（分析化学专业论文）碳纤维超微电极直接电化学及其应用研究.pdf

硕士学位论文 摘要 基于生物识别的高度专一性与电化学信号检测的放大作用相结合的电化学生 物传感器，具有灵敏度高、选择性好、易于微型化和自动化等优点，在临床诊断、 生物分析、环境监测等领域具有广泛的应用前景。超微电极测试技术作为一种重 要的测试技术，在超微电极上扩散速度快，电极表面电流密度高，测定的信噪比 高，从而可提高测定的灵敏度。因此，超微电极已成为直接研究生物大分子电化 学的有力手段。本研究工作致力于发展氧化还原蛋白质在碳纤维超微电极上的直 接电化学行为研究，在超微修饰电极表面修饰一层媒介体，加速氧化还原蛋白质 ( 酶) 与电极问的电子转移，可提高测定的选择性：对于开发新型的生物传感器 均有重要的意义。主要完成了以下研究工作： 1 、利用超微电极优良的电化学特性，结合壳聚糖具有很强的成膜能力的性质， 膜表面丰富的- n h 2 ，与戊二醛交联固定h r p 酶，并用纳米铂作为增强电子传递的 促进剂，制备了无电子媒介的h 2 0 2 微型生物传感器一第三代酶传感器。在无电子 媒介的情况下，辣根酶生物传感器测定h 2 0 2 的线性范围为6 4 1 0 3 6 x 1 0 3 m 。 说明微型传感器也有较好的灵敏度和检测性能，超微电极对蛋白质直接电化学研 究提供了一种有力的手段。 2 、制备纳米a u 一壳聚糖复合材料，壳聚糖膜表面丰富的n h 2 与纳米a u 强静 电结合，在超微电极表面获得稳定的纳米a u 修饰层。在形成的纳米a u 层自组装 h b ，以此来固定血红蛋白。负电性的纳米a u 可以有效地保持酶的活性，制备得 到性能良好的生物传感器，测定h 2 0 2 的线性范围是8 5 l o 6 至4 4 0 1 0 3 m 。测定 n a n o l 2 的线性范围是o 2 5 l o 6 至2 8 0 1 0 五m 。 3 、研究把参比电极微型化，实现参比电极和工作电极一体化，发展一种微型 化、一体化的超微电极，并对二电极系统的电化学行为进行了研究，该一体化的 超微电极具有操作简单，灵活，易用于细小生物体如活细胞的检测等优势。结合 纳米a u 一壳聚糖复合材料的优势，进一步在超微电极表面形成纳米a u 活性界面的 方法，用于探究纳米a u 和壳聚糖复合材料界面与蛋白质问的直接电子传递。结果 表明：通过固定生物材料的纳米a u 层界面，可实现细胞色素c 与体化的超微电 极间的直接电子传递。 关键词：碳纤维超微电极；电化学生物传感器；纳米a u ；直接电子传递 l i 碳纤维超微电极直接电化学及其应用研究 a b s t r a c t e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sc o m b i n i n gt h es p e c i f i cr e c o g n i t i o no fb i o m a t e “a l s w i t ht h em a g n i f i c a t i o nf u n c t i o no fe l e c t r o c h e m i c a ld e t e r m i n a t i o nh a v et h ea d v a n t a g e s o fh i g h s e n s i t i v i t y ，n i c e - s e l e c t i v i t ya sw e na se a s ym i n i a t u r i z a t i o na n da u t o m a t i o n t h e yc a nb ea p p l i e dt oaw i d er a n g eo fa n a l y t i c a lt a s k s ，s u c ha sc l i n i c a ld i a g n o s i s ， b i o a s s a y ，e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n ga n di n d u s t r i a la n a l y s i s t h eu l t r a m i c r o e l e c t r o d e p o s s e s s e sm a n ya d v a n t a g e s ，s u c ha sr a p i dd i f 如s i n gs p e e d ，h i g he l e c t r i c a l c u r r e n t d e n s i t y ，h i g hs i g n a l - t o n o i s e ， a c c o r d i n g l y ， i tc a nh e l pt o i m p r o v et h ed e t e c t i o n s e n s i t i v i t y s ot h eu l t r a m i c r o e l e c t r o d eh a v eb e c o m eap o w e r f u lm e a s u r e m e n tt o o lt o r e s e a r c ht h ed i r e c te l e c t r o nt r a n s f e ro ft h eb i gb i o l o g i c a lm o l e c u l e ( e n z y m e t h i s r e s e a r c hi sa i m e dt od e v e l o pt h ed i r e c te l e c t f o c h e m i s t r yb e h a v i o ro fr e d o xp r o t e i n so n t h ec a r b o nf i b e ru l t r 锄i c r o e l e c t r o d e( c f u m e ) ，t oa c c e l e r a t et h ed i r e c te l e c t r “n t r a n s f e fo ft h er e d o xp r o t e i n sb ym o d i f y i n gam e d i a t o rl a y e ro ni t ss