（发育生物学专业论文）补血草盐腺细胞特异性cdna文库构建.pdf

山东师范大学硕士学位论文 补血草：盐月彪阴斜：寺异i 生d i n a 文库藕建 ( 山东师范大学生命科学学院，济南，2 5 0 0 1 4 ) 摘要 土壤中过多的可溶性盐分对植物的不利影响是多种多样的，全世界约有2 0 的土地 盐渍化，还有近5 0 的灌溉土地受次生盐渍化的影响。盐渍化对可耕地的破坏影响和制约 着社会经济的发展。因而，研究植物的耐盐机理显得尤为重要。根据盐生植物的抗盐生理 机制及其形态结构和生态学特征的不同，b r e e k l e ( 1 9 9 0 ) 将盐生植物概括为三类：真盐生 植物、假盐生植物和泌盐盐生植物。 泌盐盐生植物种类繁多，在我国分布也极其广泛，海滨、盐沼、盐湖周边、沙漠、草 甸和灌丛等地都有泌盐盐生植物分布。植物泌盐是一个主动的生理过程，泌盐盐生植物主 要通过叶片或茎上的盐腺( s a l tg l a n d ) 或盐囊泡( s a l tb l a d d e r ) 将过多的盐分排出体外， 以此逃避盐胁迫。中华补血草( l i m o n i u ms i n e n s ek u n t z e ) 为白花丹科补血草属( l i m o n i u m ) 多年生泌盐草本植物，它具有特殊的泌盐结构盐腺，可将吸收到体内的盐离子排到体外， 从而避免盐分胁迫的伤害。 本研究主要利用显微切割技术( l a s e rm i c r o d i s s e c t i o n ，l m d ) ，从撕取的中华补血草 的下表皮上切取盐腺细胞，从中提取出盐腺细胞中的总r n a ，并反转录体外扩增出a r n a ， 以用于构建补血草盐腺细胞特异性c d n a 文库。在研究过程中发现： ( 1 ) 用c a r n o y s 固定 液固定材料，既能脱色又能很好地保存r n a ，甚至从固定3 个月的样品中仍能提取出较多 的r n a 。( 2 ) 五月至十月，中华补血草的叶片变得肉质化，变脆，难以撕取下表皮，取 材具有阶段性。( 3 ) 用含异硫氰酸胍的裂解液裂解补血草下表皮细胞，从中提取的总r n a 量很少，甚至于电泳检测不到条带，而用改良的c t a b 法提取效果较好。( 4 ) 实验过程中， 从3 0 0 m mn a c l 处理的材料中提取出的r n a 在量上要比非盐处理材料的多，尽管不能确定 所得到i 埘a 的量的差异是否是因为盐处理造成的，但是在取材前用3 0 0 m mn a c l 处理补血 草植株应该是有利无害。由于时间和材料的限制，本研究仅对补血草盐腺细胞特异性e d n a 文库的构建进行了初步的探讨，没有完成最后的e d n a 文库的构建工作。 其次，本研究通过扫描电镜技术( s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e s ，s e m ) 研究了中华补 血草盐腺的发育，结果发现：( 1 ) 经过盐处理的中华补血草叶中盐腺的数目比未经盐处 理的多，但是在发育开始的时间上没有明显差别。( 2 ) 在同一片幼叶中可同时存在发育 成熟的和发育中的盐腺细胞，即同一片叶上可存在不同发育阶段的盐腺细胞。( 3 ) 中华 山东师范大学硕士学位论文 补血草盐腺细胞的发育时间要远比气孔的发育时间早。 另外，本实验还结合一种新的n a + 特异性的指示齐u c o r o n ag r e e n 研究了哇巴因 ( o u a b a i n ，一种动物n a + k + a t p a s e 的抑制剂) 对中华补血草的生长情况及其根尖中钠的 含量和分布的影响。实验发现盐( 2 0 0 m mn a c l ) 和抑制剂( 1 0 0 9 mo u a b a i n ) 共同处理条 件下，根尖中钠特异性的荧光明显增强，显示n a + 含量显著升高。因而得出结论：在哇巴 因处理下，植物体内发生n a + 的积聚，从而推测补血草中存在某种对o u a b a i n 敏感的n a + 转 运体，且它对中华补血草在盐胁迫条件下的正常生长起着重要的作用。 关键词：中华补血草盐腺c d n a 文库激光显微切割 分类号：q 7 8 2 山东师范人学硕士学位论文 c o n s t r u c t i o no fas a l tg l a n ds p e c i f i cc d n al i b r a r yf r o ml i m o n i u m ( s c h o o lo fl i f es c i e n c e ，s h a n d o n gn o r m a lu n i v e r s i t y , j i n a n2 5 0 0 1 4 ) a b s t r a c t e x c e s s i v es o l u b l es a l ti ns o i lh a sd i f f e r e n tb a de f f e c t so np l a n t s a b o u tt w e n t y p e r c e n to f t h e s o i li ss a l i n es o i l a l lo v e rt h ew o r l