o f ) 相结合，t o f 主要用来测量分析物飞 过固定的路径所需的时间。另一种鉴别蛋白质的方法是串联质谱( m s m s ) 。在这 种情况下，经质谱分析的肽段进一步断裂并再次进行质谱分析，这样可得到肽序 7 拟南芥红光突变体蛋 | 质组学初步分析 列的部分信息。 质谱技术是目前蛋白质组研究中发展最快，也最具活力和潜力的技术。它通 过测定蛋白质的质量来判别蛋白质的种类。当前蛋白质组研究的核心技术就是双 向凝胶电泳一质谱技术，即通过双向凝胶电泳将蛋白质分离，然后利用质谱对蛋白 质逐一进行鉴定。对于蛋白质鉴定而言，高通量、高灵敏度和高精度是三个关键 指标。一般的质谱技术难以将三者合一，而最近发展的质谱技术可以同时达到以 上三个要求，从而实现对蛋白质准确和大规模的鉴定。 质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间的质荷i ：l ( ( m z ) 的差异来分离并确定分子量。质谱仪一般由进样装置( g c l c ，c e 等) 、离子化源( e s i ， m a l d i 等) 、质量分析器( 四极杆、离子阱、t o f ) 、离子检测器和数据分析系统几 个部分组成。质谱仪由于其极高的灵敏度成为当今蛋白质组研究中当之无愧的核 心工具，其发展也相当迅速，近1 0 年来，灵敏度提高了1 0 0 0 多倍。目前，大部分 的质谱仪能够鉴定l p m o l 水平的胶上蛋白( 约5 0 1 0 0 r i g ) ，有些实验室己经达到低 n g 级的灵敏度( 相当于银染中的微弱蛋白点) 。质谱技术的发展方向是小型化、自动 化、精确化和高通量。根据离子源的不同，在蛋白质组中应用的质谱主要可以分 为电喷雾( e s i ) 质谱和基质辅助激光解析( m a l d i ) 质谱两大类。 1 电喷雾( e s i ) 质谱 电喷雾质谱是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管 流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面积缩小，导致分析 物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。其特点使产生高电荷离子而不是碎片 离子，使之在较小的m z 范围内可以检测到生物大分子，从而大大扩展了分子量 的分析范围。离子的真实分子量可根据质荷比及电荷数算出。现代电喷雾质谱技 术是由f e n n 等1 2 3 】建立的。常规电喷雾质谱一般与三级四级杆和离子阱质量分折器 相联而具备串联质谱( m s m s ) 分析能力，可进行序列分析。电喷雾质谱按进样方 式和喷雾体积角度可分为四类：( 1 ) 纳喷( n a n o s p r a y ) ，由m w i l m 和m m a m m 2 4 1 1 9 9 4 年建立，样品流速为2 5 1 0 0 n l m i n ，灵敏度达到3 0 l o o f m o l ，无需泵动力。1 9 9 7 年g a v a l a s k o v i c l 2 5 】将纳喷技术进一步发展，用熔融石英管实现了皮喷 ( p i c o s p r a y ) ，样品流速为0 1 2 0 n l m i n ，灵敏度达至l j a m o l 。( 2 ) 微喷( m i c r o s p r a y ) ， 又分为三种。第一种用开放式毛细管进样，将熔融石英管末梢加工成锥形，并镀 金以提高使用寿命，样品流速为l l o o n l ，需要泵动力1 2 “”l 。第二种是和纳孔液 相色谱( n a n ob o r el c ) 联用方式进样，样品流速为1 0 0 n l 5 u l m i n 【2 8 1 。m t d a v i s 和t d l e e 【2 9 1 ，改进了梯度色谱系统( g r a d i e n tl cs y s t e m ) ，实现了流速可调，因 此能够在色谱峰上捕获所需要的峰，然后降低流速进行纳喷。从而将纳喷和纳孑l 色谱一电喷雾技术的优点都发挥了出来。