（环境科学专业论文）海洋厌氧活性菌株系统分类学地位研究及发酵条件优化.pdf

人连交通人学t 学硕十学位论文 a b s t r a c t m a r i n em i c r o b i o l o g i c a lr e s o u r c e sa r eat r e a s u r yo fr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n ti n2 1c e n t u r y a n dt h ei n v e s t i g a t i o no fa c t i v ee x t r a c t sf r o mm a r i n em i c r o b e sh a sa l r e a d yb e c o m et h e r e s e a r c hf o c u sa l lo v e rt h ew o r l d e s p e c i a l l y ，m a r i n ea n a e r o b i cb a c t e r i ah a v eb e c o m et h e r e s e a r c ho b j e c t so fr e s o u r c eo fn o v e la n t i m i c r o b a ls u b s t a n c e s b e c a u s eo ft h es p e c i a lm a r i n e e n v i r o n m e n t ，m a r i n ea n a e r o b i cb a c t e r i ac a no f t e np r o d u c ed i f f e r e n t i a ls e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ， w h i c hh a v eh u g ep o t e n t i a l i t yi np r o d u c t i n gb i o a c t i v es u b s t a n c e s u pt od a t e ，m o s to ft h e k n o w nb i o a c t i v ec o m p o u n d sh a v es h o w ns t r a i ns p e c i f i c i t yo fp r o d u c t i o n ，s ot h en o v e l b i o a c t i v es u b s t a n c e sc a nb eo b t a i n e db yc u l t u r i n gt h es p e c i f i cb i o a c t i v eb a c t e r i a a c c o r d i n g l y ， i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fb i o a c t i v eb a c t e r i af r o mm a r i n ea n a e r o b i cb a c t e r i ah a v eb e c o m e a ni m p o r t a n tp r e l i m i n a r yw o r kf o re x p l o i t a t i o no fn o v e ld r u g s as e r i e so fm a r i n ea n a e r o b i cb a c t e r i aw e r eo b t a i n e df r o mm a r i n es e d i m e n t s ，w h i c hw e r e c o l l e c t e df r o mt h es e aa r e aa r o u n dc h a n g h a it o w n ，p a p e rd i s ca g a rd i f f u s i o nm e t h o dw a s u s e dt ot e s tt h e i ra n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t6s t r a i n so ft h e mh a dt h e s t r o n g e rb i o a c t i v i t i e so fi n h i b i t i n gt e s tb a c t e r i a s y s t e m a t i cr e s e a r c h sh a db e e nd o n et ot h e s e6 s t r a i n s t h r o u g ha n a l y s i so fw h o l e1 6 sr d n as e q u e n c e ，m o r p h p l o g i c a lo b s e r v a t i o n ，a n d p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sd e t e r m i n a t i o n ，t h e s e6s t r