d a n dn e a r l yah a l fo ft h ei r r i g a t e dl a n ds u f f e r ss e c o n d a r y s a l i n i z a t i o n t h ed a m a g eo fs a l i n i z a t i o nt oa r a b l el a n di m p a c t sa n dc o n s t r a i n ss o c i a le c o n o m i c d e v e l o p m e n t t h e r e f o r ei ti sp a r t i c u l a r l yi m p o r t a n tt os t u d yt h em e c h a n i s m so fs a l tt o l e r a n c e a c c o r d i n gt ot h ed i f f e r e n tp h y s i o l o g i c a lm e c h a n i s m s ，m o r p h o l o g i c a ls t r u c t u r e sa n de c o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ，b r e c k l e ( 19 9 0 ) d i v i d e dt h eh a l o p h y t e si n t ot h r e et y p e s ：e u h a l o p h y t e ， p s e u d o h a l o p h y t ea n dr e c r e t o h a l o p h y t e t h e r ea r em a n yk i n d so fr e c r e t o h a l o p h y t e ，a n dt h e ya l s oh a v eaw i d er a n g eo fd i s t r i b u t i o n i no u rc o u n t r y s e a s h o r e ，s a l tm a r s h ，a r o u n dt h es a l tl a k e ，d e s e r t ，m e a d o wa n db o s ke t ca r et h e i r p l a c e s o fr e s i d e n c e s a l ts e c r e t i o no ft h e p l a n t i sa na c t i v ep h y s i o l o g i c a l p r o c e s s ，a n d r e c r e t o h a l o p h y t e sc a ne x c r e t et h ee x c e s s i v es a l to u t s i d eb ys a l tg l a n do rs a l tb l a d d e r l i m o n i u m s i n e n s ek u n t z e ，ak i n do f p e r e n n i a lp l a n t ss e c r e t i n gs a l t ，b e l o n g st of a m i l yp l u m b a g i n a c e a ea n d g e n u sl i m o n i u m i th a st h ep e c u l i a rs e c r e t i n gs a l ts t r u c t u r e s a l tg l a n d ，w h i c hc a ns e c r e t es a l t i o n st oa v o i di n j u r yt h e r e b y b a s e do nl a s e rm i c r o d i s s e c t i o n ( l m d ) ，w eg o tc e l l so fs a l tg l a n df r o mt h el o w e re p i d e r m i s o fl i m o n i u ms i n e n s ek u n t z e ，a n dt h e ni s o l a t e dt h et o t a lr n af r o ms a l tg l a n dc e l l s a tl a s t ，w e g a i n e da m p l i f i e da r n ab yr e v e r s et r a n s c r i p t i o ni nv i t r oa n dw i l lu s e i tt oc o n s t r u c tas a l tg l a n d s p e c i f i cc d n al i b r a r yf r o ml i m o n i u m i nt h ee x p e r i m e n t w ek n e wt h a t ：( 1 ) t h em a t e r i