（环境工程专业论文）有机磷农药快速检测技术及其应用研究.pdf

有机磷农药快速检测技术及其应用研究 环境工程专业硕士研究生：刘萍 指导教师：张进忠教授 摘要 有机磷农药因其离效、广谱、低毒、易生物降解，自2 0 世纪6 0 年代后逐渐取代d d t 等有机 氯农药。但是它也像其它类型农药样，过度施用对人类和环境带来了不良后果，尤其以影响 农产品的质量安全最为直接，故近年来对其残留的检测，尤其是蔬菜中农药残留的快速检测成 为公众关注的热点。传统的有机磷农药检测方法主要有色谱法、质谱法和光谱分析法等，但都 存在耗时长、成本高等缺点，难以满足现场快速检测的实际需要。 酶抑制法作为一种快速检测果蔬中农药残留的筛选方法。与传统的化学分析和仪器分析法 相比克服了分析时间长、成本昂贵等缺陷。它直接用抑制率高低来表示农药残留程度的大小。 直观、简便、灵敏，并能在较短的时间内筛选出大量的超标样品，进而缩小定量检测范围，将 一部分含农药残留量高的果蔬产品阻挡在市场之外，避免中毒事件的发生，以达到保护消费者 身体健康的目的。 本论文首次以甲基纤维素为载体，制备了一种基于抑制乙酰胆碱醑酶的电位型生物传感器。 文中探索了甲基纤维素浓度和用量、甲蒸纤维索与n ，n - 甲基甲酰铵( d m f ) 的配比、酶含量、 底物溶液的浓度、酶固定化时问等酶电极制备条件的选择还考察了待测溶液p h 值、酶促反应 时间、电极工作环境对酶电极检测过程的影响，确定了酶电极的最佳工作环境，并进行了酶电 极的稳定性和重现性测试和讨论。 通过研究获得了最佳的酶电极制备条件。郎甲基纤维素的浓度为0 2 、用量为1 5 此，甲基 纤维素与n ，n 二甲基甲酮般( d m f ) 的配比为3 ：1 ，酶含量为3 5 u 电极。酶固定化时间为8h 。 研究还获得了最佳的测试条件，即底物溶液的浓度为1 0 m o l l ，待测液p h 为9 ，酶促反应的平 衡时间为1 0r a i n 。论文还对矿的传质过程进行了分析，结果表明搅拌过程会导致传感器检测灵 敏度的降低。 本文以甲胺磷、甲拌磷、对硫磷、毒死蜱和乐果等5 种有机磷农药为检测对象，获得了上述 5 种有机磷农药的抑翎时间，其结果分别为5 ，9 7 ，3 和7m i n 。并且用酶电极对甲胺磷迸行了精密 度的测定相对标准偏差( r s d ) 为0 6 3 ( h = 6 ) 。采用此酶生物传感器检铡上述5 种有机磷农 西南大学硕士学位论文摘要 药，获得了电位差值与有机磷农药浓度之间的线性响应曲线，相关系数分别为0 9 9 5 6 ，o 9 9 6 7 ， 0 9 9 8 1 o 9 9 3 7 和0 9 9 6 8 。结果表明采用酶电极法测定，可得到较好的相关性，并且与气相色谱分 析法进行比较，两者没有显著性差异。 本文还考察了几种常见的重金属离子c u 2 + ，p b ”，c d ”对酶电极测定有机磷农药的干扰情况， 结果表明在重金属离子浓度达到1 0 4m o f l 时对测定有一定的干扰，其原因是重金属离子的存在 使得酶的活性降低。为了延长酶电极的使用寿命探讨了传感器的再生方法，即采用氯解磷定 去除酶电极上的有机磷农药，保证了传感器的多次使用。 本文将研制的酶生物传感器应用于盆栽蔬菜中的有机磷农药检测，检测结果为酶抻制率达 到了9 5 6 ，该蔬菜属严重污染，获得了与气相色谱检测一致的结果。采用酶生物传感器法检测 一个样品，测试时间大约为3 0m i n ：若同时检测多个样品。检测时间可大大缩短。结果表明， 本方法不失为检测蔬菜中有机磷农药残留的一种快速、灵敏和可靠方法，完全能够达到初筛被 有机磷农药污染的果蔬产品的目的，并可望在实际检测中的扩大应用。 关键词：生物传感器：甲基纤维素；有机磷农药：乙酰胆碱酯酶；蔬菜 j j 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t s t u d yo hf a s td e t e c t i o nt e c h n i q u ef o r o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e sa n d i t sa p p l i c a t i o n e n v i r o n m e n t a l e n g i n e e r i n gc a n d i d a t e ：l i up i n g s u p e r v i s o r ：p r o f z h a n gj i n z h o n g a b s t r a c t o r g a n o p h o s p h r o u sp e s t i c i d e sa r ew i d e l ya p p l i e dt oa g r i c u l t u r a lf i e l di n s t e a do fo r g a n o c h l o r i n e p e s t i c i d e s ，s u c ha sd d t , b e c a u s eo f t h e i rh i i g he f f e c t i v e n e s s ，b r o a ds p e c t r u m ，l o wt o x i c i t ya n de s