a i n sw e r ei d e n t i f i e da s f o l l o w s ：1 1 1a n d1 - 3 1b e l o n g e dt op h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ；1 - 6 - 2b e l o n g e dt ov i b r i og e n u s ； 1 6 3 ，3 - 2 1a n d3 - 2 - 3b e l o n g e dt os h e w a n e l 肠g e n u s ，r e s p e c t i v e l y t h ei s o l a t i o no fb i o a c t i v es u b s t a n c e sf r o mm i c r o b e su s u a l l yd e m a n d sal a r g eq u a n t i t yo f l i q u i dc u l t u r e s a c c o r d i n g l y ，t h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft w os t r a i n so fm a r i n e p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i aw e r eo p t i m i z e d t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m a lc u l t u r e c o n d i t i o n so f1 1 - 1w a sa ts a l i n i t yo f2 ，p hv a l u eo f7 ，i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r eo f3 0 ， c u l t u r i n gt i m eo f1 0d ；t h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n so f1 - 3 - 1w a s ：s a l i n i t y 2 ，t h ev a l u eo f p h 一7 ，c u l t u r i n gt e m p e r a t u r e - 3 5 c ，c u l t u r i n gt i m e 一1 0d a y s n e s y s t e m a t i ci d e n t i f i c a t i o n so f6s t r a i n so fm a r i n ea n a e r o b i cb a c t e r i aw e r ep e r f o r m e d ， a n dt h ec u l t u r ec o n d i t i o n so fm a r i n ea n a e r o b i cp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i aw e r eo p t i m i z e d t h r o u g hd e s i g n i n go fo r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n ds i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t a l l o ft h e s e r e s e a r c h sc o n t r i b u t e dal o tf o rt h ei s o l a t i o na n de x t r a c t i o no fb i o a c t i v ec o m p o u n d sf r o m m a r i n ea n a e r o b i cb a c t e r i a k e yw o r d s ：m a r i n ea n a e r o b i cb a c t e r i a ；b i o a c t i v i t y ；s y s t e m a t i ci d e n t i f i c a t i o n ； f e r m e n t a t i o n h 大连交通大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢及参考 文献的地方外，论文中不包含他人或集体已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得太逵塞通太堂或其他教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 本人完全意识到本声明的法律效力，申请学位论文与资料若有不 实之处，由本人承担一切相关责任。 学位论文作者签名：赵否侮 日期：知岬年6 月争日 大连交通大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解太鎏塞通太堂有关保护知识产权及保 留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的 知识产权单位属太董交通太堂，本人保证毕业离校后，发表或使用 论文工作成果时署名单位仍然为太整銮通太堂。