（发酵工程专业论文）葡萄酒活性干酵母的研究.pdf

天津科技人学颤 学位论文 摘要 本文对葡萄酒酿造过程中酒精度的测定方法、葡萄酒活性干酵母生产菌株的 筛选、葡萄酒活性干酵母生产工艺条件与控制等进行了研究。 通过对快速氧化法的改进，确定了一种快速检测葡萄酒酒度的测定方法，此 方法需要的样品量较少，分析时间较短，测定简便准确，适应实验条件下大量样 品分机的需要。 对八支葡萄酒酵母菌株a h 进行酬酒精、涮s 0 2 、俐c 0 2 、涮高糖试验以 及葡萄酒的酿造试验，结果表明，菌株a 、b 、c 、f 和h 具有良好的发酵性能， 是优良的葡萄酒酵母菌株。 选定菌株a 、b 、c 、f 和h 进行生产性能的测定，包括最适培养温度与比生 长速率的测定，并通过热休克培养与加盐培养，对各酵母菌株进行生物量与海藻 糖积累试验。选定菌株a 作为葡萄酒活性干酵母生产菌株，其最适培养温度为3 2 ，在麦芽汁培养基中的最大比生长速率为0 2 4 8 1 h a ，在摇瓶培养条件下，海藻 糖的积累量可达细胞干重的8 5 9 左右。 通过i f 交试验，优化菌株a 的种子培养基，并采用四种刁i 同的工艺对葡萄酒 活性干酵母生产菌株a 进行5 l 罐流加培养试验，确定高温钝化培养方案为，卜产 葡萄酒活性干酵母的最佳工艺，即在周期为1 3 h 的流加培养中，当发酵进行到9 1 0 h 时，刀：始将发酵温度由3 0 。c 提高至3 2 ，1 0 l l h 时，提高发酵温度至3 4 ， 最后2 h 保持发酵温度为3 64 c 。在此条件下细胞生物量可达1 3 4g 几，细胞干物质 禽射为2 6 5 7 ，酵母胞内海藻糖含量可达到1 9 3 8 。 在工厂。进行了葡萄酒活性干酵母的1 5 0 l 罐中试，结果表明，所得商品酵母 的各个指标均符合葡萄酒活性干酵母的一般要求，迸一步验证了高温钝化培养_ 方 案生产葡萄酒活性干酵母的可行性。 关键词：活性干酵母，葡萄酒，发酵性能，海藻糖，生产工艺 摘蛰 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r ，t h ed e t e r m i n a t i o no fa i c o h o ld e g r e ei nw i n eb r e w i n g ，s c r e e n i n go fw i n e a d y ( a c t i v ed r yy e a s t ) s t r a i n ，m a dt h e c o n t r o lo f a d yp r o d u c t i o n t e c h n i c sw e r es t u d i e d am e t h o dt h a tc a l lq u i c k l yd e t e r m i n ew i n ea i c o h o ld e g r e ew a ss e l e c t e d i tn e e d sl e s s s a l n p l e , a n ds h o r t e rt i m e a n di sa c c u r a t ea n ds u h a b l ef o rt h el a r g ea m o u n to fa s s a yu n d e r t h ec o n d i t i o no f l a b t h er e s u l t so fd e t e r m i n a t i o no f8s t r a i n s t o l e r a n c et r a i to fa l c o h 0 1 s o z ，c 0 2 ，h i g h c o n c e n t r a t i o no f g l u c o s ea n dw i n e b r e w i n g t e s ts h o w e dt h a ts l a i na ，b ，c ，f ，hh a v eg o o d f e n n e m a t i o nc h a l a c t e r s t h ep r o d u c t i o nc a p a b i l i t yo fs t r a i na ，b ，c ，f ，hw a sd e t e r m i n e d ，i n c l u d i n gs u i t a b l e c a i t u r et e m p e r a t u r e ，s p e c i f i cg r o w t hr a t e ，b i o m a s sa n dt r e h a l o s ea c c u m u l a t i o n s t r a i na w a ss e l e c t e da sa d y p m d u c f i o ny e a a ，i t ss u i t a b l ec u l t u r et e m p e r a t u r ew a s3 2 。