a yt o d e g r a d eb i o l o g i c a l l y h o w e v e r , t h e s ep e s t i c i d e sh a v ea l s oc a u s e du n d e s i r e dc o n s e q u e n c et ot h e e n v i r o n m e n ta n dh u m a nh e a l t h , e s p e c i a l l ya f f e c t e dt h eq u a l i t ys e c u r i t yo f a g r i c u l t u r a lp r o d u c t sd i r e c t l y t h e r e f o r e ，i ti sah o ts p o tt h a tt h ep u b l i cc o n c e r nt od e t e c tt h er e s i d u eo ft h e m ，e s p e c i a l l yr a p i d d e t e c t i o nf o rt h e mi n v e g e t a b l e s c o n v e n t i o n a lm e t h o d sf o rd e t e c t i n gr e s i d u a lo r g a n o p h o s p l l o l q l s p e s t i c i d e s ，i n c l u d i n gc h r o m a t o g r a p h y , n l a s ss p e c l r o m e t r y , s p e c t r o s c o p y , t h e ya r et i m e c o n s u m i n ga n d c o s f ly a n da r ch a r d l os a t i s f y t h e i n c r e a s i n gr e q u i r e m e n t so f t h eo n l i n ed e t e c t i o n e r t z y m m i ei n h i b i t i o nm e t h o di saf a s td e t e c t i o nm e t h o df o rt h ep e s t i c i d er e s i d u ei nv e g e t a b l e sa n d f r u i t s c o m p a r e dw i t ht r a d i t i o n a lc h e m i c a la n l y s i sa n di n s t r u m e n t a la n a l y s i s ，i to v e r c o m e ss o m e d i s a d v a n t a g e s ，i n c l u d i n gl o n g 狮a l y d c a lt i m ea n dh i g hc o s t i t sa d v a n t a g e sa r ed i r e c t l y , s i m p l ea n d s e n s i t i v e ，a n dc a l ld e t e c tal a r g en u m b e ro fs a m p l e sa ts h o r tt i m e ，s ot h a ti t c a l ls c r e e nm a n y s u p e r s t a n d a t ds a m p l e sw i t h i nar e l a t i v e l ys h o r tt i m ea n ds h o r t e nd e t e c t i o nr a n g e t h er a p i d d e t e r m i n a t i o nm e t h o df o rp e s t i c i d er e s i d u e sc a nk e e ps o m eh i 曲l yr e s i d u a lv e g e t a b l e sa n df r u i t so u to f t h em a r k e t s a n da v o i dt oh a p p e nt o x i cc a s e ，t h u st h ec o r l s u n l e r s h e a l t hc a nb ep r o t e c t e d b a s e do nt h em e c h a n i s mw h i c ho r g a n o p h o s p h o l l t sp e s t i c i d e sc a ni n h i b i ta c t i v i t yo f e c e t y l c h o l i n e s t e r a s e w ef i r s tu s e dm e t h y l c e l l u l o s ea sc a r r i e rt op r e p a rp o t e n t i a lb