学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件及其电子文档，允许论文被查 阅和借阅。 本人授权太逵塞通太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入 中国科学技术信息研究所中国学位论文全文数据库等相关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 、 又。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名：巧这在主、 日期：汕9 9 年石月4 - 日 导师签名：裙 - 7 - 、 日期：卅年6 月千日 学位论文作者毕业后去向：秘 工作单位：矸研飞电微哆物甲矸 电话： 通讯地址： 邮编： 电子信箱： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 引言 海洋覆盖地球表面积的7 1 ，是生命的发源地，其生物多样性远远超过陆地生物的 多样性。浩瀚的海洋是一个巨大的资源宝库，又是一个潜力巨大的天然药源。地球上8 0 生物资源都在海洋，约1 3 5 0 亿吨，每年繁殖量达4 0 0 亿吨。其中拥有世界3 0 0 0 万物 种的9 0 ，而陆地和淡水拥有的物种还不到1 0 。现在已经找出有药理活性的海洋生 物1 0 0 0 0 多种，从中分离出3 0 0 0 多种有医用价值的活性物质i l j 。 海洋环境条件恶劣，具有高盐、高压、低温和寡营养等特点。为了适应这样的生存 环境，海洋微生物产生了与陆地生物不同的代谢系统和机体防御系统，因此，在海洋生 物及其代谢产物中发现了许多具有特异、新颖、多种多样化学结构的生物活性物质，包 括多不饱和脂肪酸、萜烯、大环内酯类、醌类醚类、生物碱及杂环化合物等【2 j 。这些海 洋生物活性物质中有些成分的结构、性质已被阐明，也有许多是含有尚未鉴定其活性分 子结构的微生物萃取物。 海洋微生物有产生生物活性物质的巨大潜力，目前已从海洋微生物( 包括海洋细菌、 海洋真菌和海洋放线菌) 中分离到许多海洋生物活性物质，这些物质化学结构丰富多样， 许多分子结构新颖独特，是陆地生物所不具有的【3 1 。因此，人们对从海洋环境中极其多 样性的微生物中开发到新的特效药寄予极大的希望。目前，已知的大多数生理活性化合 物的产生是菌株特异的，故可直接培养分离到的菌株以取得新生理活性化合物。因此， 对新药的开发而言，从海洋细菌中筛选具有抑菌活性的菌株是一项重要的前期工作。目 前，大多数具有抗菌生物活性的海洋细菌主要从海洋动物、植物体表或者体内分离得到 【4 5 l ，而直接从海洋底泥中进行具有抗菌生物活性的海洋厌氧细菌分离与鉴定的研究则少 有报道。从海洋底泥中分离海洋厌氧细菌具有取材方便、细菌种类丰富的特点。 本课题为针对从大连长海县海域底泥中富集分离得到的海洋厌氧细菌抗菌活性筛 选和菌种鉴定研究，旨在富集、筛选、探明和保存药源海洋厌氧细菌，明确其系统分类 学地位，同时为从中提取得到结构新颖独特的药用先导化合物奠定基础。 海洋厌氧细菌由于在代谢过程中需要进行特殊的代谢作用，其次生代谢产物在理论上必 然会与常规研究的好氧海洋微生物有较大的差别，从中分离出的药用先导化合物也将会 拥有全新功能结构，从而在克服耐药菌问题、恶性肿瘤化疗剂疗效退化和抗药性的现象 起到关键的作用。因此，从海洋厌氧细菌的生物活性筛选和系统分类学鉴定一方面具有 人连交通人学t 学硕十学位论文 极其重要的理论价值，另一方面也将为新一代药物的开发探明新的资源宝库，为我国开 创自主创新药物作出一定的贡献。 1 2 海洋微生物研究进展 1 2 1 海洋微生物多样性 海洋微生物种类繁多，因而在物种、基因组成和生态功能上具有多样性，是整个海 洋生物多样性的重要组成部分。通常情况下，生物多样性可以理解为生物物种的多样化 及其变异的程度和广度，是物种多样性、遗传多样性和生态系统多样性3 个层次上的综 合表述l 们。海洋微生物多样性( m a r i n em i c r o o r g a n i s m sd i v e r s i t y ) 是指所有海洋微生物种类、 种内遗传变异和生存环境的总称，包括生存环境的多样性、生长繁殖速度多样性、营养 和代谢类型多样性、生活方式的多样性、基因的多样性以及微生物资源开发利用的多样 性等【7 ，8 1 。海洋微生物多样性自身的特点和当前研究的手段，决定了目前海洋微生物多样 性的研究通常集中于以下4 个水平，即分类多样性、功能多样性、遗传多样性和系统发 育多样性【9 1 。由于海洋环境的特异性而造成的海洋微生物的多样性和特异性，为人类提 供了种类繁多、分子结构新颖、化学组成复杂和生理特异的海洋天然产品，它是药用活 性物质、生物信息物质、保健食品和生物功能材料的巨大宝库。海洋微生物多样性等基 础性研究是海洋资源开发和利用的前提。 1 2 2 海洋微生物的特点 海洋环境条件恶劣，具有高压、高盐、高温( 低温) 、低光照、寡营养等特点。特殊 的海洋环境赋予了海洋微生物新的特点： ( 1 ) 海洋微生物包括了几乎所有的微生物种类。