a lf i x e d b yc a m o y sf l u i dc a nb ed e c o l o r i z e dw e l l ，a n dr n a c a nb es t o r e dp e r f e c t l y e v e ny o uc a ng e t h i g h q u a n t i t yr n a f r o mt h em a t e r i a lf i x e df o rt h r e em o n t h s ( 2 ) t h el e a v e so f l i m o n i u ms i n e n s e k u n t z eb e c a m ef l e s h ya n db r i t t l e ，s oi tw a sn e a r l yi m p o s s i b l et og e tt h el o w e re p i d e r m i s s oy o u c a no n l yg e tt h em a t e r i a la ts p e c i a lt i m e ( 3 ) t h el y s i sb u f f e rc o n t a i n i n gg u a n i d i n ei s o t h i o c y a n a t e w a su s e dt ot r e a tt h ec e l l so fs a l tg l a n d ，b u tw ec a no n l yg e tl i t t l er n aa n de v e nc a nn o tf m d r n ab a n d sb ye l e c t r o p h o r e s i s a f t e rt h i s ，w eu s e di m p r o v e dc t a bt og e th i g h - q u a l i t yr n a ( 4 ) d u r i n gt h ee x p e r i m e n t ，w ef o u n dt h a tt h ea m o u n to fr n a i s o l a t e df r o mt h em a t e r i a lt r e a t e d w i t h3 0 0 m mn a c li sm o r et h a nt h a tf r o mn o r m a lm a t e r i a l a l t h o u g hw ec o u l dn o tm a k es u r ei f s a l tt r e a t m e n ti st h er e a lr e a s o nw h i c hr e s u l t e di nt h i sp h e n o m e n o n ，b u ti ts e e m st ob eb e t t e rt o t r e a tl i m o n i u mw i t h3 0 0 m mn a c l s u m m a r i l y , i nt h i se x p e r i m e n t ，o n l yp r i m a r yr e s e a r c hw a s m a d eo nc o n s t r u c t i o no fas a l tg l a n ds p e c i f i cc d n al i b r a r yf r o ml i m o n i u mb e c a u s eo ft h e l i m i t e dt i m ea n dm a t e r i a l 3 山东师范大学硕士学位论文 s e c o n d l y , w es t u d i e dt h ed e v e l o p m e n to ft h es a l tg l a n di nl i m o n i u ms i n e n s ek u n t z eb y s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e w ef o u n dt h a t ：( 1 ) b e t w e e nt h es a l tt r e a t e da n d n o n - s a l tt r e a t e d l i m o n i u ms i n e n s ek u n t z e ，t h en u m b e ro fs a l tg l a n di sd i f f e r e n tw h i l et h ed e v e l o p m e n tt i m ei s n e a r l yt h es a n l e ( 2 ) o nt h es a l t l ey o u n gl e a f , t h e r ea r ed e v e l o p e da n dd e v e l o p i n gs a l tg l a n d s i t m e a n st h a ts a l tg l a n d sw h i c hb e l o n gt