i o s e n s o ri nt h i st h e s i s i nt h i s s t u d y , s o m ei m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n s ，i n c l u d i n g t h ec o n c e n t r a t i o na n dd o s a g eo f m e t h y l c e l l u l o s e ，t h em i x t u r er a t i oo f m e t h y l c e l l u l o s ea n dd m f , t h ec o n t e n to f a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ，t h e c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t es o l u t i o na n dt h ei m m o b i l i z a t i o nt i m eo f e n z y m e ，h a sb e e ni n v e s t i g a t e d ，a n d s o m ef a c t o r sw h i c hc a ne f f e c to nw o r k i n go fe n z y m a t i ce l e c t r o d e s ，f o ri n s t a n c e ，p ho fs u b s t r a t e s o l u t i o n ，t h et i m eo fe n z y m a t i cr e m i o na n dt h ew o r k i n ge n v i r o n m e n t o ft h ee l e c t r o d e ，h a sa l s o 1 1 1 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t e x a m i n e d t h u s ，t h eo p t i m a lw o r k i n gc o n d i t i o n so fe n z y m a t i ce l e c t r o d e sh a v eb e e nm a d ec e r t a i n ，a n d t h es t a b i l i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t yo f e n z y m a t i ce l e c t r o d eh a v ea l s ob e e nt e s t e da n dd i s c u s s e d t h er e s e a r c hi n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m a lp r e p a r i n gc o n d i t i o n sw e r et h a tt h ec o n c e n t r a t i o no f m a t h y l e e l l u l o s ew a s0 2 ，t h ed o s a g ew a s1 5p l ，t h e m i x t u r er a t i oo fm e t h y l c e l l u l o s ea n dn ， n - d i m e t h y l f o r m a m i d e ( d 伍) w a s3 ：1 ，t h ec o n t e n to fe n z y m ew a s3 5 up e re l e t r o d ea n dt h e i m m o b i l i z a t i o nt i m ew a s8h o u r s t h eo p t i m a lm e a s u r e m e n tc o n d i t i o n sw e r ca l s oo b t a i n e d , i e ，t h e c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t es o l u t i o nw a s1 0 。m o l l ，t h ep hv a l u eo ft h et e s t e ds o l u t i o ni s9 ，a n dt h e e q u i l i b r i u mt i m eo fe n z y m a t i cr e a c t i o nw a s1 0m i n u t e s b a s e do nt h ea n a l y s i so fm a s st r a n s f e ro f h y d r o g e ni o n , i tw a sp r o v e dt h a tt h ea g i t a t i o no p e r a t i o nw a sn e g a t i v et oi m p r o v et h es e n s i