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茶多酚与木瓜蛋白酶的络合及其在肉类加工中的应用 摘要 木瓜蛋白酶在食品行业用途广泛，而其热稳定性差又限制了它的应用。茶 多酚对木瓜蛋白酶具有络合作用，并能在一定程度上增强木瓜蛋白酶的热稳定 性。 本文以茶多酚为原料，采用b o x b e h n k e n 设计法，优选出茶多酚与木瓜蛋 白酶络合的最佳条件建立了二次多项回归模型y = 2 9 3 9 6 0 8 一o 6 1 4 8 8 9 x l 1 9 0 1 0 7 7 x 2 - - 0 7 6 0 5 9 7 x 2 2 + o 6 7 1 4 2 6 x 4 2 再对模型进行方差分析和模型系数显著 性检验，分析发现在四个因素中有两项是显著的，分别为温度和p h 值，反应时 间对评价指标的影响不显著；且该二次模型能解释8 1 5 8 响应值的变化；茶多 酚、木瓜蛋白酶络合的最佳工艺条件是：温度4 、p h 值6 0 、茶多酚与木瓜蛋 白酶的质量比2 ：i 。 在研究最佳工艺条件的基础上研究了木瓜蛋白酶在络合前后性质的变化， 包括酶的热稳定性、抗氧化性、酶对底物的亲和力等，并研究了酶的活性中心 和对络合木瓜蛋白酶的茶多酚单体进行h p l c 定性分析。研究发现，木瓜蛋白酶 在络合后热稳定性有所增强，热失活速率由o 7 2 8 8 m i n 降低至0 2 8 9 3 m i n ；络合 后的茶多酚一木瓜蛋白酶络合物对邻苯三酚自氧化过程的抑制率由原来大的 1 0 1 增加至1 6 4 ，其抗氧化性明显增强；络合后酶对底物的亲和力基本没有 多大的变化，米氏常数由原来的1 2 3 8 m m l 上升到1 6 7 6 m g m 1 测定木瓜蛋白 酶的巯基含量，发现残留巯基含量的减少趋势和酶活性的减少趋势是一致的， 表明活性中心位于巯基上；经h p l c 分析发现，茶多酚中有2 种单体与木瓜蛋白 酶发生络合作用，其中以e g c g 含量最高。 在茶多酚木瓜蛋白酶的应用前景中，本文研究了茶多酚一木瓜蛋白酶络合 物对肉制品的影响。分别对感官指标、酸价、过氧化值、菌落总数和肉制品的 嫩度进行了研究，结果表明，酶络合物的添加可以使肉制品的货架期从3 天增 加到5 天；对酸价、过氧化值均有抑制现象，储藏7 天后酸价从原来的 1 5 7 8 7 m g g 降低到1 4 5 2 5 m g g ，p o v 值从原来的0 1 0 5 m g g 降低到0 0 9 0 6 m g g ： 菌落总数也比对照样要少，储藏7 天后菌落总数l o g c f u g 由8 9 0 3 减少到 8 6 0 2 ；肉制品的嫩度有了一定程度的改善，放置5 h 后用物性测试仪检测剪切 力从原来的0 4 3 n 降低到0 2 2 8 n 。 关键词：茶多酚木瓜蛋白酶络合抗氧化性嫩度 t h ec o m p l e x i o no ft e a p o l y p h e n o lw i t hp a p a i na n di t s a p p l i c a t i o ni nm e a t p a c k i n g a b s t r a c t p a p a i nh a sb e c o m em o r ea n dm o r ep o p u l a ri nt h ef o o df i e l db e c a u s eo fi t s h y d r o l y t i cc h a r a c t e r i s t i c s t b a p o l y p h e n o lw a su s e dt oc o m p l e xp a p a i ni no r d e rt o i m p r o v ep o o rt h e r m a ls t a b i l i t yw h i c hl i m i t e di t sa p p l i c a t i o n t a k i n gt e a - p o l y p h e n o la sm a t e r i a l ，t h eb e s tc o n d i t i o nf o rt h ec o m p l e x i o no f t e a - p o l y p h e n o la n dp a p a i nw a so p t i m i z e di nt h ew a y o f b o x b e h n k e nf o rt h i ss t u d y b a s e do nq u a d r a t i cm o d e l ( y = 2 9 3 9 6 0 8 - - 0 6 1 4 8 8 9 x l 1 9 0 1 0 7 7 x 2 - - 0 7 6 0 5 9 7 x 2 2 + o 6 7 1 4 2 6 x 4 2 ) ，t h ea n a l y s i so f v a r i a n c ea n dt h et e s tf o rt h es i g n i