od i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e sc a nb eo nt h es a m el e a f ( 3 ) t h ed e v e l o p m e n tt i m eo ft h es a l tg l a n di nl i m o n i u ms i n e n s ek u n t z ei sm u c he a r l i e rt h a n t 1 1 a to f s t o m a i na d d i t i o n ，w ea l s os t u d i e dt h ei n f l u e n c eo fo u a b a i nc o m b i n i n gt h en e wf l u o r e s c e n tn d i n d i c a t o rc o r o n ag r e e n o u a b a i ni sa ni n h i b i t o ro fn 0 a t p a s ei na n i m a l s w ef o u n dt h a t l i m o n i u ms i n e n s ek u n t z ep l a n t e di n2 0 0 m mn a c la n dl0 0 i _ t mo u a b a i ns h o w e dd r a s t i c a l l y h i g h e rs o d i u m s p e c i f i cf l u o r e s c e n c ei nt h er o o tt i p ，w h i c ht o l du st h a tt h ec o n t e n to fn a + s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d s ow ec o n c l u d e dt h a tn da c c u m u l a t e di nv i v ow h e nt h ep l a n tw a s t r e a t e db yo u a b a i na n dp r e s u m e dt h a tt h e r ew a ss o m en a + t r a n s p o r t e rw h i c hw a ss e n s i t i v et on a + a n di tp l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nt h en o r m a lg r o w t ho fl i m o n i u ms i n e n s ek u n t z eu n d e rs a l t s t r e s sc o n d i t i o n s k e yw o r d s ：l i m o n i u ms i n e n s ek u n t z e s a l tg l a n dc d n al i b r a r yl a s e rm i c r o d i s s e c t i o n c a t e g o r y ：q 7 8 4 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声明的，本 栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做 的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：互瘫巳硷 新嫁船纽 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堂撞可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：互j 积陟趱 签字日期：w v 罗年多月o e t 一 乃 丝细 貉陴 r门， 罗 氧 沙 签 ： 师 期 引 巨字 签 山东师范大学硕士学位论文 第一部分文献综述 盐渍土是一种世界性的低产土壤，甚至是不毛之地，但是在很多情况下又具有地势平 坦和便于灌溉的优点，所以自古以来就被世人所瞩目。受气候变化和全球人口不断增长的 影响，土地盐碱化与水土流失和大气污染一样，成为日益严重的环境问题之一f 】 2 】。随着耕 地面积减少与粮食需求日益高涨之间的矛盾越来越突出，盐渍土的开垦利用受到诸多国家 或地区的高度重视。全球约有5 7 亿亩土地具有不同程度的盐渍化，约占可耕地面积的 1 0 t 3 1 。在我国，约有1 5 亿亩各种盐渍土地，盐渍化已成为影响我国社会经济发展最重要 的环境因素之一【4 】。 土壤中过多的可溶性盐分对植物的不利影响是多种多样的，主要表现在以下几个方 面：一是渗透胁迫。一般植物在土壤含盐量超过0 2 0 2 5 时，就会引起盐分胁迫，导致 植株矮小，叶小暗绿，植物生长异常。二是营养缺乏胁迫。植物的正常生长发育需要各种 矿质元素，土壤中某些离子如n a + 等含量过高时，会引起另一些离子的缺乏，从而导致营 养不良。三是离子毒害作用。