t i v i t yo f t h e b i o s e n s o r i nt h i ss t u d y , w ec h o o s e dm e t h a m i d o p h o s ，p h o r a t e ，p a r a t h i o n , e h l o r p y r i f o sa n dd i m e t h o a t e d e t e c t i o no b j e c t s , a n do b t a i n e dt h ei n h i b i t i o nt i m e so f t h e m ，i e 5 ，9 ，7 ，3a n d7r a i nr e s p e c t i v e l y f o r m e t h a m i d o p h o s ，t h ep r e c i s i o nw a sm e a s u r e dw i t ht h ee n z y m ee l e c t r o d e ，i e t h er e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o n ( r s d ) w a s0 6 3 0 = 6 ) 、m o v e o v e r , t h el i n e a rr e s p o n s er e l a t i o n s h i pb e t w e e np o t e n t i a l d i f f e r e n c ea n dt h ec o n c e n t r a t i o no fo r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d ew a so b t a i n e d ，a n dt h ec o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t sw e r e0 9 9 5 6 ，0 9 9 6 7 ，0 9 9 8 1 ，0 9 9 3 7a n d0 9 9 6 8 ，r e s p e c t i v e l y t h e s er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tg o o dc o r r e l a t i o nc o u l db eo b t a i n e dt od e t e r m i n eo r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e su s i n gt h e e n z y m a t i cb i o s e n s o r c o m p a r e dw i t hg a sc h r o m a t o g r a p h y , b o t h o ft h et w om e t h o d sh a v en o t s i g n i f i c a n td i f f e r e n e e i nt h i st h e s i s ，t h ei m p a c to f s e v e r a lf a m i l i a rh e a v ym e t a l s ( c u 2 + ，p b 2 + ，c d 2 + ) o nt h ed e t e r m i n a t i o n o fo r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e , sw a sa l s oe x a m i n e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ei n t e r f e r e n c ee x i s t e d w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fh e a v ym e t a lw a sa b o v e1 0 - 6m o l lo w i n gt ot h ed e c r e a s eo fe n z y m a t i c a c t i v i t yi nt h ep r e s e n c eo f h e a v ym e t a li o n i no r d e rt op r o l o n gt h el i f e - s p a no f e n z y m ee l e c t r o d e ，t h e r e g e n e r a t i o nm e t h o dw a sd i s c u s s e d w eu s e dp r a l i d o x i m ec h l o r i d et or e m o v et h eo r g a n o p h o s p h o m s p e s t i c i d eo nt h ee l e c t r o d et og u a r a n t e ei t sm u l t i p l ee m p l o y i nt h ee n d ，t h ec o