f i c a n c eo f c o e f f i c i e n t i nt h em o d e lw e r ec o n d u c t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt e m p e r a t u r ea n dp hv a l u e w e r es i g n i f i c a n t ，b u tr e a c t i o nt i m ew a sn o ts i g n i f i c a n tt ot h ee v a l u a t i o ni n d e x t h i s m o d e lc o u l de x p l a i n81 5 8 r e s p o n s ev a l u e t h eb e s tc o n d i t i o n sf o rc o m p l e x i o no f t e a - p o l y p h e n o la n dp a p a i nw e r e ：t e m p e r a t u r ew a s4 c ，p hw a s6 0a n dq u a l i t yr a t i o o f t e a p o l y p h e n o la n dp a p a i nw a s 2 ：1 o nt h eb a s i so ft h ea b o v e m e n t i o n e dr e s e a r c h ，t h ep r o p e r t i e so fp a p a i nb e f o r e a n da f t e rc o m p l e x i o nw e r ei n v e s t i g a t e d ，i n c l u d i n gt h e r m a ls t a b i l i t y 、a n t i o x i d a t i o n 、 a p p e t e n c yo fe n z y m et os u b s t r a t e t h ea c t i v ec e n t e ro fe n z y m ew a si n v e s t i g a t e d a n dt h et e a - p o l y p h e n o lm o n o m e r sw e r ea n a l y s e dt h r o u g hh p l c t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h et h e r m a ls t a b i l i t yo fp a p a i nw a sa d v a n c e da f t e rc o m p l e x i o n ，a n d t h er a t eo fh e a tl o s sf a i l e df r o m0 7 2 8 8 m i nt o0 2 8 9 3 m i n t h ei n h i b i t i v er a t i oo f t h ec o m p o u n dt op y r o g a l l o li n c r e a s e df r o m1 0 1 t o1 6 4 a n da n t i o x i d a t i o nw a s s t r e n g t h e n e do b v i o u s l y a p p e t e n c yo fe n z y m et os u b s t r a t ew a sn o tc h a n g e dg r e a t l y a n dk mv a l u ei n c r e a s e df r o m1 2 3 8 m g m lt o1 6 7 6 m g m 1 m e r c a p t og r o u pc o n t e n t o fp a p a i nw a sm e a s u r e da n df o u n dt h ed e c r e a s e i n gt e n d e n c yo fm e r c a p t og r o u p c o n t e n ta n de n z y m ea c t i v i t yw e r ec o n s i s t e n t ，w h i c hs h o w st h ea c t i v ec e n t e rw a s m e r c a p t o t h e r ew e r et w ok i n d so fm o n o m e r si nt h et e a - p o l y p h e n o lw h i c hc o u l d c o m p l e xp a p a i nt h r o u g hh p l ca n a l y s i sa n dt h ee g c gc o n t e n tw a st h eh i