u r f a c e ，a n dt o i m p r o v et h es e l e c t i v i t yo ft h ee l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n t h ed e t a i l e dm a t e r i 8 l sa r e s u m m a “z e da 3f o l l o w i n g ： 1 c o n s i d e r i n gt h ee x c e l l e n te l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r t i e so fu l t r a m i c r o e l e c t r o d ea n d t h ee x c e l l e n tf i l m - f b r m i n ga b i l i t ya n da d h e s i o np r o p e r t i e so fc h i t o s a n ，t h ep l e n t y a m o u n t so fa m i n og r o u p so fc h i t o s a n 五l mo nt h ee l e c t r o d es u r f a c e sf a c i i i t a t e dt h e i m m o b i l i z a t i o no fh o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e v f 日 g l u t a r a l d e h y d e c o v a l e n t l i n k a g e e m p l o y i n gp tn a n o p a r t i c l e sa sa ne l e c t r o nt r a n s f e ra c c e l e r a n t ，am e d i a t o r l e s sh 2 0 2 m i n i a t u r i z e db i o s e n s o rw a sf a b r i c a t e d ，i nt h ea b s e n c eo fm e d i a t o r ，ah i g hs e n s i t i v i t y a n ds e l e c t i v i t yo fb i o s e n s o rc a nb ee f f c c t i v e l yo b t a i n e d t h e1 i n e a rr a n g eo fd e t e c t i o n i s6 4 x 1 0 3 6 1 0 。3 m t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eu l t r a m i c r o e i e c t r o d ei sf a v o r a b l e t or e s e a r c ht h ed i r e c te l e c t r o nt r a n s f e ro fr e d o xp r o t e i n s ( e n z y m e s ) 2 n a n oa ua n dc h i t o a nn a n o c o m p o s i t ew a ss y n t h e s i z e db yi n t e r c a l a t i n gn a n oa u i n t oc h i t o s a nl a y e r st oo b t a i nas t a b i l i t yn a n oa u1 a y e ro nt h ee l e c t r o d e ss u r f a c e i t s s t r u c t u r ea n de l e c t r o c h e m i c a lc h a 豫c t e r i s t i c sw e r es t u d i e d ，a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a t n a n oa ua n dc h i t o a nn a n o c o m p o s “ep o s s e s s e se x c e l l e n ta b i l i t yo fe l e c t r o nt r a n s f e r h e m 0 9 1 0 b i nw a sa b s o r b e do nt h en a n o a ua n dc h i t o a nn a n o c o m p o s i t el a y e ro ft h e c f u m es u r f a c ev f 口t h es t r o n ge l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o no fn a n oa u ，a n dam e d i a t o r l e s s b i o s e n s o r 、a st h e no t a i n e d ，t h er e s u l ti n d i e a t e dt h a tt h en a n oa um o n o i a y e ri sa n a p p r o p r i a t ei n t e r f a c ef o re l e c t r o nt r a n s f e r i nt h ea b s e n c eo fm e d i a t o r ，t h ea c t i v i t ya n d i i l s t a b i l i t yo fh e m o g l o b i no nt h es u r f h c eo fb i o s e n s o rc o u l db ee f r e c t i v e l yr e t a i n e d t h e l i n e a rr a n g eo fd e t e c t i o nf b rh 2 0 2i s8 5 1 0 6 4 4 0 1 0 。