n s t r u c t e de n z y m a t i cb i o s e n s o rw a sa p p l i e dt od e t e c tt h eo r g a n o p h o s p h o m s p e s t i c i d e si nt h ep o t t e dv e g e t a b l e f o rt h ei n h i b i t i o nr a t eo ft h ee n z y m ew a s9 5 6 t h ev e g e t a b l e b e l o n g e d t os e v e r ec o n t a m i n a t i o n t h i sr e s u l tw a sc o n s i s t e n t e dw i t ht h a to b t a i n e db yg a s c h r o m a t o g r a p h y t h em e a s u r e m e n tt i m ew a sa b o u t3 0r a i nt od a t e e to n es a m p l eu s i n gt h ec o n s t r u c t e d e n z y m a t i cb i o s e n s o r , f u r t h e r m o r e ，t h em e a s u r e m e n tt i m ec o u l db es h o r t e n e dt od e t e c t al o to f s a m p l e s t h e s er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep r o p o s e dm e t h o di sar a p i d ，s e n s i t i v ea n dr e l i a b l eo n et od e t e c t o r g a n o p h o s p h o r n sp e s t i c i d er e s i d u e si nv e g e t a l e s ，a n di sh o p e f u lt oa p p l yw i d e l yi np r a c t i c a ld e t e c t i o n k e y w o r r l s ：b i o s e n s o r , m e t h y l c e l l u l o s e , o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e ，a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ，v e g e t a b l e 独创性声明 y $ 3 7 5 2 7 学位论文题目：直扭型这药迭速拴型拉苤丛甚应用妞窒 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西 南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者： 南7 再 签字日期：矽彳年月孑日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：日不保密，口 保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：玉7 诲导师签名：罱锭趣忠 签字日期：卅年f 月。r 日签v - 日期：上卯6 年z 月矗日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 西南大学硕士学位论文文献综述 第1 章文献综述 社会进步和公众健康的需求，使得人们越来越重视食品安全问题。农药污染是影响食品安 全的重要因素，己成为各国衡量食品卫生及其质量状况的首要指标。出于维护本国经济利益和 保护人们身体健康的需要。欧盟、美国、日本、加拿大等发达国家和地区相继对进口食品中的 农药残留量提出越来越高的要求。发展快速、可靠、灵敏和实用的农药残留分析技术无疑是控 制农药残留、保证消费者安全和避免国际问有关贸易争端的基础。化学农药是一类复杂的有机 化台物，农药残留量分析需要测定样品中峙，g 、n g g 、甚至p g g g 级的农药和( 或) 代谢产物及 降解产物( 赵晓萌，2 0 0 4 ) 。其分析过程一般包括取样、样品处理( 提取、净化、衍生化) 和测 定等步骤。近年来，随着对农药残留研究的不断深入，农药残留检测方法日趋完善，并向简单、 快速、灵敏、低成本和易推广的方向发展。 1 1 有机磷农药 早在2 0 世纪3 0 年代，德国的s e h r a d e r 就合成了一系列有机磷酸酯类化台物，并发现其中一些 具有杀虫杀螨活性。于1 9 4 1 年台成世界上第一个植物内吸杀虫荆甲拌磷，1 9 4 4 年台成对硫磷。 目前全世界有机磷杀虫剂的品种1 0 0 余种，常用的5 0 多种。我国农药市场上有机磷品种3 0 余个， 占我国杀虫剂品种的3 8 ，但产量却占7 5 。