当生境中的盐离子达到一定浓度时即对植物产生毒害，最明 显的伤害就是质膜选择透性的破坏，即透性增大，胞外的盐离子大量进入细胞内，胞内的 部分溶质大量外渗，导致代谢紊乱，离子稳态破坏，产生一系列异常反应，甚至导致植物 体死亡【5 1 。此外，在盐胁迫条件下植物的光合速率也有所下降【6 1 。总之，盐胁迫对植物多 方面的伤害最终表现为对植物生长发育的综合影响。 1 植物对盐胁迫的适应 盐分对植物的生长发育有一定的抑制作用。但是，一些植物仍然能够生长在盐分环境 中，说明它们在长期的进化过程中对盐分胁迫有了相应的应对措施。根据f l o w e r s 等( 1 9 8 5 ) 【7 】和a r o n s o n ( 1 9 8 9 ) 【8 】的报道，以及中国4 2 1 种盐生植物分属于6 6 科的事实，也不难看 出盐生植物是由不同进化水平的科适应于盐渍生境演化出来的一类植物。 1 1 植物的耐盐机理 根据对不同植物的研究，耐盐或避盐的主要途径有：( 1 ) 泌盐或排盐。植物吸收盐分 后，向特定的部位或器官( 如盐腺) 运输、积累，从而将盐分排出体外。( 2 ) 稀盐。盐胁 迫下，植物会通过吸收大量的水分来稀释体内的盐分浓度。( 3 ) 拒盐。这类盐生植物根部 的细胞对于盐类的透过性非常小，虽然它们能在盐碱土壤上正常发育生长，但几乎不吸收 土壤中所含的有害盐类。( 4 ) 隔盐。盐分进入植物细胞后，通过某种机制，让盐分在液泡 内集中，并实行细胞区隔化，阻止盐分向其它细胞器扩散【9 】。( 5 ) 避盐。调节植物的生理 5 山东师范大学硕士学位论文 活跃时期，使其在时间和空间上不与环境严重期一致。( 6 ) 忍盐。细胞内的盐分高，但是 不足以构成危害。( 7 ) 离子拮抗。一些植物在吸收盐分离子的同时，也吸收了一些与之有 拮抗作用的离子，从而减弱或避免盐分离子的危害。( 8 ) 螯合作用。盐分离子进入细胞后， 与细胞质中的某些物质螯合，成为非毒害性的螯合物。 根据盐生植物的抗盐生理机制及其形态结构和生态学特征，b r e c k l e ( 1 9 9 0 ) 将盐生植 物概括为三类：真盐生植物、假盐生植物和泌盐盐生植物【10 1 。 1 1 1 真盐生植物( e u h a l o p h y t e ) 真盐生植物，即人们常说的稀盐盐生植物或积盐盐生植物。这类植物的主要特点是， 植物体可以从外界吸收较多的盐分并储存在植物体中。体内有大量盐分的存在而不受害， 其适应手段就是叶片或茎段的肉质化，肉质化组织含水量高，可以将植物体盐分稀释到不 致害水平；另外，通过细胞离子区域化作用【1 1 】，将离子转运到细胞的特定部位液泡， 降低盐离子对细胞质中重要细胞器和重要酶的毒害作用，同时增大细胞浓度，降低细胞水 势，提高其抗渗透胁迫能力和细胞吸水能力。 在盐生植物中，稀盐盐生植物是最大的一类，其耐盐能力也最高，一般都可以在 2 0 0 5 0 0 m m o l l 盐浓度中继续生长。这类植物有一最适生长盐度，低于或高于最适盐度其 生长均下斟12 1 。另外，这类植物体的含盐量也比较高，一般情况下，它们植物体的含盐量 都可以达到植物体干重的3 0 4 0 。 稀盐盐生植物大部分属于藜科。茎肉质化稀盐盐生植物有盐角草、盐节木和盐穗木等； 叶肉质化稀盐盐生植物有碱蓬属植物、盐爪爪属植物、假木贼属植物、猪毛菜属植物等。 1 1 2 假盐生植物( p s e u d o h a l o p h y t e ) 假盐生植物，即拒盐植物，是指一些植物采用不让环境中的盐离子进入细胞，以避免 盐离子的毒害作用，或者允许环境中的盐离子进入植物体，而植物将进入植物体的盐离子 进行重新分配，使其储存于植物的安全部位，从而使植物要害部位免受盐离子的伤害作用 【1 2 】。在盐生植物中，属于拒盐类型的盐生植物并不多，且一般分布于盐分较轻的生境中， 在无盐生境中常常生长更好，提示这类盐生植物并非生理需盐植物。 1 1 3 泌盐盐生植物( r e c r e t o h a l o p h y t e ) 泌盐盐生植物主要特点是通过叶片或茎上的盐腺( s a l tg l a n d ) 或盐囊泡( s a l tb l a d d e r ) 将过多的盐分排出体外。盐分的外排是泌盐植物抗盐的主要途径之一【l 引。 泌盐盐生植物种类繁多，在我国分布也极其广泛，海滨、盐沼、盐湖周边、沙漠、草 6 山东师范大学硕士学位论文 甸和灌丛等地都有泌盐盐生植物分布【1 4 1 ，如大米草、补血草、红树等。泌盐植物并非生理 需盐植物，而是典型的兼性盐生植物。植物泌盐是一个主动的生理过程，基质盐分类型、 盐分含量、大气湿度、蒸腾强度等因素对泌盐效率有明显的调节作用。 1 2 泌盐结构 泌盐盐生植物最显著的形态结构特征是具有泌盐结构，这种结构包括盐腺和盐囊泡两 类。 盐腺的结构在不同的植物中差异很大，但在同一个科中的植物是很相似的。根据结构 的差异可将盐腺分为两种类型，即多细胞盐腺( m u l t i c e l l u l a rg l a n d ) 和双细胞盐腺( b i c e l l u l a r g l a n d ) 【1 5 1 。 双子叶泌盐盐生植物的盐腺均为多细胞盐腺，由于组成盐腺细胞数目不同、排列方 式不同，因此各种多细胞盐腺的结构也不尽相同1 6 1 7 1 。