c ，s p e c i f i c g r o w t hr a t ew a s0 2 4 8 l ， ii nm a l te x t r a c t t r e h a l o a s ea c c u m u l a t i o nc o u l dr e a c h8 5 9 i n s h a k ef l a s k s e e dm e d i ao fs t r a i naw a s o p t i m i z e db yo r t h o g o n a id e s i g n , a n d t h ef e e d i n gc u l t u r e o f w i n e a d y i n 5 l f e m a e n t a t i o n j a r w a sc o n d u c t e d w i t l l f o u r d i f f e r e n t t e c h n i c s t h e r e s u l t s h o w e dt h a th e a ts h o c kt e c h n i c sw a st h eb e s t i nt h e1 3 hf e e d i n gc u l t u r e ，t h et e m p e r a t u r e w a sr a i s e df r o m3 0 。ct o3 2 0d u r i n g9 - - l o h f r o m3 2 * ( 2t o3 4 d u r i n g1 0 b 1l ha n d i e t a i n e d3 6 。ci nt h el a s t2 h u n d e rt h i sc o n d i t i o n ，t h eb i o m a s sc o u l dr e a c h13 4g lm a d i n t m c e l l u l a rt r e h a t o s ec o n t e n tw a sl9 3 8 t h ef e e d i n gc u l t u r eo fw i n ea d yi n15 0 lf e r m e n t a t i o nj a rw a sc o n d u c t e di nt h e l h c m r y ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc o m m o d i t yy e a s ta c c o r d e dw i t ht h eg e n e r a ls t a n d a r do f w i n ea d y ，w h i c hf u r t h e rp m v e dt h ea v a i l a b i l i t yo f p r o d u c t i o no f w i n ea d y w i t ht h eh e a t s h o c kt e c l m i c s k e y w o r d s ：a d y ，w i n e ，f e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r ，t r e h a l o s e ，f e r m e n t a t i o nt e c h n i c s 2 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 葡萄酒工业发展概况 葡萄酒是以新鲜的葡萄或葡萄汁为原料，经部分或完全酒精发酵酿制而成的 酒精含量不低于8 5 的饮料酒【l 】。它是世界上最早的饮料之一，发展历史源远流 长，在史前人们就发现了它，但是葡萄酒的生产一直是靠自然酿造，人类对其并 无理性的认识b3 1 。直到1 8 5 7 年法国微生物学家巴斯德( l o u i sp a s t e u r ) 有关酒精 发酵原理的发现 4 1 ，即葡萄酒是由酵母将葡萄汁转化为酒精，关于葡萄酒酿造的 科学研究才开始。此外，巴斯德还完成了许多与葡萄酒相关的研究，如葡萄酒的 成分、葡萄酒的老化以及有关葡萄酒的变质等，这使得葡萄酒的酿造技术得以大 幅度提升并成为专门的学科【4 】。进入二十世纪，葡萄酒的酿造技术又有了很大进 步，不仅可以精确的控制酿造过程，而且还发明了各种新式酿造方法。 据研究分析，葡萄酒中除水和酒精外，还含有许多其它物质，如甘油、高级 醇、芳香物质、色素等，这些物质的多少和比例决定了葡萄酒的种类和风味i j “。 葡萄酒中还含有多种氨基酸、维生素和矿物质，其中包括人类必需的八种氨基酸、 能促进红血球细胞成熟的b 1 2 和补血的主要元素铁喊7 1 。由于葡萄酒具有较高营养 价值，所以它作为一种低酒精度饮料倍受人们的青睐，是饮料酒中长盛不衰的品 种。近年来，越来越多的科学研究也表明，适量饮用葡萄酒有益于人体健康，特 别是葡萄酒中的抗氧化性多酚类物质具有防止冠心病，动脉粥样硬化以及抗癌和 抗发炎等功能【8 ，9 1 ，这大大刺激了葡萄酒的消费，葡萄酒工业也因此越来越受重视。 目前全世界大部分国家和地区都种植葡萄并酿造葡萄酒，由于受气候等因素 的影响，葡萄的产量并不稳定，葡萄酒的产量也年年不刚1 0 】。全世界葡萄酒的年 产量在2 5 0 0 3 0 0 0 万吨之间。由于历史和文化因素，葡萄酒的生产和消费主要集 中在西方国家，特别是欧洲大陆。