有机磷杀虫剂具有以下几个方面的特点：( 1 ) 化 学性质不稳定，易水解，在碱性条件下易分解，因而不宜和碱性物质混合；易氧化，热分解， 易于在自然环境中动植物体内降解，在高等动物体内无累积毒性。正确使用时残留问题小，不 致污染环境。( 2 ) 杀虫效率高，广谱，作用方式多样，如触杀、喂毒、熏蒸，不少品种为内吸 杀虫剂。许多品种同时又是杀螨荆。( 3 ) 化学结构复杂多变，品种多，适用范围广。如敌敌畏、 辛硫磷持效期短，适用于随时收获的蔬菜、茶叶、桑叶等，甲拌磷、二嗪磷持效期长，适合做 种子处理或防治地下害虫。( 4 ) 毒性差异大。辛硫磷、马拉硫磷、敌百虫等毒性低，而对硫磷、 甲拌磷为剧毒品种。总的来说。有机磷杀虫剂的毒性偏高。但高毒品种在逐步淘汰，低毒品种 不断涌现。( 5 ) 对有机磷杀虫剂引起的急性中毒有特效的解毒药( 解碡定和阿托品) 。除少数品 种外( 如敌百虫、敌敌畏对高梁、瓜类敏感) ，一般对农作物安全，在推荐剂量下不致发生药害。 ( 6 ) 与有机氯农药、拟除虫菊酯类杀虫剂相比，害虫对有机磷杀虫剂的抗药性发展缓慢( 张一 宾等，1 9 9 7 ) 。 1 1 1 有机磷农药的性质 有机磷酸酯农药( o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s ) 主要用作农业杀虫剂，少数品种用作杀菌剂、 除草剂和脱叶剂( 沈惠麒等，1 9 9 6 ) 。成品剂型有乳剂、油剂、粉剂、喷雾剂和颗粒剂等。用药 方式有喷洒、熏蒸、拌种、浸种、涂茎等方式。本类农药杀虫效果好，残效期较短，但对温血 动物具有一定毒性，毒性与化学结构有关。多数属于中等毒和低毒。少数属于高毒类。 西南大学硕士学位论文文献综述 有机磷含有三个磷酯键，所以常被称为磷酸三酯。一般有机磷被分为两种类型，一种是磷 通过双键与氧结合( p = o ) 。如甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏等；另一种是磷通过叔键与硫结合( i b - s ) ， 如对硫磷、甲基对硫磷、辛硫磷、水胺硫磷、毒死蜱等( 金伟，2 0 0 3 ) 。此类农药的化学通式如 下： p c 琦 式中r l 和r 2 多数为甲基和乙基。x 为烷氧基、芳香基、卤素或杂环取代基团。 1 1 2 有机磷农药的种类 按化学结构可分为六大类( 张国珍，1 9 9 2 ) ( 如表1 - 1 所示) 。 寝1 1 有帆礴农药的分类 t a b l e1 - 1c l a s s i f i c a t i o no f o r g a n o p b o g p h o r u sp e s t i c i d e s 2确酰胺型 e 甲胺穗、乙最甲艘磷 3l l l w l l l m 凡口， 敌酉虫 4 镀尊礴馥蕾 飞p 0 氯化乐粟 5蕊舅礴黩昏 r 。1 0 。6 电釉 耐硫瞬杀螟i i f 核甲基对硫 邮 不可逆 不可逆 不可遵 不可逆 e 黛r 一乙蝴拌礴氧化后不可逆 1 i 3 有机磷农药的毒性 有机磷农药的急性毒性( k i t z , 1 9 6 4 ；冷欣夫，1 9 9 6 ) ，主要是归因于对胆碱能神经突触后膜 上的乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 的抑制。乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱水解为胆碱和乙酸； 2 西南大学硕士学位论文文献综述 ( h 热n c 峪h 2 。一c 旦c h 3 c 3 - n + ? h 2 c 邺h + h 3 c c 。洲 捆硅乙破 僻吣帮乏翌+ 确t 他靼碱磨奠 乙酰胆碱是神经系统中传导冲动刺激的化学介质在昆虫和脊椎动物神经中存在。正常机体在 神经兴奋时神经末梢释放出乙酸胆碱，传导刺激，然后被膪碱醑酶分解而失去作用。由于胆碱酯 酶的作用，从而调节神经之间的兴奋刺激。但有机磷农药进入动物和人体后，可作为胆碱酯酶的底 x l l 物，与酶形成非共价中间复合物，并被催化水解，除去一x - r ，基团，同时( 8 0 ) i p 一。基团与胆酯 酶酶活性中心的丝氨酸羟基作用，生成共价结合的磷酰化胆碱。磷酰基极难水解，因而对酶的活性 起着不可逆的抑制作用，使乙酰胆碱在体内大量累积，一些以乙酰胆碱为传导介质的神经系统处于 过度兴奋状态( 如抽搐) ，引起功能失调而导致中毒昆虫就失去知觉而死亡，对人畜也有剧毒作 用。临床中测定血液中胆碱醑酶的活力可以诊断有机磷农药中毒的程度( 小海斯，1 9 8 2 ) 。 另外，有机磷还对其它丝氨酸酶类、脂肪酶、某些非特异性酯酶都有抑制作用( 余孝颖，1 9 9 6 ； 朱南文，1 9 9 6 ) ，还对许多组织的膜酶，如n a + 、k + 、m 9 2 + 、c a 2 + 的a t p a s e 有毒害，也可使其它膜蛋 白酶磷酰化。磷酰化形成后，r o 键或x r 基团中所含有的c o 键亦可能断裂而脱下烷基。后者又往 往可能是具有活性的烷化剂，这就可使- s h 酶( 或蛋白质) 烷基化，从而抑制一s h 酶。 表1 2 农药对酶的抑崩( 袁勤生等1 9 9 4 ) f b b l e1 - 2i n h i b i t i o no fp e s t i c i d e so ne n z y m e s 一 一 脯 服一 嘞 西南大学硕士学位论文 文献综述 1 2 有机磷农药残留分析方法 最早仅局限于化学法和生物测定法，检测方法灵敏度低。