但是它们具有许多相同之处， 主要表现在：( 1 ) 盐腺由分泌细胞、收集细胞、基细胞或柄细胞组成；( 2 ) 在腺体 中，除内部细胞和收集细胞之间的渗入区外，几乎全部被有一层角质，角质层通常沿 着腺体外表面从分泌细胞壁分开，在分泌细胞和角质层之间形成一个较大的腔，即收 集室，其上方的角质层具小孔；( 3 ) 分泌细胞和收集细胞以及分泌细胞相互之间有 较发达的胞间连丝；( 4 ) 在多数植物中盐腺分泌细胞的细胞壁上出现许多细胞壁突 起，这种结构在柽柳属和补血草属中特别明显；( 5 ) 盐腺分泌细胞的特点是细胞质 浓厚，细胞核较大，有大量的线粒体，无中央大液泡但有许多小液泡，无发育良好的 叶绿体；( 6 ) 收集细胞在超微结构上和叶肉细胞非常相似，具有中央大液泡、发育 良好的叶绿体、线粒体及其它细胞器。如：柽柳科无叶柽柳盐腺由排列成4 对的8 个细胞 组成，基部2 个液泡化的收集细胞，其多 1 - 6 个细胞质浓稠的分泌细胞。报春花科海乳草盐腺 包括一个收集细胞、一个柄细胞和4 8 个分泌细胞，含中央大液泡的收集细胞在基部，与之 相连的是大而扁的柄细胞，再外部是4 8 个分泌细胞。白花丹科补血草属盐腺【l8 】由1 6 个细胞 组成( 图1 1 ) ，其中四个分泌细胞排列成一个环，每一个细胞外侧又伴有一个相邻的小细 胞，分泌细胞及其邻细胞外被两层杯型细胞包围，每一层由四个扁平的细胞组成，排列与 分泌细胞相似。盐腺的上部及邻近的表皮细胞被有一层厚的角质层，外层的杯状细胞外壁 也明显角质化，角质层扩展到相连接细胞的细胞壁，从而形成了一个低于表皮细胞层的稳 固的腺体复合结构。每一个分泌细胞顶端的角质层中央有一个直径约为1 p m 的小孔，深藏 在内部而邻接腺体的是4 个大的高度液泡化的收集细胞。 7 m 末师范 学碗士学位论文 ab i 封1 i 中华补血草的盐腙 a 中华补血草幼叫上发育中的盐腺( 扫描电镜) ；b 中华补血草的成熟叫片上的花型盐腺( 显微镜： f i g1 一is a l tg l a n do f l i m o n i u ms i n e n s ek u n t z e as a i lg l a n do f l i m o n i u ms i n e n s e k u n t z e i nay o u n g l e a f ( b ys e m ) ： bs a l tg l a n do f l i m o n i u ms i n e n s e k u n t z e i na m a t t e l e a f ( b y o p t i c a l m i c r o s c o p e ) 宋本科植物的盐腺为双细胞盐腺，由两个细胞组成即基细胞和帽细胞，前者是收 集细胞，后者为分泌细胞。大米草具有典型的双细胞盐腺：盐腺由1 个较大的基细胞 和1 个小的圆顶状的帽细胞组成。腺体表面有1 层角质层，但是基细胞肩部和底部与 表皮细胞和叶肉细胞之间没有角质层隔丌，角质层向外延伸越过帽细胞，在角质层和 帽细胞之间形成一个腔，其项部有一些小孔。基细胞与附近的叶肉细胞和帽细胞邻接 的壁上有明显的胞间连丝。基细胞和帽细胞均具有浓稠的细胞质、细胞核、多数线粒 体、一些小的液泡、游离核糖体、内质网、高尔基体和质体i ”】。基细胞具有遍布整 个细胞的壁突起和折叠的隔膜系统将细胞质分离。帽细胞、基细胞及围绕它的4 个表 皮细胞共同组成盐腺复合体。獐毛也为职细胞盐腺。 盐腺主要分泌无机离子，另外也分泌少量的有机物。 盐囊泡也具有泌盐的功能，它存在于錾科的一些属中，如滨藜属的所有种类、藜 属的多数种类咀及猪毛菜属的部分种类i 川。一般情况下，盐囊泡有一个柄( 】4 个柄 细胞) 和一个膨大的泡状细胞，柄细胞的结构与盐腺的各种细胞相似与盐腺不同的 足，盐囊泡柄细胞中含有叶绿体。叫表皮q | 赫囊泡的大小、多度变化与盐度、光照、 通气性有关，表皮中盐囊泡的密度从叶尖至叶基是逐渐降低的，同时近轴叶表面比远 轴叶表面的密度低。 8 山东师范大学硕士学位论文 1 3 泌盐机理 有许多生理证据证明盐腺的分泌作用是一主动生理过程。如盐腺分泌物的浓度高于根 际培养基浓度，说明离子从盐腺邻近细胞进入盐腺是逆着浓度梯度进行的；盐生植物盐腺 的分泌作用与外界温度、光照有关并受到代谢抑制剂的影响这些足以证明盐腺的分泌 作用是一个主动的生理过程。通过盐腺的泌盐作用，可以将植物组织中过剩的盐分分泌到 体外，或储存到囊泡中，以调解组织的含盐量，使组织免遭盐离子的毒害。 关于盐腺的泌盐机制，只知道它是一个主动的生理过程，更细致的了解目前尚不清楚， 仍停留在假说阶段。 ( 1 ) 泌盐作用的渗透机制假说 这个假说由a r i z 等( 1 9 5 5 ) 1 1 9 】提出。盐离子由收集细胞进入分泌细胞后，分泌细胞中 的盐离子即被一种压力压出。这种压力的产生，是主动的溶质积累所导致的流体静压力的 增大和由此而产生水流进入细胞的物理过程形成的。 目前一般认为补血草盐腺泌盐的过程如下： 叶肉细胞盐离子= 主箍_ 收集细胞主篆一分泌细胞王豸器_ 分泌到细主动过槿主动过程主动平物理过程 胞外 ( 2 ) 盐腺的泌盐作用是胞饮的相反过程的假说 这个假说由z i e 9 1 e r 和l u t t g e ( 1 9 6 7 ) 【2 川以及s h 妇o n y 和f a h n ( 1 9 6 8 ) 【2 1 】提出。