欧洲是葡萄酒的最大产地，全世界7 5 的葡萄 酒出产在欧洲，其中意大利、法国和西班牙三大生产国的葡萄酒产量占世界总产 量的5 0 。美洲主要的葡萄酒生产国为美国、阿根廷、加拿大及巴西、智利掣j 2 j 。 两千多年前的西汉时代，我国就有了葡萄的种植及葡萄酒的生产【1j ，但葡萄 酒的发展十分缓慢。我国第一个近代新型葡萄酒厂是1 8 9 2 年华侨实业家张弼士在 山东烟台开办的张裕酿酒公司。解放后，葡萄酒工业才得到了国家的重视，有了 迅速的发展。不仅老厂，如张裕酿酒公司，进行了改造与发展，还在河北、天津、 青岛、通化、长白山等地建立了新厂，引进国外优良的葡萄品种和先进的酿酒设 备，生产出了优质葡萄酒，在国内外有了一定的声誉。但是，我国的葡萄酒工业 与世界主要葡萄酒生产国相比还存在一定的差距，目前葡萄酒生产企业有二百四 前言 一卜多家，而生产规模较大，经营较好的葡萄酒企业只有十来家，葡萄酒的年产量 不足3 0 万吨。随着我国人民生活水平的提高，葡萄酒需求量呈逐年递增趋势，我 国的葡萄酒工业也亟待进一步的发展。 1 2 葡萄酒酿造用酵母概述 葡萄汁转化为葡萄酒本质上是一个微生物作用的过程，葡萄汁由酵母进行 酒精发酵，其反应较为复杂，包括有很多酶参与的诸多反应及非酶的氧化还原反 应等，除最后生成酒精、c 0 2 及少量高级醇类、酮醛类、酸类、酯类等成分外， 还会生成磷酸甘油醛等许多中间产物1 1 3 ，1 4 o 好的葡萄酒产品不仅需要优质葡萄 作为原料和科学的生产工艺，也离不开质量稳定、性质优良的葡萄酒酵母。优 良葡萄酒酵母不仅可以保证葡萄酒的安全发酵，还可以提高酒的质量，因此酵 母在葡萄酒生产中占有很重要的地位。 】2 1 葡萄酒酵母的一般性质 葡萄酒酵母( s a c c h a r o m y c e se l l i p s o i d e u s ) 为子囊菌纲的酵母属，啤酒酵母种。 该属的许多变种和亚种多能对糖进行酒精发酵，并广泛用于酿酒、酒精、面包酵 母等的生产中，但各酵母的生理特性、酿造副产物、风味等有很大不同。葡萄酒 酵母除了用于葡萄酒生产以外，还广泛用在苹果酒等果酒的发酵上l 5 1 7 1 。 在葡萄酒的酿造中，酵母繁殖以无性繁殖为主，其中绝大多数酵母采取出芽 繁殖方式，仅少数裂殖酵母采取横分裂繁殖方式。在遇到营养缺乏、环境条件严 酷时，葡萄酒酵母也会形成1 4 个子囊孢子，这在葡萄酒酿造中极为少见，仅在 发酵液残渣中偶尔能看到形成子囊孢子的酵母细胞；而在葡萄园中，酵母常以形 成子囊孢子的方式蛰伏过冬，当恢复到适宜条件时，这些孢子便发芽变成新的酵 母细胞。子囊孢子为圆形或椭圆形，表面光滑。 在显微镜下观察，葡萄酒酵母常有椭圆形、卵圆形、圆球形、圃柱形、柠檬 形等形态，细胞丰满。在葡萄汁琼脂培养基上，2 5 c 培养3 天，形成圆形菌落， 色泽呈奶黄色，表面光滑，边缘整齐，中心部位略凸出，质地为明胶状，很容易 被接种针挑起，培养基无颜色变化。葡萄酒酵母细胞的大小随种类、环境条件等 而差别较大，一般为( 3 1 0 ) pm x ( 5 1 5 ) um 。 葡萄酒酵母可发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖，不发酵乳糖、蜜 二糖，棉子糖发酵三分之一。 1 2 2 影响葡萄酒酵母生长和发酵的主要因素1 7 2 5 j ( i ) 温度 酵母只能在一定的温度范围内生长并起发酵作用。温度对酵母发酵的影响与 对酵母生长的影响是一致的：在一定范围皮发酵速度臆温度升高而加快。t 3 t 4 天津科技大学硕士学位论文 以下，酵母较难起酵，随温度升高酵母生长发芽加快，发酵活力随之增强。葡 萄酒酵母适宜的繁殖温度是2 2 3 2 ，在此范围内，温度提高1 ，单位时间内 转化糖为酒精的速度提高1 0 ，超过3 5 。c ，酵母成瘫痪状态，高于4 0 。c 完全停 止生长和发酵。 酵母能够转化的糖量或能生成的酒精量受温度左右。在2 0 3 5 范围内，较 高的温度起酵快，发酵速度快，发酵停止得较早，因而最终生成的酒精浓度较低； 较低的温度，发酵速度慢，但酵母不易衰老，发酵持续时间长，发酵彻底，最终 生成的酒精浓度高。 另外，温度对葡萄酒发酵时风味物质的生成也有明显影响。白葡萄酒的酿造 温度一般为1 6 2 0 ，红葡萄酒的酿造温度一般为2 5 左右。 ( 2 ) 酸度 在正常情况下，酵母在微酸性环境中( p h = 4 5 ) 的生长和发酵比在酸性环 境中( p h = 3 ) 更好。但由于酵母耐酸，为了抑制有害细菌的生长繁殖，葡萄酒 发酵的p n 值最好控制在3 3 3 5 。 ( 3 ) 发酵代谢产物 酒精和二氧化碳是酵母发酵的主要代谢产物，它们对酵母的生长和发酵都有 抑制作用。酒精对酵母的抑制作用因菌株、细胞活力、温度等而异。葡萄酒酵母 比其他酵母忍耐酒精能力较高，因此它阻碍了大部分有害微生物在果汁中的繁殖。 耐酒精酵母是生产高酒精度葡萄酒的有用菌株。 二氧化碳生成的摩尔数与乙醇相同，但多数二氧化碳在发酵过程中外逸，即 使如此，二氧化碳在葡萄酒中的溶解度也是相当商的。在较高的二氧化碳浓度下， 酵母的生长和代谢受到影响，发酵速度减缓。 ( 4 ) 二氧化硫 往葡萄酒汁中添加二氧化硫可以抑制或淘汰不必要的微生物，保证酿酒酵母 发挥主导作用，但二氧化硫的添加也会影响酿酒酵母的繁殖，延迟发酵的进展。 ( 5 ) 氧 氧是酵母生长繁殖和发酵的限制因素，在供氧充足的条件下，酵母消耗糖， 获得能量而生成大量的细胞；在无氧条件下，酵母发酵糖生成酒精和二氧化碳， 但这不是绝对不需要氧，微量的氧对酵母吸收长链脂肪酸、合成甾醇、维持酒精 发酵的进行是必不可少的。研究表明，在有氧条件下，酵母发酵葡萄糖的速度比 在无氧条件下更快，这种氧对乙醇发酵的刺激作用，称为卡斯特效应。因此，葡 萄酒发酵初期，为了获得足够强壮的酵母细胞，保证发酵的顺利进行，应使发酵 醪中含有适当的氧，但应避免过度供氧导致酵母过多繁殖，消耗糖分，降低酒精 得率，影响酒的风味。 前言 ( 6 ) 糖 糖的浓度影响酵母的生长和发酵。葡萄汁中含的糖绝大部分是葡萄糖和果糖， 不同酵母对糖的利用能力不一样，这些差异与酵母细胞对耱的亲和性以及细胞膜 的通透性、膜输送系统的能力有关。酵母在1 2 低糖浓度时，发酵速度最快， 糖浓度大于5 左右时开始对酒精发酵有一定抑制作用，糖浓度超过2 5 发酵出 现延滞。 1 2 3 葡萄酒酿造方式 1 2 3 1 自然发酵 葡萄成熟时，在葡萄果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，因此，葡萄破碎 后，酵母就会很快繁殖，开始发酵，这是利用天然酵母发酵葡萄酒。在葡萄酒自 然发酵的整个过程中所涉及到的酵母，包括于2 5 个属约1 5 0 个种，几乎遍及酵母 的主要属种，而直接参与葡萄酒酿造的酵母只是其中的一部分，主要有酿酒酵母、 贝酵母、拜耳酵母、柠檬形克勒克酵母、克鲁斯假丝酵母和粟酒裂殖酵母等。其 它酵母，如尖端酵母、巴氏酵母、圆酵母属等，统称野生酵母 1 l l 】。野生酵母的 存在对发酵是不利的，它要比葡萄酒酵母消耗更多的糖才能获得同样的酒精，发 酵力弱，生成酒精量少，从而影响葡萄酒的质量。大量的研究结果表明，葡萄上 酵母菌的种类、构成比和菌数。受产地、风土、气候、年份、葡萄品种、成熟期、 葡萄园的管理状况、葡萄受伤害程度、农药使用情况等种种因素错综复杂的影响。 传统的葡萄酒发酵是利用天然葡萄酒酵母进行发酵的，通常可以通过添加适量的 二氧化硫来控制野生酵母，因为葡萄酒酵母对二氧化硫的抵抗力大于其他酵母。 1 2 3 2 纯种发酵 在葡萄栽培和酿酒环境得天独厚、酿酒传统悠久的欧洲某些地区，尤其是名 酒产地，目前仍然利用当地优越的天然酵母群进行自然发酵，制造具有地方特色 风味的葡萄酒。但在气候条件不太理想，或由于使用农药，添加较多的二氧化硫， 葡萄汁过分澄清等原因，造成葡萄醪中自然酵母极少，酵母群构成有缺陷等情况 下，往往利用从天然酵母中选育出的优良纯种酵母进行发酵，以保证葡萄酒产品 的酒质。 优良的葡萄酒酵母应具有以下特性： ( 1 ) 不产生不良气味物质； ( 2 ) 具有良好的对二氧化硫的耐受能力； ( 3 ) 具有低温( 1 5 c ) 发酵能力，以保持果香和新鲜清爽的口味； ( 4 ) 具有较高的耐高糖能力，能将糖分基本发酵完，残糖在4 9 l 以下； ( 5 ) 具有较高的发酵能力，酒精产率高； ( 6 ) 生长繁殖速度快，具有稳定的发酵特性，发酵行为可以预测： 4 天津科技大学硕士学位论文 ( 7 ) 挥发酸生成少； ( 8 ) 具有较好的凝聚力和较快的沉降速度，发酵结束时便于从酒中分离。 实际上，要挑选一个具有全面优良特性而无任何不良性能的酵母菌株是很难 的，应根据使用要求和目的抓住主要的特性基准来考虑；另外，同一优良酵母对 不同品种葡萄的发酵效果也不完全一样，选择时还要注意菌株对葡萄品种的适应 性。 1 3 现代生物技术在葡萄酒酿造中的应用【2 q 1 3 1 酵母菌株的改良 由于分离筛选到的优良酵母不可能一切特性都符合理想的要求，适合所有场 合使用，加之随着生产的发展，不断对酵母提出新的要求，因此，有不少科技人 员在从事葡萄酒酵母菌株的改良工作，以排出它们的不良性能，提高优瞧性能， 增添新的有用特性，适应生产发展的需要。 从生物学角度来看，除少数菌株外，大多数葡萄酒酵母均是同宗配合的二倍 体细胞。同宗配合这一特征使它们难与其他菌株杂交，所以葡萄酒酵母的生物特 性比较稳定，这也增加了对它们改良的难度。改良葡萄酒酵母最常用的手段是人 工诱变。近年来，通过对酵母酿造特性的遗传解析，利用原生质体融合、基因转 化等遗传工程的方法来改良葡萄酒酵母的探索现己在研究中。如通过遗传转化， 把控制细菌中苹果酸一乳酸发酵的基因导入葡萄酒酵母中，使葡萄酒酵母在酒精 发酵的同时，具有苹果酸一乳酸发酵( m a l o l a c t i cf e r m e n t a t i o n , m l f ) 降酸的功能 【2 7 】。目前，已经对m l f 基因及其调节基因进行了定位和序列分析，转基因方法 已用于葡萄酒酵母工程菌的育种。研究证明，细菌的m l f 基因是由质粒基因编 码的，缺少质粒的细菌也就丧失了m l f 功能。基于这样的考虑，w i l l i a m s l 2 7 j 利用 限制性内切酶s a li 把m l f 基因整合到质粒p r c 3 上，构建了新的质粒p h w 2 ， 并利用穿梭载体把p h w 2 导入葡萄酒酵母中。载有p i - i w 2 质粒的葡萄酒酵母在进 行酒精发酵时，确实能部分分解苹果酸。 