其中胆碱酗酶法灵敏度较高，适 应性广。2 0 世纪6 0 年代以来，色谱技术得到了广泛的应用，尤其是气相色谱推动了农药残留分 析的高速发展( 仲维科等，2 0 0 0 ；李萍，1 9 9 9 ；冯秀琼，1 9 9 8 ) 。从此，色谱法就成为农药残留 分析中的主要分析方法。目前，随着新技术的开发和应用，农药残留分析又有了新的发展，这 些新的分析技术包括现代光谱分析、现代色谱分析、波谱色谱联用、生物传感、免疫分析和化 学计量与信息技术等。这些方法的原理、应j = i j 及优缺点如表1 - 3 所示。 裹1 3 有机磷农药分斩方法比较 t a b l e l - 3 c o m p a r i s o n o f i a a l y t i c a l m e t h o d s o f p e s t t e i d 4 1 胡学智，1 9 8 5 ；2 g u i l a u l t 1 9 7 2 ；3 e l i e z e r 1 9 9 4 ；4 董超，2 0 0 1 ；5 e i s e r t , 1 9 9 6 ；国家环保局，1 9 8 9 ；矗m o y 岛1 9 7 7 ； k r a u s e ，1 9 8 8 ；7 s h u p p a n , 1 9 9 0 ；h i n e , 1 9 9 2 ；8 赵云峰，1 9 9 7 ；9 ，b a r c e l o ，1 9 9 8 ；郑怀礼1 9 9 7 长期以来气相色谱法一直是监测环境中有机磷农药最为通用的方法( m a r c o s ，1 9 9 4 ；宋正 华等，1 9 9 8 ) ，但是该方法涉及到样品的提取、纯化、浓缩等许多复杂的预处理过程，导致监测 速度慢、连续性羞，而且所用监测仪器体积庞大、价格昂贵，因而不适于有机磷农药的野外连 续在线监测( t r a n m i r t h ，1 9 9 3 ；朱小山等，2 0 0 3 ) 。但是基于化学法、比色法、酶法和生物测定 法等常规分析方法也各有特点，因为不使用价格昂贵的大型仪器，操作简单快速、适应性广， 随着农产品安全对化学污染物的快速和高效检测的迫切需要，常规的检测方法有着一定的优势。 在这些分析方法中，酶分析法是基于有机磷农药对酶活性的抑制，用酶法测定农药的毒性 最为直接和专一，且灵敏度高，前处理步骤要求低，对实现果蔬农药残留测定的快速化、微型 化最为理想。 1 3 生物传感器 生物传感器是由电子技术和生物技术等高新技术相结合的产物由固定化并具有分子识别 功能的生物材料、换能器件及信号放大装置构成，能够选择性地对样品中的待测物产生响应， 并把待测物质的浓度信号转化为电信号，根据电信号大小定量检测出待测物质的浓度。生物传 感器选择性的好坏完全取决于它的分子识别元件，而其它性能则和它的整体组成有关。生物传 感器揭开了无试剂分析的序幕，使分析生物学从半定量向精确定量和自动化操作转化，给分析 生物学领域带来了一场革命( 毛跟年等2 0 0 3 ：许牡丹等，2 0 0 3 ) 。 1 9 6 2 年，c l a r k 和l y o n s 率先锗8 作了测定葡萄糖的生物传感器( 李颖娇等，2 0 0 3 ) ，提出了构 s 西南大学硬士学位论文 文献综述 建生物传感器的设想。4 0 多年来，生物传感器已获得了快速的发展广大科技工作者研制了适 合干多种物质测定的各类生物传感器，并广泛应用于发酵工业、环境监测、食品j r 程、临床医 学、材料科学、军事学和军事医学等领域，开创了分析领域的新纪元。 1 3 1 生物传感器的组成及原理 1 3 1 1 生物传摩器的原理 生物传感器的基本原理是通过被测分子与固定在生物接受器上的敏感材料发生特异性结 台，并发生生物化学反应，产生热焓变化、离子强度变化、p h 变化、颜色变化或质量变化等信 号，且反应产生的信号强弱在一定条件下与特异性结合的被测定分子的量存在一定的数学关系， 这些信号经换能器转变成电信号后被放大测定。从而间接测定被测分子的量。但在有些情况下 被测分子发生生化反应的信号太弱，使换能器无法有效工作时，需要将反应信号通过生物放大 原理处理。如图所示1 1 。所以，生物传感器工作的具体原理主要包括生物分子的特异性识别、 生物放大、信号转换和检测( 陆兆新，2 0 0 2 ) 。 翥盏h 至 元件i 信号 转换 光信号 或电信 号 圈1 1 生物传感器的工作原理 f i g 1 - 1w o r k i n gp r i n c i p l eo f b i o s e a s o rs 信号放大 信号处理 信号 输出 1 3 1 2 生物传蒜嚣的组成 生物传感器( b i o s e n s o r ) 是将具有分子识别功能的生物活性材料，如酶、蛋白质、抗原、 抗体、生物膜和细胞等作为敏感元件固定在特定换能器上进行测定的一类传感器( 王宗贤等， 2 0 0 3 ：张斌，2 0 0 5 ) 。生物传感器由生物接受器、换能器和测量系统构成。