第三种是在开放式毛细管内部建立反向 涂层，流速为2 0 0 8 0 0 n l ，柱后损失为零，大大升高了浓度检测极限，创造了目前 硕上学位论文 电喷雾质谱的最高灵敏度( 5 0 0 珊o l 肛l ) 【3 0 川。( 3 ) 毛细管液相色谱质谱联用。流速 为l l o p l ，需要泵动力，灵敏度达到f m o l d 2 l 。( 4 ) 毛细管电泳质谱聪机( c e - m s ) 。 结合了毛细管电泳的高分辨率和质谱快速准确分析的特点，发展很快。早期以鞘 流液( s h e a t h l i q u i d ) 的形式来保持c e 电流，样品流速为1 l o b l ，后来发展了无鞘流 液( s h e a t h l e s s ) 的接口，通过不锈钢管连接或插入微电极的方法来保证c e 电流，灵 敏度达到砌0 1 【3 3 1 。除进样方式的改进外，e s i 质谱还发展了和t o f 检测器联用。 如电喷雾四极杆飞行时间质谱( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o no nh y b r i dq u a d r u p o l e t o f i n s t r u m e n t e s i q t o f ) ，比常规串联质谱的灵敏度提高了两个数量级p 4 ，3 ”。电喷 雾质谱技术可以耐受少量的缓冲溶液、盐和去垢剂，这些物质可与分析物形成加 成物而增加分子质量测定的难度，也可抑制分析物离子的形成。所以在分析前最 好进行预处理。 2 基质辅助激光解析( m a l d i ) 质谱 基质辅助激光解析( m a l d i ) 质谱技术是由德国科学家k a r a s ，h i l l e n k a m p 和同 本科学家t a n a k a 等【3 6 , 3 7 首先建立的，它的离子化方式是将样品均匀混合在一定比 例的基质中，形成微小的晶体，当用激光( 3 3 7 n m 的氮激光) 照射时，由于基质 分子经辐照所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，导 致基质和分析物膨胀并进入气相而使分子电离，电离的分子通常带l 2 个电荷，因 此对分子量较大的样品而言不会形成复杂的多电荷图，图谱解析比较清楚。 m a l d i 质谱采用固相迸样方式，非常适合高通量鉴定，同时对杂质的忍耐性也比 较好。目前这种质谱在蛋白质组研究中已经逐渐成为主力军。 m a l d i 质谱一般和飞行时间( t o f ) 质量检测器联用，这种质谱虽然可以测定 分子量达到几十万的蛋白质，然而在分辨率和精确度上却不及e s i 质谱。后来发展 了反射飞行器( r e f l e c t o r ) ，即在原来单个飞行管的反射角度上再增加一个飞行管和 检测器，这样进一步增加了飞行距离，提高了分辨率【3 8 1 。为了进一步改善灵敏度 和分辨率，又出现了延迟抽提技术( d e l a ye x t r a c t i o n ) ，使样品离子和杂质离子得以 分开，提高信噪比【3 9 l 早期m a l d i - - t o f 质谱缺少串联质谱功能，这一点很快由源 后衰减( p o s ts o u r c ed e c a y ) 的方法来弥补，它通过在反射器( r e f e c t o r ) 后的离子门 ( i o ng a t e ) 选择母离子进行碎片分析【4 0 】为了进一步加强结构分析能力，又发展了 m a l d i 的源内碰撞诱导裂解( c o l l i s i o n i n d u c e d d i s s o c i a t i o n ，c i d ) ，在离子源的后面 增加一个碰撞腔，对离子进行碰撞碎裂，可获得较细微的结构信息【4 ”。然而这些 改进相对于e s i 质谱的串联质谱能力来讲，还比较差。革新性的进展是将m a l d i 源和四级杆t o f 检测器相联，组成m a l d i q - t o f ，它综合了m a l d t t o f 的快速、 高通量和四级杆的串联质谱能力，分辨率和灵敏度分别达到了1 0 0 0 0 和低p p m 水 平，能鉴定胶