g h e s t d u et ot h ep e r s p e c t i v eo fa p p l i c a t i o n so fc o m p l e xo ft e a p o l y p h e n o la n d p a p a i n t h ei n f l u e n c eo fc o m p l e x i o no ft h e mo np o r kq u a l i t yw a si n v e s t i g a t e d t h e s e n s i t i v ei d e x ，p o vv a l u e ，s u mo fb a c t e r i aa n dt e n d e r n e s so fp o r kp r o d u c tw e r e i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t sw e r et h ec o m p o u n da d d e dt ot h ep o r kp r o d u c tc o u l d i n c r e a s et h es h e l fl i f ef r o m3 d a y st o5 d a y sa n dr e s t r a i n e dt h ea c i dv a l u ea n dp o v v a l u e ，w h i c hd e c r e a s e df r o m1 5 7 8 7 m g gt o1 4 5 2 5 m 【g ga n df r o m o 1 0 5 m i g gt o 0 0 9 0 6 m g gr e s p e c t i v e l ya f t e r7d a y s s t o r a g e t h es u mo fb a c t e r i ad e c r e a s e df r o m 8 9 0 3t o8 6 0 2a f t e r7 d a y s s t o r a g e 。w h i c hw a sa l s of e w e rt h a nt h ec o m p a r a t i v eo n e ； t h et e n d e r n e s so fp o r kp r o d u c tw a si m p r o v e dt oac e r t a i ne x t e n ta n dt h ec u tf o r c e d e c r e a s e df r o m0 4 3 nt o0 2 2 8 n k e yw o r d s ：t e a p o l y p h e n o l ；p a p a i n ；c o m p l e x ；a n t i - - o x i d a t i o n ；t e n d e r n e s s 插图清单 图1 1茶多酚的结构通式”l 图1 2儿茶素的结构通式“2 图1 3多酚与蛋白质问的反应模式”7 图1 4多酚蛋白质阃的氢键示意图及反应机理”9 图2 一lb r a d f b r d 法绘制的可溶性蛋白含量标准曲线“1 7 图2 2 温度和p h 值对木瓜蛋白酶回收率影响的响应面图2 0 图3 16 0 下两种酶的热失活曲线2 6 图3 26 0 下两种酶的热失活动力学曲线2 7 图3 3热处理对木瓜蛋白酶巯基含量的影响曲线2 9 图3 4 热处理对木瓜蛋白酶活性的影响曲线2 9 图3 5酪氨酸标准曲线绘制3 0 图3 - 6 木瓜蛋白酶和它的络合物的l i n e w e a v e r b u r k 曲线3 0 图3 7 茶多酚的h p l c 分析图“3 1 图3 8茶多酚木瓜蛋白酶的h p l c 分析图3 l 图4 1物性分析曲线3 7 图4 - 2 储存期间肉类的酸价变化4 0 图4 3 储存期问肉类p o v 值的变化4 2 图4 4不同添加物对细菌总数的变化4 4 图4 5不同添加剂储藏期间嫩度的变化4 4 表格清单 表1 1茶多酚的使用参考3 表2 1主要化学试剂”l l 表2 2主要实验原料“ 表2 3 主要仪器设备1 2 表2 4 实验因素水平及编码”1 4 表2 - 5最适p h 值缓冲液的配制方法1 5 表2 - 6实验设计实测值“1 7 表2 7回归模型方差分析1 8 表2 8回归方程系数显著性检验1 9 表2 - 9 模型的验证结果2 0 表3 - 1主要化学试剂2 l 表3 2主要仪器设备一2 2 表3 3邻苯三酚d t t 终止法加样表2 4 表3 - 46 0 下两种酶的酶活变化趋势2 6 表3 5 邻苯三酚自氧化速率测定2 8 表3 - 6 邻苯三酚自氧化速率“2 8 表3 7酶活反应速率图3 0 表4 1主要化学试剂3 3 表4 2主要仪器设备3 4 表4 3 猪肉感官指标( n y y 6 3 2 2 0 0 2 ) 3 4 表4 4 感官指标评分标准”3 5 表4 5储藏期问肉样感官质量的变化4 0 表4 6 试样的p o v 值4 l 表4 7试样的菌落总数变化4 3 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所 知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外。