他们认 为盐腺的分泌作用是通过以前积累在一些小细胞质囊泡中的盐液，向细胞外表面排出的过 程。是一个相反的胞饮现象。他们还提出一些分泌物质，例如果胶质等，可以作为离子运 输的载体。 ( 3 ) 盐腺的泌盐作用类似动物液流运输系统假说 这个假说i 扫l e v e r i n g 和t h o m s o n ( 1 9 7 1 ，1 9 7 2 ) 2 2 】提出，他们发现大米草属植物盐腺 显著不同于双子叶植物，盐腺的基部细胞中的唯一物质是具有围绕胞外通道的各种分割的 膜，这种结构就参与分泌作用。另外通过这种特殊结构与动物细胞组织系统比较研究，发 现大米草属植物盐腺的分泌机制几乎与动物液流运输系统相同。他们提出在盐腺基部细胞 中有一个主动的将离子分泌到分隔膜的胞外通道的作用，这个过程是通过利用线粒体提供 的能量来完成的。 ( 4 ) 盐腺的泌盐作用细胞渗透溶质调节假说 s t o r e y 等( 1 9 8 3 ) 2 3 1 利用x 射线微区分析技术研究了生长在6 0 0 m m o l ln a c l 条件下的 泡状滨藜盐腺( 盐囊泡) 的渗透溶质调节，通过其叶片的不同部位的细胞及细胞的不同部 山东师范大学硕士学位论文 位的n a + 、k + 、c l 。等离子进行定位分析，认为叶细胞的细胞质倾向于选择k + 而排斥n a * 。从 栅栏细胞到囊泡细胞，其渗透溶质调节能力逐步扩大，导致渗透溶质n a + 和c l 逆着浓度梯 度流入囊泡细胞，在囊泡细胞遇到外力或由于n a + 和c l 。浓度太大，大量吸水而使囊泡呈高 度膨胀状态，引起自动破裂，或碰触直接导致爆破，将泡中积累的n 矿、c l 等离子排出体 外( 图1 2 ) 。 图1 2 滨黎( a t r i p l e x s p o n g i o s a ) 成熟叶片在6 0 0 m m o l l n a c l 条件下渗透调节的图解 b s ：维管束鞘细胞质和液泡；v s ：维管系统；p ：栅栏细胞；h ：皮下细胞；e ：表皮细胞； b ：泡状细胞； g ：保卫细胞。箭头指示c 0 2 和h 2 0 的运动 f i g 1 - 2s c h e m a t i cd i a g r a mo fs a l ts e c r e t i o nb ys a l tb l a d d e ro f a t r i p l e xs p o n g i o s ag r o w no n6 0 0m m o l ln a c l b s ：b u n d l es h e a t hc e l l ；v s ：v a s c u l a rs y s t e m ；p ：p a l i s a d ec e l l ；h ：h y p o d e r m a lc e l l ；e ：e p i d e r m a lc e l l ； b ：b l a d d e rc e l l ；g ：g u a r dc e l l a i t o w ss h o wm o v e m e n t so fc 0 2a n dh 2 0 1 4 泌盐盐生植物的开发利用 我国的泌盐盐生植物有许多种具有很大的经济价值。仅就目前已被利用的泌盐盐生植 物来看，其用途是多方面的。首先，很多泌盐盐生植物可提供多种多样的人类生活必需品。 如：猪毛菜的根茎可食用，红树林植物可作为薪材、建材和优质家具材料，结缕草是很好 的草坪植物并可利用经处理的含盐工业废水浇灌【2 4 2 5 1 ，补血草和二色补血草全草药用等。 其次，泌盐盐生植物又可作为盐渍土地的改造者发挥经济价值，或防止土壤返盐、增加土 壤有机质，或作为牧草改良盐碱地植物的化学性质。另外，某些泌盐盐生植物还在保护生 1 0 山东师范人学硕士学位论文 态环境方面发挥着不可替代的作用。 除此之外，许多泌盐盐生植物还是极其重要的资源植物，因为：第一，由于世界性的 淡水缺乏和耕地次生盐渍化的不断加重，海水灌溉农业成为今后的研究方向，可用海水灌 溉的植物，目前看来，最有前途的是盐生植物资源，其中包括泌盐盐生植物。第二，通过 研究泌盐盐生植物对盐渍生境的生态适应机制，可以发掘提高农作物抗盐能力的途径。第 三，泌盐盐生植物还是重要的抗盐种质资源库，某些泌盐盐生植物与农作物亲缘关系较近， 可以利用遗传学手段与近缘农作物杂交，以提高农作物抗盐能力。第四，泌盐盐生植物还 提供生物抗盐基因库。通过在研究泌盐植物对盐渍生境的适应机制基础上，进一步利用分 子生物学手段，确定泌盐盐生植物的特殊抗盐基因，然后，将这些基因分离克隆，并转移 到非抗盐农作物中，以培育出抗盐的转基因作物新品种，使其能正常生长在盐渍土地上， 充分将盐碱地利用起来，这在我国可发挥极大经济效益，如果能充分地利用盐荒地和次生 盐渍化土地，对我国的农业发展的意义是不可估量的【2 6 】。 中华补血草( l i m o n i u ms i n e n s ek u n t z e ) 为白花丹科补血草属( l i m o n i u m ) 多年生泌盐 草本植物【1 4 】。