有的种类起源于海洋，也有的种类起 源于陆地，但进入海洋后适应存活了下来。前者因为独特的海洋环境而具备特殊 的生理活性和遗传背景；后者则因为进化产生的生理和代谢系统上的适应性，形 成了与陆地微生物不同的生理和代谢系统。 ( 2 ) 海洋微生物功能的多样性。如耐盐性、耐寒性、耐高温、耐高压等特性，光合成： 固氮、硝酸盐还原、发光、吸磁、稀有金属浓缩、环境治理和清污、能量交换、 信息传递等能力。海洋细菌通常能液化琼脂且具有盐耐受性，而陆地上的细菌则 很少具有这样的能力。 ( 3 ) 许多从海洋中分离的微生物具有和陆地微生物相同的特征。有研究表明：许多海 洋微生物来自于陆地，在适应了海洋环境之后，获得了一些特殊的能力从而生存 下来。 ( 4 ) 海洋微生物可产生多种有特殊功能的活性物质。 2 第一章绪论 1 3 海洋微生物活性物质研究进展 海洋微生物具有产生生物活性物质的巨大潜力，目前发现的许多海洋生物活性物质 都分离白海洋微生物，并且发现以前有些被认为是海洋动植物产生的生物活性物质实际 上是与动植物宿主共生的微生物所产生的【1 。与海洋动植物相比，海洋微生物又具有生 长周期短、代谢易于调控、菌种较易选育等特点，因此，海洋微生物生物活性物质的研 究已成为开发海洋资源的重要内容。 1 3 1 海洋微生物活性物质研究意义 目前微生物活性物质绝大部分来自陆生微生物，由于对陆生微生物的长期研究已使 得这一古老资源日趋枯竭，导致新抗生素发现的速率明显减慢，科技投入产出率不断下 降。据资料显示，1 9 8 8 1 9 9 2 年间，来源于陆栖链霉菌产生的新化合物已由7 4 7 下降 到5 0 5 。近年来9 0 以上筛选出的生物活性物质随后证明为以前研究过的组分，而且 大量的感染型疾病正对传统的抗生素形成耐药性，所以人们开始寻找新的物种，新物种 必然有新的基因，其代谢产物中产生活性物质的可能性较大。基于这一思路，海洋微生 物这种过去很少触及的微生物资源越来越受到重视。可供开发利用的海洋微生物资源的 不断发现，为开拓新药源展现了曙光。 1 3 2 国内外海洋微生物活性物质研究发展现状 世界上海洋生物活性物质的研究起始于5 0 年代末6 0 年代初。美国是最早开展海 洋生物活性物质研究的国家，随后各国学者相继开展了海洋生物抗肿瘤、抗病毒、嚣抗真 菌、抗心脑血管病、抗艾滋病等活性成分的研究。在过去的几十年间，大约6 0 0 0 多种 海洋天然产物被发现，其中有重要生物活性已申请专利的新化合物有2 0 0 多种1 1 。在已 发现的这些化合物中，不仅包括了陆地生物中已存在的各种化学结构类型，并且还存在 很多特殊的新颖化学结构类型。尤其重要的是，从海洋生物中发现了一系列高效低毒的 抗肿瘤化合物，其中有些已进入临床前或临床试验阶段。例如，从苔藓动物总合草苔虫 b u g u l a n e r i t i n a 中分离得到的大环内酯苔藓虫甲素b r y o s t a t i na 具有很强的抗肿瘤活性 ( 对p 3 8 8 白血病细胞的i c s o 为0 8 9 g m l ) ，现已进入临床i l 期试验研究；又如去氢膜 海鞘乙素d e h y d r o d i d e m i nb ，是从海洋被囊动物a p l i d i u ma l b i c a n s 中分离到的一个环肽 化合物，对l 1 2 1 0 白血病细胞的i c 5 0 为2n g m l ，现已完成临床i i 期试验。其他一些进 入临床研究的海洋生物天然产物还有如e t 2 7 2 9 和e t 2 7 4 3 ( 由被囊动物e c t e i n a c i d i a t u r b i n a t a 中发现) ，海兔毒肽d o l a s t a t i nl o ( f l 了软体动物d o l a b e l l aa u r i c u l a r i a 中发现) 等1 0 多种海洋天然产物【1 2 】。 3 人连交通人学t 学硕十学何论文 海洋微生物活性物质的研究经历了一个曲折的发展过程1 1 3 】。6 0 年代末7 0 年代初， 是海洋药物研究的第一个高潮。美、欧等国均投入大量人力、物力开发海洋药物。然而， 虽经多年努力，结果却不尽如人意。究其原因主要是由于当时分离技术、波谱测定结构 技术还很落后。加之海洋生物样品采集不易，其中所含生物活性成分的含量往往又极低， 难以测定结构等多方面的因素，导致海洋微生物活性物质的研究并未取得人们所预期的 成就。随着科学家研究热情的消退，海洋微生物活性物质的研究步入一个相对发展缓慢 的低谷时期。8 0 年代后期，随着科学技术的巨大进步，尤其是高分辨核磁共振技术、 质谱技术的广泛应用，使得微量化合物的结构测定工作变得相对容易，海洋生物活性物 质的研究才又变得热门起来。这一趋势可从世界著名的反映天然产物研究动态的学术刊 物“j o u r n a lo fn a t u r a lp r o d u c t s 近年来发表的论文中看得很清楚。进入9 0 年代，该刊 物每期均刊登相当数量的有关海洋天然产物研究的论文。海洋微生物已成为新天然产物 的主要来源。当前世界上海洋天然产物的开发研究正方兴未艾，走在这一领域前列的是 美国、日本及欧共体这些科技发达先进国家。 中国是应用海洋生物活性物质作为治疗药物最早的国家之一。