生物接受器，又称生 物识别元件，是生物传感器的核心部件，是将酶、抗原、抗体和细胞等具有生物分子识别功能 的材料固定化处理后形成的一种薄膜结构( 何永红等，2 0 0 4 ；朱江等，2 0 0 3 ) ，能对被测物质产 生高灵敏、高选择性的识别与结合；换能器是将能在生物接受器上进行生化反应的反应物或底 物的变化量或反应产生的光、电、热、声等信号捕获后，以可遵循的数学关系转换成电信号的 元件，根据需要转换的信号不同，所采用的换能器种类也各不相同：测量系统主要由信号放大 装置和测量仪表构成。信号放大装置能将换能器产生的电信号进行处理，放大后输出而便于测 最仪表的有效、精确测量( 项锦欣等，2 0 0 4 ；于兆林等1 9 9 2 ) 。 1 3 1 3 生物分子的特异性识别 作为生物传感器，首先必须具备良好的选择性，这就要求构成生物识别元件的生物活性物 质对底物有分子识别功能，即显示出选择的亲合性，分子识桃理直接决定了后续信号转换器 6 西南大学硕士学位论文文献综述 的类型，是决定生物传感器性能的最关键因素( 吴礼光等，1 9 9 5 ) 。生物传感器分子特异性识别 的原理是指固定于生物接受器中的生物分子能选择性地与待测样品中的目标物质特异性地结 合，而不受待测样品中其它物质的干扰。固定于生物接受器中的生物分子包括酶、抗原( 或抗 体) 、细胞、组织、d n a 等，它们发生生物分子特异性识别的原理也各不相同。酶实现特异性识 别的主要原理是酶分子只能与其特定底物、辅酶、抑制剂发生结台，而不与其它分子结合，酶 特异性识别的功能由酶分子的活性中心所决定；细胞、组织实现特异性结合本质上也是酶分子 的特异性识别；抗原( 或抗体) 的特异性结合由抗原抗体的特异性反应决定；d n a 分子通过碱 基互补配对的特性实现分子识别。生物活性物质的分子识别主要与以下生化过程有关( 吴礼光 等，1 9 9 5 ) ： ( 1 ) 酶催化反应：酶是生化反应的高效催化剂，具有高度的专一性，在反应过程中酶与底 物形成了酶_ 底物复合物，此时酶的构象对底物分子显示识别功能。 ( 2 ) 免疫化学反应：抗原是由外界入侵到体内的异物，而抗体是该异物入侵后体内产生的 一种特定蛋白质。抗体与抗原形成复合物，起控制抗原的作用：即显示出对抗原的分子识别。 抗体( a b ) 与相应抗原( a g ) 的反应可表示为：a g + a b = a g - a b 与酶促反应不同，通常酶只对低分子量物质有识别能力，而抗体则对高分子量物质有很强 的识别能力，即使是微小的结构差异也能做出准确的判断。 ( 3 ) 离子在膜上的选择传输：通常做法是将生物活性物质固定在某种膜上，形成响应特定 离子的选择性膜。在检测过程中生物活性物质作为载体。承担了目标离子的传送工作。 ( 4 ) d n a 杂交反应：在其检测过程中，形成的杂交体常置于电化学活性指示剂溶液中( 如 氧化还原活性阳离子金属配台物溶液) ，指示剂可强烈、可逆地结合到杂交体上，其产生的信 号可采用电化学手段加以检测。 1 3 1 4 信息放大 生物传感器的两大特点是高选择性和高灵敏度，其商选择性是由生物分子特异性识别所决 定的，而它的高灵敏度则主要取决于换能器和信号放大装置的性能、测定反应的信息物放大作 用。其中信息放大作用是指模拟和利用生物体内的某些生化反应，通过对反应过程中产量大、 变化大或易检测物质的分析来间接确定反应中产量小、变化小、不易检测物质的( 变化) 量的 方法，通过信息放大原理可以大幅度提高分析测试的灵敏度。生物传感器常用的信息放大作用 有酶催化放大、酶溶出放大、酶级联放大、脂质体技术、聚合酶链式反应和离子通道放大等( 丁- 兆林，1 9 9 2 ；项锦欣，2 0 0 4 ) 。 1 3 1 5 信号转换 固定在生物接受器上的生物分子与被测目标分子完成分子识别后，可发生特定的生物化学 反应，并伴随有可被换能器捕获的一系列量的变化，如物理化学变化( 含量、离子强度、p h 、 气体生成等) 、热焓、光、颜色变化等。换能器将这些量变信号捕获后，转换成易于测量的电信 7 西南大学硕士学位论文 文献综述 号。根据转化信号的类型选用不同的换能器，生物化学上常用的有c l a r k 氧电极( 测定氧气量变 化) 、过氧化氢电极( 测定h 2 0 2 量变化) 、氢离子电极( 测量p h 变化) 、氨敏电极( 测量n 生成 量) 、二氧化碳电极( 测定c 0 2 生成量) 和离子敏场效应晶体管( 测定离子强度变化) 等。另外 将热焓转化为电信号需要借助热电偶装置，将光信号转化为电信号需要借助光纤和光电倍增管 完成。 1 3 2 生物传摩器的固定化方法( 吴礼光等。1 9 9 5 ) 生物活性物质的固定化是生物传感器得以开发和改进的重要措施。固定化的目的在于使酶 等活性物质在保持其固有性能的前提下处于不易脱落的状态，以便与信号转换器组装在一起。 酶的催化反应依赖酶本身蛋白质分子具有的高级结构及活性中心，其活性中心是由一定的氪基 酸残基构成。与酶溶液一样。固定化酶要发挥催化作用时，既需要保证其高级结构。又要使活 性中心的氨基酸残基不发生变化。因此，在酶的固定化过程中，一方面应避免活性中心的氨基 酸残基参与固定化反应；另一方面，应避免高温、过酸或过碱、有机溶剂及高浓度盐的处理， 尽量采取温和条件。此外选择载体应注意不致引起蛋白质变性，经得起一定f l p h 和温度的改变， 有一定的亲水性基团和机械强度等特点( 袁勤生等，1 9 9 4 ) 。常用的酶固定化方法如表1 4 所示， 可归纳为包埋法、交联法和载体结合法等三大类，采用这