论文中不包含其他入已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得金目王些塞堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 学位论文作者签字：倍，砬蠢鳖字日期：三叼年月l e t 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盒胆王些态堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留井向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人授权金b 王些太 堂可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者签名：晦位。鼓 导 签字日期：2 卵年6 月 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 解麴钐 少? 。 致谢 我的硕士毕业论文能够顺利完成，首先要感谢导师姜绍通教授，从论文的 选题、研究方案设计、论文研究进展到论文撰写的每一个细节，导师都倾注了 大量的心血导师严谨的治学态度、开放的学术思想和求实的工作作风也使我 受益非浅，同时我也要感谢潘丽军教授和郑志副教授对我论文期间的关心和指 导 本试验是在合肥工业大学生物与食品工程学院实验室完成的，论文的进行 过程得到了实验室很多老师以及课题组老师们和研究生们的热心帮助和支持， 在此一并表示我真挚的谢意。 最后我要感谢我的爱人张金锋和我的家人在我求学生涯中给予的默默支持 和理解。 作者；陈晓燕 2 0 0 7 年5 月 第一章绪论 1 1 茶多酚及其结构特性 1 1 1 茶多酚 茶叶是大众所青睐的一种饮料，喝茶的人占世界人口的2 3 ，它来自于茶 属的叶子中“1 茶多酚( t p ) 是茶叶的主要活性成分，占茶叶干重的2 0 3 5 ，是从茶叶的下脚料( 茶末、茶片、粗老茶或修剪叶) 中提取的茶多酚的结 构通式见图l l ”。 o h o r 3 r i = h ，o h r 2 = h ，一o c o r 3 = r ，一c r ( = o 图l l 茶多酚的结构通式 f i g u e1 一lc h e m i c a ls t r u c t u r e so ft e a p o l y p h e n o l s 茶多酚的主要成分为：黄烷醇类、花色素类、黄酮醇类、花白素类、酚酸 及缩酚酸类等6 类化合物。其中以黄烷醇类( 主要是儿茶素类化合物) 最为重 要，占茶多酚总量的6 0 8 0 h 1 。儿茶素类化合物主要包括；表儿茶素没食 子酸酯( l - e c g ) 、儿茶素( o 、l - c ) 、表儿茶素( l - e c ) 、表没食子儿茶素( l - e g c ) 和表没食子酸酯儿茶素没食子酸酯( l - e g c g ) “1 。其结构通式见图l 一2 。 0 h o h e c ： r l _ r 2 = h e g c ： r i = 0 h ，r z = h e c g ： r i = h ， e g c g ：r i = c h ，r c ：r 2 = h 陋o h 、n h 产惩o h 图i 一2 儿茶素的结构通式 f i g u e1 2c h e m i c a ls t r u c t u r e so f t e a - c a t e c h i n s 研究表明，茶多酚具有清除自由基、防止脂类过氧化的作用，因而被作为一 种高效低毒的优良天然抗氧化保鲜剂而被广泛应用于食品、化妆品、保健品和 药品等的生产中嘲h 1 1 1 2 茶多酚的结构特征 茶多酚中除酚酸及缩酚酸外，均具有2 一苯基苯并吡喃为主体的结构，统称 为类黄酮物质，其基本碳架为；- - c 。一c 。一c 一分子结构中含有能与蛋白质形 成氢键结合的两种活性基团：羟苯基和醅酰基。由于这两种基团构型上的差异 以及羟基的变化而形成多种结构相似的单体组分，即儿茶素单体。茶多酚之所 以具有抗氧化性是由于茶多酚中含有6 0 8 0 的儿茶素类物质，它们都含有2 个以上互为邻位的羟基，具有捕获过氧基团的能力，从而显示出抗氧化性姐1 。 研究表明茶多酚具有很强的抑菌和抗氧化活性，可以作为防腐剂和抗氧化剂使 用。茶多酚清除脂质氧化的能力比v e 或v 。要强五倍以上呻1 。在儿茶素单体中， 最具有与蛋白质结合活性的主要是两种酯型儿茶素即l - e c g 和l - e g c g ，因为 l - e c g 和l - e g c g 分子中分别有两个能与酶蛋白具有络合作用的活性基团：一个 是醅酰基，一个是羟苯基。其他三种单体即游离型儿茶素l - e g c 、d 、l - c 、l - e c 则只有羟苯基一个活性基团。