海洋药物是我国中医 药学不可分割的一部分，中华本草中描述海洋药物约6 0 0 余种，海洋生物活性物质 从开始起便与祖国医学的理论结合在一起，说明其在中国发展的历史渊源。中国海域辽 阔，海洋生物资源丰富，为发展海洋药物提供优厚的物质基础。我国政府对中国海洋 药物研究事业显示高度重视。以海洋“8 6 3 计划，科技兴海计划为主体的海洋药物研 究专题正在开展，国家自然科学基金，国家新药基金等给予大力资助，并相继成立了一 批海洋生物研究中心，培养出一批海洋生物分类、化学、药理、生物培养、基因工程等 专业人员。近3 0 年来我国海洋药物发展迅速，涉及海洋中药、现代药物、新老制剂、 保健食品及已知重要成分和功效的药用海洋生物共3 0 0 余种。应用范围涉及抗菌抗病毒 类、心脑血管系统类、抗肿瘤类等【1 4 l 。 1 3 3 海洋微生物的活性筛选技术 以生物筛选为引导，从海洋生物中寻找活性成分已成为筛选海洋药物的常规方法。 现在许多化学研究室亦具备一些简单的生物筛选模型如b r i n es h r i m p 模型、细胞毒模型、 加速了活性成分筛选。以药物作用靶点如酶和受体作为筛选模型，使海洋药物筛选有了 更高的特异性。此外，以基因作为靶点的筛选模型也大量出现，这种模型可提供药物作 用机理等信息。计算机辅助筛选则利用计算化学、分子图形学等进行受体、酶或其它药 物作用靶点的结构模拟，配体受体复合物的结构模拟等方法将成为海洋药物研究的重 要方法。高通量药物筛选( h t s ) 亦为从大量海洋生物种属中寻找活性物质提供了快捷 方法。 4 第一章绪论 1 3 4 海洋微生物活性物质研究难点及解决方法 目前，由于提取分离、分析测试技术的进步，从海洋生物中发现新化合物已变得比 较容易，然而，绝大多数海洋生物活性物质含量极微。这一特征表明，对大部分活性物 质来说，直接利用海洋微生物作原料进行分离提取是很难满足需求的。鉴于海洋生物活 性物质的研究现状，寻找新的途径解决其来源问题是摆在国内外海洋生物活性物质工作 者面前的重要课题。海洋生物工程的应用有望突破这一难关。近年来大量生源学及生态 学的研究表明，海洋生物活性物质的最初来源绝大部分来自低等海洋生物，如藻类及其 共生菌类。应用生物培养、基因工程、d n a 重组等生物技术为大量获得海洋生物活性 物质提供了一个简捷可行的途径。今后一段时期内有关海洋微生物的生物活性物质的研 究重点将主要集中在以下几个方面【1 5 】：扩大筛选范围，寻找新的具有药用价值的微生物 资源，并建立适合海洋生物活性物质的大规模筛选技术；继续深入开展对海洋微生物的 分离提取和培养方法的研究：结合现代发酵工程技术，研究适合于海洋微生物的发酵工 艺条件和修饰方法，加快利用海洋微生物生产海洋药物及保健品的工业化进程；结合现 代生物工程技术，提高海洋微生物产物的质和量，重视可再生资源的研究与开发，保证 海洋生物资源持续有效的被利用。 1 4 海洋厌氧细菌生物活性物质研究进展 1 4 1 海洋厌氧细菌资源 海洋中常见的细菌主要属于以下几个系统类群：变形细菌类群、革兰氏阳性细菌类： 群、噬纤维菌属类群、浮霉状菌类群、疣微菌类群及一些人工尚未培养成功的系统类群 等。其他一些细菌类群也存在于海洋生态环境中，但研究报道较少1 1 6 j 。 早期人们从海水中分离得到的海洋厌氧细菌有9 0 以上是革兰氏阴性细菌，对这些 细菌的研究较多也较集中。随着研究的不断深入，海洋中越来越多的革兰氏阳性细菌被 人们所发现，它们大多分布于海洋沉积物和海洋生物共生系统中，并常在系统学上形成 独特的分支。海洋中的革兰氏阳性细菌包括产芽孢和不产芽孢的属群，主要有：芽孢杆 菌属、类芽孢杆菌、葡萄球菌属、链球菌属、消化球菌属、微球菌属、梭菌属、八叠球 菌属、动性球菌属、盐芽孢杆菌属、放线菌属等旧。 1 4 2 海洋厌氧细菌生物活性物质 目前，通过海洋厌氧细菌筛选来寻找抗菌素和其它具有医疗和保健价值的活性化合 物的开发研究正在迅速展开，许多具有新分子结构的抗菌、抗病毒化合物已被分离和鉴 定，其活性成分是多种多样的，其中有些成分的结构、性质已被阐明。也有许多含尚未 鉴定其活性分子结构的微生物萃取物，用于预防和治疗水产养殖动物的病害。海洋微生 5 人连交通人学t ：学硕十学位论文 物作为一个极其重要的，不可取代的具医药价值的生物活性物质的来源，其意义还在于 所含生物活性分子结构较简单的化合物可作为人工合成的模式，而所含大量的结构复杂 的化合物，人类目前尚无法合成，只能依赖从微生物细胞中提取，在这方面的研究中， 海洋厌氧细菌尤其具有特殊的研究价值。 海洋厌氧细菌生物活性物质主要包括抗细菌、抗真菌、抗病毒物质，其中以抗细菌 生物活性物质最为主要。许多海洋厌氧细菌可产生抗生素，这些海洋厌氧细菌来源很广， 包括假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、交替单胞菌属l t e r o m o n a s ) 、链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) 、 黄杆菌属( f l a v o b a c t e r i u m ) 、微球菌属、着色菌属( c h r o m a t i u m ) 、钦氏菌属( c h a i n i a ) 等。 