1 3 2 苹果酸一乳酸发酵( m l f ) 的控制 1 3 _ 2 1 乳酸菌的添j i l l 2 8 ，2 9 l 在葡萄酒的酒精发酵后期采用苹果酸一乳酸发酵，乳酸细菌以l 一苹果酸为 原料，在苹果酸酶和乳酸脱氢酶的作用下，生成l 一乳酸和二氧化碳，二元酸向 一元酸的转化使葡萄酒的总酸下降，酸涩感降低。另外，由于苹果酸比酒石酸的 生理代谢活跃，m l f 可使苹果酸分解，进而增加了葡萄酒的生物稳定性。m l f 的另一个重要作用是对葡萄酒风味的影响，因为乳酸细菌能够分解葡萄酒中的其 前言 他成分，生成乙酸、双乙酰等，这些代谢活动改变了葡萄酒中醛类、酯类、氨基 酸、有机酸和维生素等微量成分的浓度及成香物质的含量。 在葡萄酒酿造中，如果环境条件适宜，m l f 可以自然发生，但乳酸菌噬菌体 的存在可能推迟或抑制m l f ，所以往往根据不同的地域条件和原料品质，选择适 宜的乳酸菌种直接添加入酒精发酵结束后的原酒，以保证m l f 的顺利进行。 1 3 2 2p c r 技术对m l f 的检测p o j p c r 技术，即聚合酶链反应，是近几年发展起来的一种快速的特定d n a 片 段的体外扩增法，一般与电泳连用。p c r 技术可以用来对发酵中的某些特定菌进 行检验和鉴定，与传统的方法相比，它的最大特定是快速、准确。 在葡萄酒的苹果酸一乳酸发酵中，起主要作用的细菌是明串珠菌 ( l e u c o n o s t o co e n o s ) ，所以对明串珠菌的快速检测和鉴定是控制葡萄酒中m l f 的关键。p c r 技术已被发展成为一种快速直接的检测葡萄酒中明串珠菌的方法， 这是因为在明串珠菌的r n a 中有一段9 9 5 b p 的片段，这一片段是其所独有的， 与之相对应的有两个引物用来延伸这一d n a 片段，并进行特异性反应，以此来 鉴定明串珠菌，其最大检出量为1 0 3 c f u m l ，这样就能有效的检测m l f 中明串珠 菌的生长情况。 1 3 2 3p c r 技术对葡萄酒中生物胺的检验1 3 ” 生物胺，如组胺，是血管收缩剂，能刺激胃液流入胃中，并涉及各种变态反 应。当生物胺浓度过高时，会引起人体不愉快的生理学反应。多种食物和饮料都 含有生物胺。乳酸菌能使氨基酸脱羧生成生物胺。因为葡萄酒的酿制包括m l f ， 所以生物胺的生成成为必然。a l i n el o n v a u df u n e l 证明了用p c r 技术或d n a 探 针技术对生物胺进行检测的可行性。c o t o n ，e 等对葡萄酒中产组胺的乳酸菌出现 的频率进行了研究，他们用p c r 技术对来自法国s w 的代表1 1 8 种葡萄酒的2 5 0 个完成m l f 的酒样进行了检测。结果证明，约有4 9 的葡萄酒中含有组胺生成 菌，并证明h d c a ( h d c ，组氨酸脱羧酶) 基因的存在与否、h d c 的活性和最终 组胺的含量三者之间有密切的关系：在无h d c a 基因存在的情况下，h d c 失活且 无组胺生成；在有h d c a 基因存在的情况下，h d c 有活性且无组胺的生成；所以 具有h d c 活性的菌都为l e u c o n o s t o co e n o s ，并且其h d c 活性在贮酒阶段依然存 在。他们还发现，葡萄酒中组胺的含量是变化的，一般在0 2 1 3 1 0 5 8 m g l 之问； 含有组胺的葡萄酒也含有其他生物胺如鸟胺和酪胺等；不含组胺的葡萄酒只含有 痕量的其他胺。因此，可以用p c r 技术对组胺生成菌l o e n o $ 进行早期检查，当 然最有效的方法是用一种无组胺生成的发酵剂来代替l o e n o s 。 天津科技大学硕士学位论文 1 4 葡萄酒发酵工艺的发展与葡萄酒活性干酵母的应用 1 4 1 葡萄酒发酵工艺的发展 最初的葡萄滔生产是利用葡萄果皮、果梗上带入的天然酵母进行发酵，这个 发酵过程不是由单一的酵母菌种完成的，而是由复杂的酵母群共同作用完成的。 在酿酒传统悠久的欧洲，特别是某些名酒产地，目前仍然沿用这种古老的葡萄酒 酿造方式，以保持当地葡萄酒的特色与传统。自然发酵所得的葡萄酒高级醇等物 质含量多，风味醇厚。 在欧洲以外的许多新兴葡萄酒生产国，更多是的采用添加纯种培养酵母的方 法进行葡萄酒的酿造，这样可以使优良的葡萄酒酵母很快的占压倒优势，减弱其 他酵母的作用，以保证正常顺利的发酵并缩短发酵时间，良好的完成酒化作用， 确保酒质上乘和稳定。弥补酿造环境的不足。添加纯种培养酵母发酵所得的葡萄 酒发酵顺利、残糖低、酒精含量商、酒质净爽。 但是，利用纯种酵母进行葡萄酒发酵存在酵母的扩大培养过程，而葡萄酒生 产有很强的季节性，每年只有1 2 个月，为了进行酵母的扩大培养需要制各一套 培养系统，利用率很低。葡萄酒活性干酵母的出现很好的解决了这一问题，葡萄 酒活性干酵母使用方便，不受接种时间限制，解决了葡萄酒厂扩大培养酵母的 麻烦和鲜酵母易变质、不好保存等问题，为葡萄酒厂提供了很大的方便。 1 4 2 葡萄酒活性干酵母的产生 本世纪初法国的克莱尔研究所向市场提供了种人工培养的酵母悬浮液用于 葡萄酒的生产，但是由于这种悬浮液必须在低温下储藏且易于变质，因而未能被 大规模采用。6 0 年代初，在美国市场上出现了压榨形式的用于葡萄酒酿造的鲜酵 母。