由于这些活性基团的存在，使儿茶素能以氢键的 形式与酶蛋白络合，从而形成浑浊和沉淀，即所谓的起混活性( h a z e a c t i v e ) “町“。研究表明，茶多酚清除氧自由基具有协同作用，当e g c g 和e c g 同时存 在时，清除超氧阴离子自由基的协同增效作用最大。几茶素作为抗氧化剂时， 以保持原有儿茶素比例其抗氧化效果最佳“” 1 1 3 茶多酚在食品中的应用 茶多酚作为一种天然的食品抗氧化添加剂，在食品行业有着广泛的应用。 一直以来脂质氧化是脂肪和脂类物质降低风味和营养物质的主要原因 1 3 o 为了 解决这个问题，合成抗氧化剂像b h t 和b h a 已经被广泛应用于食品行业“”然 而，合成抗氧化剂由于它的安全性问题，用于食品行业受到了很大的限制，所 2 以需要寻求一种天然的抗氧化荆来取代合成抗氧化剂许多研究表明从茶叶中 提取的天然抗氧化剂茶多酚具有很大的应用前景 i s ) e 茶多酚的抗氧化作用在于儿茶素分子结构中酚羟基特有供氢体的活性，能 与脂肪酸在自动氧化过程中产生的游离基结合，中断脂肪氧化的链锁反应，抑 制氯过氧化物的形成，达到抗氧保鲜的目的“耵n ”它是一种纯天然的抗氧化剂， 具有优越的抗氧化能力，其抗氧化能力比b h a ( 丁基羟基茴香醚) 、b h t ( 二丁 基羟基甲苯) 、异维生素c 钠、维生素e 都强“”我国卫生部已批准了茶叶天 然抗氧化剂为我国的食品添加剂之一在我国食品添加剂使用卫生标准 ( g b 2 7 6 0 - 1 9 9 6 ) 中明确规定了茶多酚可以作为一种天然的抗氧化剂应用于食品 行业，其具体用量如表卜1 所示“”1 9 9 0 年美国医学基金会主席认为。茶多酚 是2 l 世纪对人类健康产生巨大效果的化合物”伽1 。 表卜1 茶多酚的使用参考 t a b l e l lu s er e f e r e n c eo ft e a p o l y p h e n o l 1 1 3 1 茶多酚在肉类加工中的应用 肉制品含有丰富的蛋白质，是很好的微生物培养基，同时肉制品中含有的 脂肪又是活性氧的进攻目标，因此肉制品极易变质，所以需要寻找一种既具有杀 菌功能又具有抗氧化作用的保鲜剂。 目前茶多酚在冷却肉中得到了广泛的推广冷却肉质地柔软，味道鲜美， 由于从屠宰、加工到销售一直都是在低温环境下进行的，故能很好的阻止微生 物在肉表面生长繁殖。但冷却肉保鲜过程中也存在着问题，即货架期短和表面 褐变。为了解决这个问题，国内外也进行了大量的研究。蒋建平等o ”进行了茶 多酚保鲜技术在延长冷却肉货架寿命中的应用研究，结果表明茶多酚与v c 、v e 同时连用，不仅抗氧化效果好，而且失色的现象也得到了有效的抑制。罗爱平 等乜2 1 对牛肉采取了综合保鲜技术，研究表明添加5 胶原蛋白、2 c a c i ：、0 0 2 5 茶多酚、0 0 3 异抗坏血酸、0 3 植酸的保鲜剂可使冷却肉的保质期达到2 1 d 以上。m i s t u r u 等人研究发现添加2 0 0 或4 0 0 m g k g 的茶多酚到剁碎的肉制品中 后可以有效的减少脂质氧化，茶多酚在牛肉中的抑制氧化的能力比维生素c 还 要强心”此外还可以将茶多酚添加到香肠、鱼肉等之中“圳 鲜肉在储藏过程中很容易产生脂质氧化，形成过氧化物。鲜肉中过氧化物 的产生过程为。”： 油脂中的不饱和脂肪酸可被空气中的氧徐徐氧化，这种氧化通常称为自氧 化不饱和脂肪酸氧化过程的模式如下： 氧化 夕 双氢过氧化物 i 二彳体 聚合 脂类的氢过氧化 1 分解 醛、半醛、羟基化合物 i 酮、环氧化合物、 碳氢化合物、内脂 多聚体酸 随着油脂氧化生成氢过氧化物，进而分解生成醛类、酮类、低级脂肪酸等， 使得肉的感官( 气味等) 品质和营养成分都随之变坏，货架寿命接近终止。 不饱和脂肪酸的初期氧化产物是氢过氧化物，其生成机制为自催化作用。 这是由于游离基机构中双键邻位的a 一活性亚甲基易生成氢过氧化物的缘故。 其反应过程如下： 反应开始 r c h 2 c h = c h - - = 旦- r ch c h = c h - - + h 氢过氧化物的连锁反应 9 d r c h c h = c h 0 00 0 h r 圭h c h = c h 一+ r c h 2 c h = c h 一斗r h c h = c h 一十r c h c h 竺c h 一 过氧化物的分解 o o hp r 亡h c h = c h r c h c h = c h 一+ 0 h 反应终止 各游离基结合成二聚体： or e o h c h 皇c h r c c h c h = c h 一+ r c h c h = c h 一- r c h c h h 一 4 o o r c c h c h = c h 一 + r c 掣h c 一一一o + 0 2 +h = c h 一+ 如果有铜、铁、钴等二价原子或其以上的重金属存在，会使诱导期缩短、 促进生成的氢过氧化物的分解等，加速不饱和酸或食用油脂的氧化 茶多酚具有很强的抗氧化作用，而它的天然无毒性又使它在食品行业有着 广泛的应用茶多酚的抗氧化作用在于儿茶素分子结构中酚性羟基特有供氢体 的活性，能与脂肪酸在氧化过程中产生的游离基结合，中断脂肪酸氧化的链锁 反应，抑制氢过氧化物的形成，达到抗氧化保鲜的目的。