根据相关报道【1 8 】，海洋厌氧细菌产生的抗生素主要有a n p e n t y l q u i n o l i n d 、m a g n e s i d i n s 、 i s t a m y c i n s ，a p l a s m o m y c i n s ，a l t e r m i c i d i n 、m a c r o l a c t i n s ，d i k e t o p i p e r a z i n e s ，o n c o r h y n c o l i d e ， t r i s i n d o l i n e 、p y r o l n i t r i m 、m a d u r a l i d e 、s a l i n a m i d e s 、靛红、对羟苯基乙醇、醌、t h i o m a r i n d s bc 等，其中许多种抗生素是陆生细菌所不能产生的。王书锦等【l9 j 对分离得到的5 6 0 8 株 海洋厌氧细菌研究表明，约有2 5 左右的海洋厌氧细菌具有不同程度的抗病原真菌、病 原细菌的能力。刘全永等【驯从海洋厌氧细菌l u b 0 2 中分离得到广谱抗真菌活性物质， 对人体病原真菌白色念珠菌( c a n d i d a a l b i c a n s ) 有较强的抑菌作用。j a r u c h o k t a w e e c h a i 等1 2 1 】 从海泥里分离出一株芽孢杆菌( b a c i l l u ss p ) s c 0 2 6 ，并从其培养液中分离出3 个大环内 酯化合物对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。f u d o u 掣2 2 j 从海藻中分离出 一种新属黏细菌h a l i s n g i u ml u t e u m ，从其培养液的丙酮浸出物中分离得到一个新的抗真 菌抗生素h a l i a n g i c i n 。 海洋厌氧细菌是海洋微生物抗肿瘤活性物质的一个重要来源。然而，自1 9 6 6 年 b u r k h o l d e r 从海洋假单胞菌分离得到具抗癌作用的抗生素硝吡咯菌素( p y r o l i n t r i n ) j t ：始， 直到上个世纪末人们才对海洋厌氧细菌的筛选、培养及代谢产物的研究重视起来，以期 从中得到新的特效抗癌药物。1 9 8 3 年，u m e z a w a 等【2 3 j 就从海洋湿润黄杆菌 ( f l a v o b a c t e r i u mu l i g i n o s u m ) 的代谢产物中得到一种杂多糖m a r i n a c t a n ，具有增强免疫活 性、促进体液免疫和细胞免疫功能，对小鼠肉瘤1 8 0 有明显抑制作用，还能抑制动物移 植肿瘤，与化疗药物在抗肿瘤方面协同作用，已作为治疗肿瘤的佐剂上市。近几年又从 海洋厌氧细菌中分离到多种抗肿瘤活性物质，如新的异香豆素p m 9 4 1 2 8 1 2 4 i 、赛可拉林 ( t h i o c o r a l i n e ) 和i b 9 6 2 1 2 i 驯等对肿瘤细胞p 3 8 8 、肺腺癌a 5 4 9 、结肠癌h t 2 9 及小鼠红 白血病m e l 2 8 表现出很强的细胞毒性。大环内酯化合物m a c r o l a c t i n sa 是深海底泥中一 株革兰氏阳性细菌c 2 3 7 发酵产生的一种物质，对小鼠黑素瘤细胞b 1 6 f i o 的l c 5 0 为 3 1 5 x g m l i 2 6 j 。醌环类抗生素k o s i n o s t a t i n 对人的骨髓性白血病u 9 3 7 细胞有明显的细胞 毒性( i c s o 为0 0 9 x m o l l ) ，并对2 1 种人类癌细胞具有抑制作用( i c 5 0 小于0 1 # z m o l l ) 1 2 7 j 。 6 第一章绪论 新萘醌类抗生素n e o m a r i n o n e l 2 8 1 在体外对h c t - 1 1 6 有中等细胞毒性( i c s o = 0 8m g l ) ，对 6 0 个人类肿瘤细胞群i c 5 0 平均值为1 0 m o l l 。f e n i c a l 研究组从一种新的海洋放线菌分 离出结构新颖的生物碱类化合物s e s b a n i m i d ea 和c ，对血癌细l 1 1 0 的i c 5 0 达0 8 n g m l 2 9 】；其中s a l i n o s p o r a m i d ea 对大肠癌细胞株h c t - 1 1 6 肿瘤细胞的i c 5 0 为1 1 n g m l 州。分离自海藻表面的细菌在含海水培养基中发酵能产生多糖类化合物，对小鼠 实体瘤具有抑制作用。 从海洋厌氧细菌中分离筛选的天然活性产物还有多糖、维生素、氨基酸等1 3 1 j ，如： m i k iw 等从一种屈挠杆菌( f l e x i b a c t e rs p ) 分离出类胡萝卜素；方金瑞等分离到类胡萝卜 素和b 2 胡萝卜素。 1 4 3 海洋厌氧细菌生物活性物质研究难点及展望 海洋厌氧细菌有产生多种新颖独特的生物活性物质的巨大潜力，在药物开发研究中 具有良好的应用前景，但仍存在着一些问题：活性物质筛选等基础性工作薄弱，有必要 建立系统化、规模化、高通量的活性物质筛选方法；海洋厌氧细菌生物活性物质开发的 产业化水平低，利用现代生物技术手段进行海洋生物活性物质开发刚刚起步，大部分项 目还是处于初期研究阶段。 