由于鲜酵母含水量高，易变质，而葡萄酒厂分布各地，要做到低温快速销售 比较困难。因此，研究者们效仿面包活性于酵母的制造方法，利用现代酵母工业 的技术来大量培养葡萄酒酵母，然后在添加保护剂的条件下，低温真空脱水干 燥，填充惰性气体，包装成商品出售，即制成活性干酵母( a d y ) 1 3 2 。 1 4 3 葡萄酒活性干酵母的概述 葡萄酒活性干酵母一般是浅灰黄色的圆球形或圆柱形颗粒，优良葡萄酒活性 干酵母产品应具有以下质量指标m 1 ： ( 1 ) 水分含量： 8 0 ( 5 ) 保质期：2 4 个月 根据实际经验，葡萄酒活性干酵母具有以下优点【3 3 1 ： 7 刖蟊 ( 1 ) 发酵彻底：葡萄酒的发酵作用是将葡萄中的糖分充分转化为酒精。发酵产 品中的残糖量越低，发酵作用也就越彻底，这有利于防止杂菌的污染，同时有利 于葡萄原酒的贮存与陈酿。 ( 2 ) 原酒挥发酸含量低：由于葡萄酒活性干酵母加入葡萄汁中后便迅速繁殖成 大量强壮的酵母细胞，形成旺盛的发酵力，有力地抑制了原果汁中和环境中侵入 的杂菌，而使发酵原酒的挥发酸降低，提高了葡萄酒的质量。 ( 3 ) 加快发酵速度：将葡萄酒活性干酵母加入葡萄汁中，酵母细胞很快出芽、 生长、繁殖，发酵作用加快。根据生产对比的结果，加活性干酵母的与不加活性 干酵母的自然酵母发酵相比，起泡期普遍提前3 6 4 8 小时，而且发酵泡沫较多， 细小、洁白、平稳。 ( 4 ) 具有良好的耐s 0 2 性能：在发酵中活性干酵母能在总s 0 2 含量1 2 0 m g l 的条件下，顺利出芽、生长、繁殖。在发酵葡萄酒时添加s 0 2 1 2 0 1 3 0 m g l 于果 汁中，活性子酵母生长繁殖正常，发酵作用良好。面野生酵母在s 晓含量为 l o o m g l 的发酵液中，便受到抑制。果汁和发酵液中含有较高的s 0 2 ，能有效地 防止果汁中的某些成分氧化，保持良好的果香。 ( 5 ) 适于低温发酵：由于驯养的结果，葡萄洒活性干酵母在低温条件下具有旺 盛持久的发酵力。在低温1 5 2 0 的葡萄汁中，加入活性干酵母发酵，其泡沫洁 白旺盛，发酵出来的原酒保持良好的果香。野生酵母则要在温度较高的条件下， 才能加快生长繁殖，继而进行发酵。而在高温下发酵，不利于保持成品的果香。 ( 6 ) 加快酒的澄清：由于发酵液中加入了活性干酵母，发酵液中的酵母数在初 期明显优于靠自然发酵的酵母数，在控制发酵品温1 5 - - 2 0 的过程中，观察加入 活性千酵母的果汁，酵母数量增多，发酵作用加快，而在发酵结束时，发酵液中 的酵母细胞总数，加活性干酵母的却比不加的少。这说明活性干酵母在葡萄果汁 中出芽、生长、繁殖、发酵直到死亡的一系列过程中，新陈代谢作用加快；发酵 后期酵母迅速凝集结块和沉淀，加速了葡萄酒的澄清。 ( 7 ) 提高了糖的利用率：葡萄酒的酒精发酵过程是在厌氧的状态下进行的。首 先是发酵液中大量增殖酵母+ 当增殖至发酵液中足够量时，缺氧进行酒精发酵而 产生酒精与二氧化碳。在增殖酵母细胞的过程中，需要消耗发酵液中的一定量的 糖分和其他养分。发酵液中预先加入一定量的活性干酵母，便减少发酵液中增殖 酵母所需的糖分。同时，活性干酵母又具有旺盛的发酵力。因此，加入活性干酵 母的葡萄酒发酵，可以提高糖的利用率，减少损耗，降低葡萄酒的生产成本。 ( 8 ) 节省人力：用活性干酵母与用人工扩大培养酒母进行葡萄酒发酵对比，由 于葡萄采收、加工因气候、运输等多种因素的变化而不稳定，扩大培养的纯种酵 母不能很好地与葡萄采收期紧密衔接，同时，人工培养酒母需要专f j 配备技术人 8 天津科技大学硕士学位论文 员。使用活性干酵母进行葡萄酒发酵，操作简便，将酵母直接复水活化即可。 ( 9 ) 减少设备费用：人工培养酒母进行葡萄酒发酵，除需专门配备技术人员外， 还需要培菌室、酒母室、酒母罐等场地设备。使用活性干酵母只需与酵母厂签定 合约、到时供货、及时使用即可。 q 0 ) 便于保存：活性干酵母采用铝箔真空包装，酵母细胞在于燥无空气无营养 物的条件下，处于休眠状态，易于保存。 总之，葡萄酒活性干酵母除了具有酵母的一般特性外，在实际应用中还为葡 萄酒质量控制提供了最有效的手段和保证。在发酵中，活性干酵母在数量上占相 对优势，能使葡萄酒酿造者更易于测试其纯度、活性及酵母菌种特征。同时因其 易于获得理想和可靠的接种及无需进一步技术投入，葡萄酒活性干酵母在现代葡 萄酒酿造中愈来愈成为最基本最可靠而且成本较低的生产要素。 1 4 4 葡萄酒活性干酵母的国内外发展概况 世界上许多葡萄酒厂已普遍应用葡萄酒活性干酵母进行葡萄酒的酿造，葡萄 酒的品种有干白葡萄酒、甜葡萄酒、葡萄香槟酒、佐餐葡萄酒和葡萄汽酒等。目 前，德、法、荷兰、美国、加拿大均已有优良的葡萄酒活性干酵母商品的生产。 产品除基本的酿酒酵母外，还有杀伤性酿酒酵母，二次发酵用酵母，增果香酵母， 耐高酒精含量酵母等许多品种。如，法国的s a f - o e n o s 葡萄酒活性干酵母，加 拿大l a l l e m a n d 公司生产的葡萄酒活性千酵母系列产品刚。 在我国的葡萄酒酿造行业中，8 0 年代初期开始使用活性干酵母。如，天津与 法国合作的王朝葡萄酒厂，引进法国葡萄酒业的先进生产技术，其中一项就是使 用葡萄酒活性干酵母，它在生产中显示了巨大的优越性1 3 ”。