而且茶多酚的抗氧化 性能比丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯高2 3 倍，且有效浓度低( o 0 2 o 0 5 ) ，其氧化物在食品中的反应生成物经毒理测定和微核实验表明，无毒副 作用，食用安全“”。 肉制品中脂肪的氧化是一个与自由基有关的链式反应： rh + o 2 _ r + oh ( 1 ) r + o2 一ro o ( 2 ) r o0 + rh ro oh + r ( 3 ) 氧化反应( 1 ) 进行缓慢，自由基( r ) 一旦产生后再与o2 反应生成r 0 0 ( 过氧 化物自由基) ，反应速度加快，而且过氧化物可促进别的不饱和键的氧化。茶多 酚是一种优良的氢或中子的给予体，它可向自由基r 提供h 而使脂肪自由基 还原到脂肪的原来状态( r h ) ，使脂肪的继续氧化得以终止陋“。茶多酚的抗氧 化作用机理主要是；清除活性氧；清除自由基；螯合金属离子；结合氧化酶。 研究表明，茶多酚具有较强的抗氧化性能与茶多酚各单体间的协同作用有 关。检测不同组合的儿茶素清除超氧阴离子的能力发现，组合儿茶素清除自由 基的效果强于单体儿茶素，而且清除效率随儿茶素单体种类的增多而增加，既 儿茶素清除自由基的顺序为：四组合 三组合 而组合 单体。组合几茶素的增效 效果，即不是组分儿茶素清除率的简单相加，也不是相乘作用，而是与儿茶素 分子浓度比例呈高度正相关，证实了儿茶素之间存在协同增效作用。且各组合 中，还原电位相近者协同增效作用最明显，这是由于儿茶素存在抗氧化循环o ”： ：篓x 怎x 麓x 麓鼢物 1 1 3 2 茶多酚在油制品加工中的应用 色拉油是毛油经脱胶、脱酸、脱色及脱臭等工艺精制而成的，在这个工艺 过程中毛油中含有的生育酚、胡萝卜素及一些酚类等具有抗氧化作用的物质也 被一同除去，使色拉油极易变质。茶多酚用于油脂的抗氧化剂，能阻止和延 缓不饱和脂肪酸的自动氧化分解，有效抑制其p o v ( 过氧化值) 上升，在各种 油脂( 动物油脂、植物油脂) 中抗氧化活性是b h t 的l 一5 倍，并随添加量的增 大而提高活性，通常茶多酚添加量为0 0 0 2 时就能发挥作用潘丽军等在色拉 油中乳化添加2 0 0 m g k g 的茶多酚，可达到优良的抗氧化效果，其抗氧化能力为 b h a 的两倍左右”1 1 2 木瓜蛋白酶及其结构特征 1 2 1 木瓜蛋白酶 木瓜蛋白酶( e c 3 4 2 2 2 ) 广泛存在于双子叶植物番木瓜的根、茎、叶和 果实中，其中以未成熟果实的乳汁中含量最为丰富，约占干重的4 0 o ”木瓜 蛋白酶在内肽酶中含量很少，约占8 左右，易于分离纯化b “该酶含量高、 蛋白水解能力强，对多种蛋白质均具有很好的降解作用，被广泛应用于食品中， 作用的底物较广泛，包括各种蛋白质如明胶、酪蛋白、谷蛋白、弹性蛋白、球 蛋白和肌纤维蛋白b 2 1 口”。 1 2 2 木瓜蛋白酶的结构特征 木瓜蛋白酶是一种巯基蛋白水解酶，含有总量达5 的脯氨酸，可水解蛋白 质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端。并能优先水解在肽键的n 一端具有2 个羧基 的氨基酸或芳香l 一氨基酸的肽键。在许多情况下，木瓜蛋白酶很容易失活，一 些化学物质如氧化剂h 2 0 2 3 0 等，以及脉冲电场。“、高压 等均能使它失去活性。 木瓜蛋白酶同其它含巯基的蛋白酶如菠萝蛋白酶、o 一淀粉酶等一样，在室温下 热稳定性较差，所以在应用方面受到一些限制。 1 2 3 木瓜蛋白酶在食品中的应用 木瓜蛋白酶因其具有较好的水解蛋白能力，故在各种食品加工中被广泛的 使用，如酿造、肉类加工( 肉的嫩化) 、牛奶的凝固、小麦面粉和高质量饼干加 工中混合面团的改性、处理花生仁和鱼肉n t 的废弃物以生产功能性的蛋白质 和多肽等。 1 2 3 1 木瓜蛋白酶在啤酒澄清中的应用 啤酒生产过程中由于蛋白酶的存在会产生混浊，这是最常见的非生物浑 浊，由于其中的多酚类物质与蛋白质形成一种复合物，此种复合物聚合到一定 程度时而产生混浊沉淀。啤酒在低温冷藏储存时经常有沉淀形成，在室温下放 6 置一段时问也有沉淀这些沉淀主要是蛋白质和多酚类化合物形成的，在啤酒 中加入3 0 u g m l 木瓜蛋白酶可以作为啤酒的澄清剂。同时研究也表明添加到啤酒 中的蛋白质的活性与抑制其混活性的能力没有直接的联系口” 1 - 2 3 2 木瓜蛋白酶在肉类加工中的应用 肉类的嫩度是肉类品质的一个重要指标木瓜蛋白酶的添加可以造成肉类 蛋白质肽链的断裂，能使由精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸等7 种氨基酸 构成的肽键断裂水解，吸水膨胀，使肉质疏松，并在口感上保持一定的嫩度 吴嘉新等。8 1 进行了天然肉类嫩滑剂的研究，研究发现添加以木瓜蛋白酶为主要 原料的嫩肉液比不添加的饺陷作出的水饺要更鲜嫩多汁。 