尽管海洋厌氧细菌生物活性物质的研究开发还存在许多难题，但近年来随着化学： 生物、物理、制药等相关学科的发展和相互渗透，不断有新理论、新材料、新方法的研 究应用以及各种先进技术手段的相互配合，促进了海洋微生物天然活性物质的开发、生 产和应用，并为最终实现产业化生产提供了强有力的技术支持。今后我国海洋微生物活 性物质研究和开发的重点应包括海洋微生物的分离、鉴定与保存和新型生物活性物质产 生菌的筛选，探索适合大量培养海洋微生物、纯化活性物质等方面的技术研究。利用分 子生物学的方法建立海洋微生物的基因库，尝试通过生物技术将那些目前难以培养的微 生物基因进行异源表达。并发挥人才与技术和高校、科研院所与生产企业的优势，抓住 当前机遇，充分利用我国丰富的海洋生物资源，加快我国海洋微生物生物活性质的研究 和开发步伐。 展望未来，海洋厌氧细菌生物活性物质的研究应侧重于：不断寻找能产生新颖或高 活性的生物活性物质的海洋厌氧细菌；加强海洋厌氧细菌发酵条件优化研究，克服海洋 厌氧细菌难于大规模培养的问题，实现海洋厌氧细菌生物活性物质得量化生产，加速产 业化进程；促进海洋厌氧细菌活性物质的人工合成研究。随着现代的生物工程技术、化 学工程技术、医学等多学科的交叉运用，海洋厌氧细菌天然活性物质的研究、开发和人 工合成将取得更快的发展。 7 大连交通人学l ：学硕十学位论文 1 5 细菌的分类及鉴定方法 1 5 1 传统的分类鉴定方法 2 0 世纪4 0 年代以来，人们一直采用传统的分类方法来研究海洋微生物的多样性， 即将海洋微生物从环境中分离纯化，然后通过一般的形态学特征和生理生化特性来分析 其多样性。很多可培养的海洋细菌通过这种分类方法已经得到鉴定。据估计世界上的微 生物种类接近三百力【3 刭，而已被鉴定的种类仅有三、四千种【3 3 l 。这是因为海洋中的微生 物往往集结在一起，只有大约不到1 的海洋厌氧细菌可在实验室条件下培养，一些微 生物处于活的非可培养状态( v i a b l eb u tn o n c u l t u r a b l es t a t e ，v b n c ) 3 4 j ，而且由于培养基 选择作用以及微生物与其他生物共生等原因导致应用常规的分离培养方法无法全面的 反映海洋微生物资源状态以及生态功能，从而使大量的有极大应用价值的海洋微生物资 源被埋没。a m a n n 等【3 5 l 根据微生物原位的、不依赖于培养的微生物系统发育学的研究 结果认为：通过实验室人工培养方法已经分离和描述的海洋微生物物种数量占估计数量 不到1 ，而其余9 9 以上的微生物类群仍然未被分离和认识。细菌通过传统分类法进 行鉴定，首先需要分离得到单菌落，并对单菌落进行实验室培养，然后需要做大量的形态 以及生理生化等方面的实验，最后再把这些特征综合起来对照细菌分类手册进行鉴定 【3 6 】。常见的实验特征有j 形态特征( 革兰氏染色、鞭毛染色、运动性、芽孢染色、荚膜 染色、细胞壁、异染粒、色素、伴孢晶体等) 、菌落形态、生理特征( 生长温度、耐盐性、 需氧性、碳源利用、氮源利用、抗生素敏感性等) 、生化特征( 发酵类型、氧化酶、接触 酶、脂酶、吲哚、甲基红、磷酸酶、硫化氢等) 、营养分类( 光能营养、化能无机营养、 化能有机营养) 、致病性、共生关系等。传统分类鉴定测定项目众多，比较耗费时间和 人力，有时所得到的结果也不能保证其准确性。然而，传统的鉴定结果是描述细菌种属 特征所不可或缺的【了”。 1 5 2 分子生物学分类鉴定方法 自1 9 8 5 年p a c e 等f 3 8 】利用核酸序列的测序来研究微生物的进化问题以来，随着分子 遗传学和分子生物学技术的迅速发展，细菌分类学进入了分子生物学时代，微生物多样 性研究进入了一个崭新的阶段。采用p c r 和1 6 sr d n a 序列同源性比较等方法，在不经 过培养的条件下研究海洋微生物多样性、测定微生物之间的遗传相关性已经取得了较好 的进展1 3 引。w o e s e 和他的同事通过1 6 sr d n a 的序列分析法来研究原核生物的进化，认 为微生物的r d n a 序列在亚种、种、属、群和界的水平上有不同的信号序列，对原核 生物进化的认识大大提耐删。系统发生的核算系列分子分析技术的应用海发现了许多不 8 第一章绪论 能培养海洋微生物的新类群的存在，此信息的增加正迅速改变着许多细菌的分类地位 【4 1 1 。随着分子生物学的飞速发展，越来越多的方法被用于细菌鉴定【4 2 4 5 】。 目前，r r n a 分子作为一个分子指标已被广泛地用于各种海洋厌氧细菌分类学鉴定 的研究，加上大量已知微生物的基因序列都被测定并提交到国际基因数据库，成为对微 生物鉴定分类非常重要的参照系统，从而可以通过对未知微生物基因序列的测定和比较 分析，达到对其进行快速、有效的鉴定分类的目的。r a v e n s c h l a g 等m j 从永冻的海底沉 积物中分离得到了3 5 3 株微生物，通过1 6 sr d n a 斑点杂交发现它们大部分是脱硫弧菌， 与硫元素的循环紧密相关。1 9 9 3 年，l i e s a c k 和p a c e 等对r r n a 进行了扩增和分析，并 论述了以此为依据来推断环境中微生物的多样性。我国对海洋厌氧细菌的研究开始于2 0 世纪5 0 年代。