天津轻工业学院( 现 该名为天津科技大学) 于1 9 8 5 年进行了葡萄酒嗜杀性活性千酵母的研制，1 9 8 9 年轻工部食品发酵所也进行了葡萄酒活性干酵母的生产和应用研究幽】。但是在实 际的生产应用中还存在着许多问题，如酵母性能不够优良稳定等。我国的葡萄酒 产量逐年增加，但只有生产优质酒的厂家才考虑使用葡萄酒活性干酵母，且大部 分还是依靠进口，生产成本非常高。因此，寻找发酵和生产性能优良、稳定并适 于制备活性干酵母的葡萄酒用酵母菌株是非常必要的，这有利于国产葡萄酒活性 干酵母的推广与应用，这也是本课题的主要任务之一。 1 5 葡萄酒活性干酵母的生产 1 5 1 酵母生产工艺的形成 现代酵母生产工艺是在1 9 世纪末至本世纪2 0 年代大约5 0 年左右的时间里形 成的，在此之前，酵母是作为酒精生产的副产物得到的，产量很低。从1 9 世纪末 开始，酵母的生产发生了几个主要的变化： 9 前言 ( 1 ) 通气培养的广泛运用 1 9 世纪7 0 年代，巴斯德发现在有氧条件下，酵母的繁殖速度加快，而酒精 的产率下降，这被成为巴斯德效应。巴斯德的发现为酵母的通风培养法奠定了理 论基础。1 8 7 7 年，哥本哈根的e u s e b i u s b r u u n 提出了通风培养生产酵母的方法。 l8 8 6 年，采用通风培养法制造酵母的工厂在德国柏林诞生。通风的作用使酵母的 浓度大大提高，酒精的浓度大大下降，这使酵母工业和酒精工业分离。 ( 2 ) 流加培养工艺的发现 在1 9 1 5 年至1 9 2 0 年之间，丹麦和德国的科学家提出了采用连续补料的方法 培养酵母。这种方法要求在整个培养过程中控帚i 较低的糖浓度。在开始培养时， 培养液中的糖浓度就较低，在培养过程中不断补加糖液，酵母利用多少，就补加 多少。采用此方法既可获得较高的酵母收得率，又可获得高的酵母浓度。到目前 为止，这是唯一一种能生产大量酵母菌体而不产生大量酒精的方法。 ( 3 ) 用糖蜜替代粮食作原料 本世纪2 0 至3 0 年代，廉价的废糖蜜逐步取代了玉米、麦芽等粮食成为酵母 生产的主要原料，这是酵母生产工艺的一项重大改革，进一步降低了酵母的生产 成本。采用糖蜜作原料有三大优点：一是简化了酵母生产工艺，取消了以粮食为 原料生产工艺中复杂的原料处理过程；二是糖蜜是制糖工业中的废品，价格低廉； 三是糖蜜的营养较丰富，含有酵母生长所必须的多种维生素，有利于酵母的生长 和产品质量。 1 5 2 活性干酵母发展阶段 原始的活性干酵母起源于1 9 世纪上半世纪。当时，压榨酵母的干燥方法有吸 附法和吸水干燥法，这些方法可以把酵母干燥至含水份2 0 左右，这种原始的活 性干酵母水份大，保存期短。从2 0 年代到5 0 年代，活性干酵母的制造普遍采用 静态气流干燥法。在干燥过程中，酵母颗粒基本上处于静止状态，因而传热效果 较差，干燥时间长，而且酵母受热不均，活性损失较大。5 0 年代后，由于动态气 流干燥方法的普遍采用，干燥室温度和酵母颗粒品温有所下降，干燥时间大大缩 短，酵母的活性损失相对较少，发酵力较静止状态的干燥产品大大提高。6 0 年代 开始，活性干酵母的生产技术得到了迸一步的发展，由于添加剂的广泛使用和干 燥技术的进一步成熟，活性干酵母的产品质量不断提高，产品也更加多样化。目 前，活性干酵母的水份含量已降至4 - - - 5 ，保存期可达2 年以上1 3 6 j 。 1 5 3 海藻糖与活性干酵母的关系 大量的研究证据表明，某些物种对外界恶劣环境所表现出的抗逆耐受力和它 们体内存在的海藻糖有直接关系。如从植物细胞的脱水过程中可以发现，海藻糖 能够有效的保护细胞膜结构和蛋白质1 3 7 , 3 8 ，明显地使植物细胞处于悬浮状态，从 1 0 天津科技大学硕士学位论文 而可保存其固有的风味、色泽和纹理。 作为一种重要的碳水化合物，海藻糖也存在于酵母营养细胞和孢子中，并被 认为对调节和保护细胞在极端条件下的活力有重要作用，如在高温、脱水、冷冻 等条件下，海藻糖可以起到保护酵母细胞结构的作用口叫”。在长期饥饿条件下酵 母的存活率也依赖于胞内海藻糖含量。在活性干酵母的生产中，高的海藻糖含量 是鉴定活性干酵母质量和活性的一个重要指标。 酵母海藻糖生物合成以6 磷酸葡萄糖和u d p _ 葡萄糖为底物，在6 磷酸 海藻糖合成酶催化下形成6 磷酸海藻糖，而后再经6 一磷酸海藻糖磷酸酯酶作 用，脱去磷酸基，生成海藻糖。而海藻糖的分解代谢则是在海藻糖酶作用下进行 的，一个分子的海藻糖在海藻糖酶的分解下形成两个分子的葡萄糖 4 2 ，4 3 1 。所以海 藻糖的含量是由合成和代谢的平衡调节的。这种平衡随着生长周期、营养和环境 条件的变化而发生变化。在酵母菌生长的初期和对数期，海藻糖积累量很低，只 有到达稳定期之后，才会出现海藻糖的大量积累。 i m p 霄莓糖1 i 塑型鳖骂6 - 舜蠢霄酾塑二堂盟海秘塑墼骘黼齄 6 - 礴璇葡t 鼍j 酵母菌体内海藻糖合成的两个关键酶是6 磷酸海藻糖合成酶和6 磷酸海藻糖 磷酸脂酶。研究证明，在海藻糖合成期间，通过对酵母进行热休克培养可诱导它 们的合成，进而引起胞内海藻糖含量的明显增加】；高渗透压可诱导6 。磷酸海藻 糖合成酶和6 磷酸海藻糖磷酸脂酶的转录，从而实现海藻糖的较多积累 4 5 ) 。 