1 2 3 3 木瓜蛋白酶在饼干松化剂中的应用 木瓜蛋白酶添加到饼干中，能降低面团筋度、提高饼干疏松度、成形性好、 能使饼色油润，减少次品率、提高成品率适合各种风味的高、中、低档饼干、 糕点及面包的制造”1 1 3 茶多酚与木瓜蛋白酶络合沉淀的反应机理 多酚和蛋白质发生的结合大多是可逆结合的，原因是疏水键一氢键的键合 力弱，只有在某些外界因素( 如氧、金属离子和酸) 的作用下，使接近的两个 分子可能产生共价键结合，或在酶、高价态金属离子或碱性介质中，多酚易被 氧化形成邻醌的时候，或原花色素在酸催化下黄烷醇连接键断裂形成正碳离子， 邻醌和正碳离子都是高亲电中心，与蛋白质分子的亲核基团( 一n i l ：、- - s h ) 形 成共价键结合，这种结合才是不可逆的t 4 0 昏k 一然 营。o 一d 简单盈一 图i - 3多酚与蛋白质问的反应模式 f i g u ci - - 3r e a c t i o np a t t e r nb e t w e e nt e a - p o l y p h e n o la n dp r o t e i n 茶多酚与木瓜蛋白酶的络合是茶多酚在蛋白质表面的结合，多酚类物质起 链桥的作用，在蛋白质分子问形成多点交联，使蛋白质相互链接，而蛋白质中的 7 脯氨酸作为链接部位起关键性作用( 即活性中心) 茶多酚与木瓜蛋白酶间通 过这种络合，使蛋白质分子变大，最终产生沉淀。多酚与蛋白质之间的主要结 合方式是多酚以其邻位的酚羟基与蛋白质分子的肽基以双点氢键进行键合其 中一个酚羟基氢原子作为h 供体，肽基中的羟基氧原子作为h 受体，肽基中的n 原 子上的h 作为h 供体；另一个酚羟基氧原子作为h 受体洲 从整体上看，多酚能以多个位点与蛋白质分子间通过氢键形成稳定结合。蛋 白质和多酚的反应中存在四种反应模式( 如图1 - 3 ) ：当溶液中蛋白质的浓度较 低时，大量的多酚分子聚集在蛋白质的表面形成了单分子的疏水层，当多酚的 分子数目足够多时，蛋白质表面的疏水性就会大到使蛋白质从溶液中沉淀析出 ( 图l - 3 a ) ：如果继续增加蛋白质的含量，当溶液中的蛋白质的比例上升到某 一程度时，此时蛋白质的结合点总数与多酚的大体相等，就会形成多酚一蛋白 质的交联网状结构，从而更容易使蛋白质从溶液中沉淀出来( 图l - 3 b ) ；当蛋 白质的量继续增加时，多酚的相对含量就会降低，这时由于蛋白质提供的结合 点多于多酚的羟基数，于是多酚一蛋白质的交联网状结构就会受到破坏，网络 结构解体，混浊沉淀物反而会减少( 图卜3 c ) ；图卜3 d 表明，即使是低分子 的多酚以及简单酚，只要它们浓度足够大，也能在蛋白质的表面形成疏水层而 使蛋白质沉淀出来“”同时这四种反应模式也表示茶多酚与蛋白质之间的络合 反应是可逆的。 早期研究认为，多酚类与蛋白质结合的主要形式为氢键，多酚类的大量酚 羟基与蛋白质主链的肽基一n h c 0 一和侧链上的一0 h 、一n h 。以及一c o o h 以氢 键的形式多点结合。然而深入研究表明，虽然多酚类对于蛋白质都有结合能力， 但是仍具有选择性。这主要体现在不同的多酚类对于不同的蛋白质的亲和力差 异上。a s q u i t h “3 1 认为多酚类亲和性高的蛋白质的特征为：相对分子质量较大， 结构开放松散，脯氨酸或其他疏水性氨基酸含量较高。这就表明多酚类蛋白质 结合形式不只是氢键形式。h a s l a m 等“”在研究了甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮 氨酸和脯氨酸等一系列氨基酸对水解类单宁亲水性的影响之后，证实氨基酸脂 肪基越大，疏水性越强，多酚的结合越好，从而说明在多酚蛋白质反应中疏水 键也是一种重要的形式。 多酚对酶的抑制，可采用一些去抑制剂，以解析或防止生成多酚一酶复合 物，如提高体系p h 值，或加入咖啡碱、有机溶剂而得到保持活性的酶蛋白。实 际应用较多的是在制备酶时加入丙酮和聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 。因这些化合物 与多酚之间的结合力强予多酚对酶蛋白的结合，可从多酚酶复合物中把多酚结 合出来，从而消除多酚对酶的抑制。杨晓慧等研究交联p v p 凝胶对茶多酚的吸 附吸附作用，发现：在室温下，对2 m l t p 试液，用4 m l 交联p v p 凝胶，吸附6 0 m i n ， 茶多酚的除去率达到5 0 以上其吸附机理为：交联剂的活性吸附中心与茶多酚 上的酚羟基形成氢键“” 8 h a s l a , 等”1 在总结前人研究的基础上，提出了多酚一蛋白质反应的多点 疏水键氢键结合理论认为，可用“手一手套”模型来说明此反应( 图1 - 4 ) 蛋白质分子中疏水基团较集中的部位构成“疏水袋”，多酚分子进入“疏水袋” 中并通过氢键加强结合，此过程可分为两步进行：首先，含疏水基( 如没食子 酰基) 的多酚分子以疏水反应形式进入蛋白质的疏水袋；然后，多酚的酚羟基 与蛋白质的极性基( 主要是肽基和少量的胍基、羟基、羧基等) 发生两点氢键 结合，其中一个酚羟基原子作为氢供体，肽基中的羰基氧作为氢受体：肽基中 氮原子上的氢作为氢供体，另一个酚羟基氧原子作为氢受体，使多酚以多点氢 键在蛋白质分子间形成稳定结合因此，影响多酚与蛋白质结合的因素有：多 酚的分子尺寸，相对分子质量大于5 0 0 时产生较牢固的结合，多酚的酚羟基和 疏水基数量多者结合强，具有柔性的分子构型者结合强，水溶性低者结合强。 