5 0 年代后期报道了中国黄海近岸海水和沉积物中的两个属t h i o b a c i l l u s 和m i c r o c o c c u s ，1 9 6 1 1 9 7 3 年间对东海进行了海洋厌氧细菌的调查，在2 3 个站位分离 了1 3 0 0 多株异养菌报道了1 1 个属。目前，在国内运用分子生物学手段研究细菌多样性 正成为研究热点。张伟周等【4 7 】从内蒙古海拉尔地区碱湖样品分离纯化了一批嗜碱菌，并 通过生理生化特征、1 6 sr d n a 基因扩增后酶切分析以系统发育分析，揭示碱湖中嗜碱 细菌的多样性；戴欣等【4 8 】人通过构建1 6 sr d n a 基因文库对中国南海南沙海区沉积物中 细菌多样性进行析，并将获得的1 6 sr d n a 基因序列与国际基因数据库g e n b a n k 进行相 似性比较及聚类分析，研究发现来自海洋沉积物的尚不能培养的微生物( u n c u l t u r e d m i c r o o r g a n i s m s ) 往往组成一簇，与现已得到鉴定的微生物培养物( c u l t u r e d m i c r o o r g a n i s m s ) 自然分开。曾润颖等1 4 9 l 应用1 6 sr r n a 作为分子标记，对从东太平洋 海底分离到的一批嗜冷细菌进行了分子分类鉴定，并对其系统发育情况进行了分析。总 之，1 6 sr r n a 在细菌分类鉴定系统中发挥着举足轻重的作用，并将不断得到完善与发 展。 1 5 3 其他分类鉴定方法 鉴于传统的分类鉴定方法往往比较繁琐，很难实现快速鉴定，所以在传统的分类鉴 定方法的基础上，人们通过多学科技术的交叉应用，开创了许多成套的鉴定系统及编码 鉴定方法f 删。这些现代化鉴定手段的运用，大大减少了传统鉴定方法所消耗的时间和人 力，实现了微生物的快速鉴定。目前，这些应用上快速简便的鉴定系统已基本上实现了 商品化，例如美国安普技术中心推出的b i o l o g 细菌自动鉴定系统，以及m i c r o i d 系统、 e n t e r t u b e 系统、m i n i t e c k 系统、i d s 系统等。另外，国内也有不少商品化的编码鉴定 以及微型鉴定系统。 9 人连交通大学一1 ：学硕十学位论文 1 6 课题的目的、意义及研究内容 海洋微生物有产生生物活性物质的巨大潜力。海洋特殊的生态环境( 高盐度、高压 力、低温及特殊光照) 造就了大量陆地上不存在的微生物新种和作用独特、结构特殊的 活性代谢物质。因此，人们对从海洋环境中极其多样性的微生物中开发到新的特效药寄 予极大的希望【5 1 1 。目前，已知的大多数生理活性化合物的产生是菌株特异的，故可直接 培养分离到的菌株以取得新的生理活性化合物。因此，对新药的开发而言，从海洋厌氧 细菌中筛选具有抑菌活性的菌株是一项重要的前期工作。目前，大多数具有抑菌活性的 海洋厌氧细菌主要从海洋动物、植物体表或者体内分离得到f 5 2 5 3 1 ，而直接从海洋底泥中 进行抑菌海洋厌氧细菌分离与鉴定的研究则少有报道。从海洋底泥中分离海洋厌氧细菌 具有取材方便、细菌种类丰富的特点。 1 6 1 课题的目的及意义 海洋厌氧细菌由于在代谢过程中需要进行特殊的光合作用和无氧呼吸代谢，其次生 代谢产物在理论上必然会与常规研究的好氧海洋微生物有较大的差别，从中分离出的药 用先导化合物也将会拥有全新“母核”结构，从而在克服耐药菌问题和恶性肿瘤治疗化疗 剂疗效退化和抗药性的现象起到关键的作用。因此，从海洋厌氧光合细菌中筛选出的新 药先导化合物一方面具有极其重要的理论价值，另一方面也将具有成为新一代药物的巨 大市场开发潜力，为我国开创自主创新药物作出一定的贡献。 本课题利用采集自大连长海县海域的海洋底泥为实验材料，从中富集分离具有抗菌 生物活性的海洋菌株，对其进行广谱的抗菌活性筛选后，选取具有活性先导化合物研究 价值的菌株，通过1 6 sr d n a 序列同源性分析和传统的分类学鉴定方法，确定其系统分 类学地位，为进一步研究其产生的具有生物活性的次级代谢产物的研究指明方向。 1 6 2 课题的研究内容及技术路线 本课题研究的主要内容包括： ( 1 ) 富集分离海洋底泥样品中的海洋厌氧细菌，研究其抗菌生物活性。 ( 2 ) 活性菌株形态学研究：光学显微镜观察菌体形状、大小、革兰染色反应、芽孢、 鞭毛和运动性等；扫描电镜观察细胞表面结构和鞭毛精细结构。 ( 3 ) 活性菌株生理生化特性研究：包括对盐的需求、生长适宜p h 和温度范围、各种 碳能源的利用、生长因子的确定等。 ( 4 ) 测定活性菌株的1 6 sr d n a 序列，并将其1 6 sr d n a 全序列在美国国家生物技术 信息中心( n c b i ) 的g e n b a n k 基因序列数据库中进行同源性搜索( b l a s t ) ， 根据搜索结果进行同源性分析，采用c l u s t a lw 和m e g a4 0 软件构建系统发育树。 1 0 第一章绪论 ( 5 ) 通过正交试验，对生物活性较强的菌株进行培养条件优化，确定最佳发酵条件。 本实验流程如下： 缺氧区海水、底泥样 品采集口口刀c 采 厂l h u n g a t e 滚管分离琼脂震荡稀释分离 有机溶剂抽提 抗菌模型筛选 i 海洋厌氧活性菌株 厂 形态学鉴定 1 6 sr d n