固定化酶.ppt

固定化酶及其应用研究,目录,固定化酶的意义,游离状态的酶对热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等稳定性较差，易失活，并且反应后混入催化产物等物质，纯化困难，不能重复使用。,酶的化学本质是蛋白质。其催化作用具有高选择性、高催化活性、反应条件温和、环保无污染等特点。,天然酶的优缺点,背景,已固定了几种芽孢杆菌和链霉菌中提取的葡萄糖异构化酶，并大量应用于工业生产。,1916,1969,1970,自1972,发展历程,日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基酸水解酶用来从混合氨基酸中生产L-氨基酸，开辟了固定化酶工业化的新纪元。,我国开始了固定化酶的研究工作，许多单位相继进行了固定化酶和固定化细胞的应用。,Neleson和Griffin最先发现了酶的固定化现象。科学家就开始了固定化酶的研究工作。,物理吸附法、交联、共价结合及包埋等方法,通过化学或物理的处理方法，使原来水不溶的酶与固态的水不溶性支持物结合或被载体包埋。,将酶固定在生物膜或超滤膜上，制造出来的生物膜反应器,固定化酶简介,定义,常用技术,先进方法,固定化酶的优点,优点,对热、pH等的稳定性提高，对抑制剂的敏感性降低,能反复使用,应用制成酶电极的固定化酶建成监测化学反应的系统,适用于连续化、自动化生产,经过简单过滤离心，产品与酶可分离开,反应空间大大缩小，从而能准确控制反应,可以消除侧反应,固定化酶技术,利用性能优良的天然载体，或借助现代技术对传统载体进行改性，合成新型载体材料。,改善催化动力学参数；实现多酶共固或整个细胞的固定化,通过辐射、光、等离子体、电子等方法制备,吸附法、交联法、包埋法、共价结合法,传统的酶固定化方法,新型酶固定化方法,原则：实现在较为温和的条件下进行酶的固定化，尽量减少或避免酶活力的损失。,酶的定向固定化及多酶共固技术,改性载体及新型载体固定化酶,新型载体高分子复合物，因其优良的传质性能、电解质的灵敏介电特性以及良好的生物相容性等特点，也成为固定化酶良好的新型载体，在酶固定化领域显示了广阔的应用前景。,改性载体固定化酶通过表面涂层或表面吸附等物理方法以及接枝、聚合等化学方法实现载体表面物理性质或化学结构的改变。,异同,例：以壳聚糖为载体固定化青霉素酰化酶,固定化酶的反应原理：醛的羰基和一级胺、二级胺能发生亲核加成反应生成西佛碱(Schiffbase)，因此利用甲醛和双功能团的醛类化合物如戊二醛等与壳聚糖及蛋白酶的氨基发生Schiff反应，可用来固定化青霉素酰化酶。其键合机理如下：,例：以壳聚糖为载体固定化青霉素酰化酶,酶活的测定原理青霉素G钠盐在青霉素酰化酶的作用下，水解成6一氨基青霉烷酸(6一APA)和苯乙酸，用NaOH溶液中和生成的苯乙酸，使反应体系保持恒定的pH值。记下反应12min内消耗NaOH溶液的体积数，从NaOH溶液的体积数求得生成苯乙酸的量。特定条件下，单位时间内单位酶量生成的苯乙酸的微克分子数为酶活。其中青霉素钠盐的水解反应如下：,例：以壳聚糖为载体固定化青霉素酰化酶,方法：壳聚糖载体的制备称2g壳聚糖溶解在100mL的5的乙酸溶液中，在微火上缓慢加热，溶解，吸人针管，用针筒注入2的多聚磷酸钠溶液中，搅拌，使其凝固成颗粒状，浸泡11.5h，抽滤，水洗至pH值为中性。用活化剂活化壳聚糖载体用不同的醛在不同pH值下，在室温与上述壳聚糖载体置于转速150r/min摇床上，反应1.5h，以蒸馏水充分洗涤。用活化载体固定化青霉素酰化酶在上述预处理的活化壳聚糖载体中加人一定量的酶液，在不同pH值下，置于转速为150rmin摇床上振摇12h，充分洗涤后测固定化酶活和残余酶液的酶活。酶活的测定,固定化酶的应用,例：磁性固定化酶处理含酚废水的研究,实验中所用的酶为辣根过氧化物酶（HRP），从生物体内提取精制而成，具有较高的活性。利用辣根过氧化物酶催化过氧化氢产生活性氧，并将酚氧化，生成水溶性差的化合物，然后用过滤或沉淀的方法加以分离。其主要反应为：即在HRP的作用下，氧化剂(H202)将酚氧化，产生了活性高的苯氧自由基等中间物，它们从酶的活性中心扩散到溶液各处，与酚分子或苯氧自由基本身发生反应，生成了一系列的聚合物。这些聚合物具有高相对分子质量和低水溶性的特性，因而易从溶液中分离。,例：磁性固定化酶处理含酚废水的研究,实验方法:在50mL的锥形瓶中，先加入缓冲液，然后依次加入一定量已知酚浓度的水溶液、酶和过氧化氢溶液，磁力搅拌，控制一定的反应条件，当反应达到预定时间后，过滤，去除沉淀物，取滤液分析酚浓度，计算酚的去除率。酚含量的测定用4氨基安替比林比色