因此，水解单宁的收敛性与其所含疏水基多少有直接关系，缩合单宁则与其聚 合程度有关需要指出的是儿茶素聚合物可与蛋白质、多肽缔合，形成不溶性 物质，这是由儿茶素氢键而形成的，但这种结合至少需要两个以上的交联点， 才能形成稳定的结合，茶多酚的各类单体，其相对分子质量均小于5 0 0 ，而且 水溶性强，因交联点少，使其难以具有沉淀蛋白质的鞣质性质j 图卜4 多酚一蛋白质问的氢键示意图及反应机理 f i g u ei - - 4s k e t c hm a po f h y d r o g e nk e ya n dr e a c t i o np r i n c i p l eb e t w e e nt e a - p o l y p h e n o l a n dp r o t e i n 在茶多酚包含的五种儿茶素单体中，最具有与蛋白质结合活性的主要是两 种酯型儿茶素，即l - e c g 和l - e g c g ，因为它们分别有两个能与酶蛋白络合 作用的活性基团，使儿茶素能以氢键的形式与酶络合，从而形成混浊沉淀，即 9 起混活性。 木瓜蛋白酶是一种具有相应酶活性的蛋白质有研究表明，多种酶在与茶 多酚络合后，酶活性都有所变化如大豆脂肪酶、人体唾液中的a 一淀粉酶、酪 氨酸酶、黄嘌呤蛋白酶等【1 1 1 木瓜蛋白酶在与茶多酚络合后，其活性也有所变 化 1 4 本课题研究的目的、内容和意义 1 4 1 本课题研究的目的 作为一种具有蛋白质水解活性的商业性的酶，木瓜蛋白酶在食品行业中的 应用范围很广，商业价值很高，但是在许多因素作用下很容易失活，所以针对 其做的一些改性实验也随之增多，如：在木瓜蛋白酶干燥前加入各种抗氧化剂 和多羟基助溶剂，和游离的木瓜蛋白酶比较，当和多聚蔗糖、热敏性的胶体粒 子以共价键结合时，木瓜蛋白酶呈现出更好的热稳定性。目前国内外主要研究 的是作为抗氧化剂的茶多酚与木瓜蛋白酶之间的络合沉淀及其对蛋白质功能特 性的影响规律，其中香港理工大学和华南理工大学食品与生物工程学院黄惠华 等人的研究涉及到茶多酚与胃蛋白酶“”、菠萝蛋白酶“、a 一淀粉酶1 等蛋白 酶络合前后在不同p h 、茶多酚浓度、温度、底物浓度条件下酶活的变化，发现 茶多酚对蛋白酶的活性回收率较低。这也是本论文研究茶多酚对木瓜蛋白酶回 收的方式的和该项研究的重要性所在。 1 4 2 本课题的研究内容 ( 1 ) 采用响应曲面法设计四因素( 温度、p h 值、反应时间、茶多酚与木瓜蛋 白酶的质量比) 三水平实验，以茶多酚对木瓜蛋白酶活性回收率为指标确立最 佳络合反应条件，即找出何种条件下茶多酚对木瓜蛋白酶的回收率最高 ( 2 ) 茶多酚络合前后性质的变化。 研究茶多酚与木瓜蛋白酶络合后热稳定性的变化、木瓜蛋白酶活性中心的 确定、抗氧化性质的变化、木瓜蛋白酶自身米氏常数的变化，并研究了茶多酚 中究竟是哪一种单体与木瓜蛋白酶发生了络合作用。 ( 3 ) 茶多酚木瓜蛋白酶络合物在肉类加工中的应用 研究将茶多酚与茶多酚一木瓜蛋白酶络合物添加到肉制品中对肉制品感官 性质的影响、酸价、过氧化值的影响以及肉制品菌落总数的变化情况，并研究 了将其添加到肉制品中对肉制品嫩度的影响。 1 4 3 本课题研究的意义 将茶多酚与木瓜蛋白酶络合，其络合物可以大大提高木瓜蛋白酶的稳定性， 同时利用茶多酚的抗氧化性与木瓜蛋白酶使肉类嫩化的特性，增大了木瓜蛋白 酶在食品行业的应用范围可将其络合物应用于肉类制品保鲜中，可以延长肉 制品的货架期，并能提高肉类制品的品质。 l o 第二章茶多酚与木瓜蛋白酶之间的络合反应 许多植物性的食品原料都含有多酚类成分，如茶叶和各种水果、蔬菜等， 这些多酚类物质能和蛋白质、酶等生物大分子发生络合作用，并且在一定程度 上改变这些生物大分子的生物活性茶多酚是茶叶中存在的一种天然多酚类物 质，它能以多个位点与蛋白质表面结合在低浓度蛋白质中，多酚类从一个点 或多个点结合，从而形成一种层状结构在高浓度的蛋白质中由于多酚类与蛋 白质结合，或由于环齿状多酚类结合了多个不同的蛋白质分子，形成疏水的表 面层，于是就产生了沉淀现象m 儿删 木瓜蛋白酶经茶多酚络合，可以提高酶自身的稳定性同时利用茶多酚与 酶的络合作用，可以使茶多酚作为一种新型的沉淀剂回收一些具有应用价值的 生物活性物质，并改善酶的生物学特性 本章主要选取木瓜蛋白酶来研究外界时间、温度、p h 值、茶多酚与木瓜蛋 白酶络合的质量比对茶多酚与木瓜蛋白酶络合的影响，并优选出最佳工艺参数。 2 1 材料和方法 2 1 1 试验试剂与设备 表2 1 主要化学试剂 t a b l e 2 一im a i nc h e m i s t r yr e a g e n t s 茶多酚 木瓜蛋白酶 无锡绿宝生物制品有限公司