它具有特殊的泌盐结构盐腺，可将吸收到体内的盐离子排到体外，从而 避免盐分胁迫的伤害。中华补血草可以使盐土脱盐，改善土壤结构，被誉为盐碱地改造的 “先锋植物” 2 7 3 。一直以来，人们对于补血草的研究多局限于发育过程、泌盐过程及泌盐 机理等方面，而激光显微切割技术的出现，为对盐腺特异性表达的基因的研究提供了可能 性。 2 激光显微切割( l a s e rm i c r o d i s s e c t i o n ，l m d ) 技术 植物体是由彼此相互联系的多种类型细胞所构成的，由于这种结构上的复杂性，目前 多数研究都是通过分析混合组织样品来获得数据【2 8 】，其局限性在研究对象在组织中只是暂 时存在或数量相对很少的情况下显得尤为突出。因此，为了获得特定类型细胞的准确信息， 分离出同质的目标细胞就显得非常重要。 已报道过的从植物中分离同质细胞样品的方法至少有3 种。一种方法是从其中分离原 生质体【2 9 , 3 0 ，另一种方法是用毛细管从植物活体中获得植物细胞组分【3 ，激光显微切割( 图 1 3 ) 技术与以上其它方法相比，能够精确、快捷地获得大量的特定种类细胞样品，显现出 极大的优越性。 2 1l m d 的工作原理 l m d 用激光从组织切片中分离特定区域。激光切割仪一般与复合光学显微镜相连从而 使l m d 操作可以在亮视野，暗视野，以及荧光显微镜法下进行。现已有多种l m d 系统可供 山东师范大学硕士学位论文 应用，它们在目标分离的两种基本方法即激光捕获和激光切割上有细微的区别。许多文献 都涉及用两种方法分离多种目标组织【3 2 - 3 7 1 。 2 1 1 激光捕获 用红外激光将覆盖于盖上的热塑薄膜融化，从而将感兴趣的区域黏附于盖上【3 8 】。当将 盖提起时，目标区域便从原样上撕下。红外激光发出的热量并不会破坏核酸，许多蛋白质 研究已经利用这项技术3 9 1 。l c m 所依赖的是转移盖与脱水目标之间的黏附力大于样品和玻 片之间存在的黏附力。如果样片和组织样品之间的结合力太大，则盖不能有效分离目标材 料。 目标组织能被捕获到两种分离盖上，这两种分离盖均放置在样片上。盖在设计上使其 能够用来收集目标组织区域的数量最大化，而且可以直接置于样品上。盖和样品之间的接 触是不可避免的，因而导致组织的非特异性的组织粘连。尽管我们可以在分离之前选择性 地敲除样片上不牢固的材料以及盖上未粘结的碎片来减少这种情况，但是相当比例的目标 材料会丧失f 3 8 1 。对于小量的取样，可以用h s c a p 。这种盖表面有突起，以避免样品和转移 膜之间不必要的粘连。将其与一个小的塑料装置相连以确保选择性的组织分离位于帽的中 心区域，非特异性粘连的问题即可避刽4 0 1 。 通过激光捕获系统手动获取大面积的样品很费时间，因为显微镜需要重新定位，而且 每打一次只有小面积的转移膜黏附到样品上。较大的取样还总是导致将错误的组织类型粘 连到帽上而不容易敲除，从而成为废样。如果需要大面积或大量的细胞，激光切割系统甚 至是手动的显微切割更加有效【4 1 , 4 2 】。 2 1 2 激光切割 激光切割应用更为广泛，它应用波幅较窄的紫外激光将周围组织通过光裂解的方式切 除，有效地保留目标材料，所用的紫外激光的波长略高于蛋白和核酸的吸收峰值，并且对 周围细胞不造成热损伤( 图1 4 ) 。生物样品一般置于连在样片上的膜支持物上，激光穿过 样品和膜，将目的细胞留在膜片段上。切除的碎片有时会落到目的区域，成为低量的污染 源【3 3 1 。 使用消融切割法分离目标的l m d 系统有一系列非接触性的收集策略。有的系统使用激 光波制造的光压将目标向上弹射到几毫米之外的离心管驯4 3 1 。有的系统在膜支持无下面没 有任何东西，使切割的片断可以直接落入离心管中。这两种收集策略都经由目的材料的不 安全运输，会发生材料的损失【3 3 ，删。然而，一种既安全又无需接触的收集策略得以实现， 当切割时，一个专门的帽与膜的背面相连，帽提起的时候目标材料便黏附在上面。 1 2 山东师范大学硕上学位论文 紫外激光也可以通过融化不想要的细胞型来清理样品，另外，使用紫外激光和收集帽 的系统也可以在目标分离之后消融掉帽上的非目的碎片。为了得到高通量的l m d ，一些激 光切割系统使用了专门的硬件和目标识别软件1 4 5 】。 2 2l m d 的影响因素 大多数l m d 研究的重要的先决条件就是获得好的组织切片，材料的准备必须平衡组 织形态和样品质量的关系，也就是在显微镜下要能够分辨出目标细胞的特征，而同时也要 争取获得最大的高质量核酸或蛋白的回收率，影响该平衡的两个关键步骤是固定和包埋。 因而，固定剂的选择就显得极为重要。在植物l m d 研究中使用了两种化学固定剂【4 6 4 9 】： 交联固定剂( 如乙醛和福尔马林) 组织形态较好但核酸和蛋白质产量差；沉淀固定剂 ( 像乙醇或丙酮) 组织形态较好，同时能保持生物分子较高的回收率。在有些情况下， 可用冰冻法代替化学固定，冰冻的材料经适当包埋以后可在低温仪器中被切成薄片，新鲜 的冰冻组织和冰冻切割能保证高产量和高质量的r n a 提取 5 0 , 5 1 】。不过用冰冻法切割成熟 的或具有大的液泡的植物组织时需要固定和加入成晶保护性物质，比如1 0 1 5 的蔗糖【4 0 】