鉴于海藻糖对酵母的保护作用，在活性千酵母的生产中，应采用优化的培养 基，但对氮源加以限制，并采用相应的工艺条件来实现海藻糖在酵母菌体内的大 量积累，这样得到的活性干酵母存活率高、发酵力好。 1 5 4 酵母的流加培养 酵母的流加培养过程可分为三个时期，即适应期、积累期和成熟期。 ( 1 ) 酵母的适应期 酵母接种后，细胞从静止状态到开始大量繁殖所需的一段时间为酵母的适应 期，时间约半小时至两小时不等，具体情况依据培养条件和种子状态而定。在适 应期内，酵母细胞的原生质内发生复杂的生物化学过程，细胞数目并不增加，但 每个细胞的体积增大，原生质变的更加均匀，储藏物质逐渐消失，代谢机能非常 活跃，然后就开始出芽繁殖。 ( 2 ) 酵母的积累期 适应期结束后，酵母细胞即进入迅速生长繁殖的对数生长期，糖液和营养盐 1 前言 连续流加，同时通入空气。对数生长期开始时，由于培养液中细胞浓度较低，因 而糖液和营养盐的流加速度也较低，通风量亦较小。随着流加培养过程的进行， 细胞迅速繁殖，3 小时左右即可增殖i 倍，培养液中的细胞浓度及培养液的体积 不断增加，发酵罐中单位时间内的细胞数目增加越来越快，因而糖液和营养盐的 流加速率也相应不断增加，通风量也随之增加。至发酵中期后，细胞的增加速率 和糖液的流加速率也达最大，通风量亦达最大。随后酵母进入比较稳定的高速生 长期。在这段时间内，培养液中的细胞浓度保持较高的速率稳定增长，但比生长 速率开始下降，细胞的倍增时间从4 小时左右延长至6 小时左右，倍增时间为7 8 小时。在酵母积累期的中后期，营养盐一般不再流加，酵母的增加速率也逐渐 有所减小，因而糖液的流加速率也应适当减小。 整个积累期，酵母细胞般繁殖3 5 代，即扩大8 3 2 倍，一般地，积累期 的时间为l o 3 0 h ，依培养条件和繁殖倍数而定。 ( 3 ) 酵母的成熟期 积累期结束后，由于积累了好几代的细胞，细胞大小不尽均匀，有的子细胞 个体较小，因而有的还没有同母细胞分离，而有的刚出芽的细胞，其细胞内储藏 物质很少，海藻糖积累量相应地也很少。所以在积累期结束后，需要有一个适当 的酵母成熟期。在此期间内，不流加营养物质，且减少通风量。若培养液中氮源 等营养物质还未利用完，而含糖量已接近零，则应在小量通风的同时，适当补充 一定的糖液，使氮源耗尽并使芽孢脱落。成熟期的时间一般为o 5 2 0 h ，视细胞 状况和培养基中残存的营养物质而定。 最终的酵母产品应当是细胞成熟且个体较均匀，同时酵母细胞内的海藻糖含 量也应较高，而且出芽细胞的数量也应相当低。 1 5 s 培养工艺条件 i 5 5 i 培养工艺概要 ( 1 ) 主发酵培养基的选择 目前国内外普遍采用糖蜜作为面包酵母、食用酵母、酿酒酵母和药用酵母的 原料。糖蜜中除了有可发酵性糖外，还含有定的可发酵性氮、多种无机盐及维 生素，是酵母生产中比较理想的碳源。也可以利用淀粉质原料进行酵母的生产， 但此类原料要经粉碎、蒸煮、水解、过滤等过程制成水解糖后才能被酵母利用。 另外，工厂的废液，如玉米加工厂的废水、木材和蔬菜的水解液、造纸厂的亚硫 酸盐纸浆废液虽然都可以用来生产酿酒酵母，但并不是好的底物，用作饲料酵母 较为合适。 ( 2 ) 营养成分的确定 糖蜜原料中的可发酵性糖可以满足酵母的碳源需要，所含氮可以部分她被酵 1 2 天津科技大学硕士学位论文 母利用，但不足以满足酵母的生长所需。为了保证菌种正常生长，需要加入一定的 氮源。酿酒酵母可利用的氮源有氨、铵盐、尿素和氨基酸等，工业生产中通常使 用的氮源有一次同化氮尿素和二次同化氮氨水、硫酸铵、磷酸铵等。要考虑糖蜜 培养基中的糖氮比以及细胞对糖的收得率。另外，要考虑维生素和无机盐的添加。 1 5 5 2 培养工艺条件的控制 ( 1 ) 糖液 巴斯德在研究酵母菌的酒精发酵时，发现在有氧条件下，由于进行呼吸作用， 酒精产量大为降低，单位时间内的耗糖速度也减慢。这种呼吸抑制发酵的作用， 称为巴斯德效应。在有氧条件下，较高的糖浓度抑制酵母的呼吸作用，使之进行 发酵作用产生乙醇，而酵母得率下降。这种呼吸作用的减弱，称为克雷布特效应。 由巴斯德效应和克雷布特效应可知，酵母的糖代谢受氧和糖浓度的影响，使 呼吸和发酵作用间相互调节。酿酒酵母一般具有较弱的巴斯德效应和较强的克雷 布特效应，因此即使培养基中溶解氧的浓度足以满足细胞生长的需要，在含有高 浓度的糖时也会产生乙醇。只有当培养基中的有效糖浓度下降到某一临界值时， 酵母菌才能完全停止有氧发酵，同时消耗乙醇。在以酵母为产品的发酵生产中， 乙醇的生成会使细胞产量下降，因此为了获得较高的酵母收得率，就必需严格控 制糖的浓度。 而在整个发酵生产中将有效糖的浓度控制在乙醇生成的临界浓度以下是不现 实的，这是因为糖浓度太低酵母的生长会受到限制。可以在发酵开始的适应期， 有意加入过量的糖液，结果在发酵前期产生较多的乙醇，这样做有利于防止杂菌 污染。而在发酵中后期，当培养液中的糖被耗尽时，酵母开就始同化利用生成的 乙醇，防止了因为乙醇的生成而损失糖分，从而导致的酵母得率的下降。 ( 2 ) 温度 一般酵母的最适生长温度范围在2 8 3 6 之间，超出最适生长温度，酵母的 生长速率有所下降。另外有研究表明，酵母的生长得率随温度的上升而下降。但高 温【4 5 】能引起胞内海藻糖含量的明显增加，对海藻糖的积累有利。所以应在流加培 养前期采用较低