ma n dt h el i n e a rr a n g eo f d e t e c t i o nf o rn 0 2 i so 2 5 1 0 2 8 0 x l o 。om 3 t bp r e p a r et h em i n i a t u r i z e da n di n t e g r a t i v ee l e c t r o d eo ft h ew o r k i n ge l e c t r o d ea n d t h er e f e r e n c ee l e c t r o d e ，t h er e f e r e n c ee l e c t r o d ew a sm i n i a t u r i z e dt of o r mt h e m i n i a t u r i z e ds y s t e m t h ei n t e g r a t i v eu l t r a m i c r o e l e c t r o d ep o s s e s s e st h ea d v a n t a g e so f a g i l i t ya n ds i m p l e n e s s ，a n di ti sp r o n et od e t e c tt h em i c r o o r g a n i s ms u c ha sa c t i v ec e l l s m a k i n gu s eo ft h ea d v a n t a g eo ft h ec f u m ea n dt h eu n i q u ep r o p e r t i e so fn a n oa ua n d c h i t o a n n a n o c o m p o s i t e ， t 1 1 ee l c c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro f c y t o c h r o m e cw a s i n v e s t i g a t e di nd e t a i l t h er e s u l t sw e l ld e m o s t r a t e dt h ed i r e c te l e c t r o nt r a n s f c tb e t w e e n t h ec y t o c h r o m eca n dt h em i n i a t u r i z e da n di n t e g r a t i v eu l t r a m i c r o e l e c t r o d e k e y w o r d s ：c a r b o nf i b e ru l t r a m i c r o e l e c t r o d e ；e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r ；n a n o a u ； d i r e c te l e c t r o nt r a n s f e r 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者徘儆引毯 嗍沙c 年月，日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：硼引i 诅日期：伽6 导师签名j 熟日期：g 日日 夕、 月月 譬 年年 硕士学位论文 第1 章绪言 超微电极测试技术是2 0 世纪7 0 年代末发展起来的电化学和电分析化学的前沿 领域，作为一种重要的测试技术，在许多方面的应用中显示了其优越性，为人们 对物质的微观特性进行探索提供了一种有力的手段。超微电极是指电极的一维尺 寸为微米级( 1 0 4 m ) 至纳米( 1 0 m ) 级的一类电极【j 】。当电极的一维尺寸从毫米级降 低至微米级时，在理论上比常规电极更适用于电化学反应过程中的热力学和动力 学研究，表现出许多不同于常规电极的优良的电化学特性：超微电极固有的很小 的r c 时间常数使之可以用来对快速、暂态电化学反应进行研究，超徽电极上小的 极化电流降低了体系的i r 降，使之可以用于高电阻的体系中，包括低支持电解质 浓度甚至无支持电解质溶液、气相体系、半固态和全固态体系；超微电极上的物 质扩散极快，可以用稳态伏安法测定快速异相速率常数；同时，超微电极小的尺 寸确保在实验过程中不会改变或破坏被测物体，使超微电极可以应用于生物活体 检测【2 】。随着纳米技术、微机械加工技术和材料科学的发展，推动了超微电极技术 的发展。 酶传感器是生物传感器领域中研究最多、且最灵敏的种类型。1 9 6 2 年，c l a r k 和l y o n s 提出将酶与电极结合的设想，他们将酶溶液夹在两层透析膜之间形成一 层薄的液层，再紧贴在p h 电极、氧电极和电导电极上，用于监测液层中的反应【3 】； 1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c h s 采用当时最新方法，将葡萄糖氧化酶固定在氧电极表面， 研制出世界上第一支葡萄糖传感器【4 】。此后，随着生物、化学、物理学、医学、电 子技术等相关学科的迅速发展，酶传感器的研究也取得了很大的进步，成为国际 上广泛研究的重要课题。 1 1 超微电极 1 1 1 超微电极的基本原理与特点 超微电极的电解过程与常规电极的电解过程在本质上是相同的。当电极体系 发生氧化还原反应时，电极表面产生浓度梯度，形成去极剂从溶液本体朝着电极 表面的扩散传质作用。以超微圆盘电极为例，垂直于电极表面方向的扩散称为线 性扩散，沿着半径方向的扩散称为非线性扩散或径向扩散，对于超微电极，非线 性扩散起主导作用。超微园盘电极的扩散传质速率m 可以公式( 1 1 ) 【5 】表示： m = 4 d ，兀r ( 1 1 ) d 为扩散系数，r 为电极半径，r 越小，扩散速率越快。超微电极电流的扩散传 质速率很高，以至于在常规电极上某些可逆的过程，在超微电极上会变得不可逆， 碳纤维超徽电极直接电化学及其应用研究 这就可以在无需借助暂态技术的情况下对快速化学过程和伴随化学反应进行研究 【。 在常规电极体系中，通常情况下电化学反应中的物质扩散接近于半无限的平 面扩散。随着电极尺寸的减小，物质的扩散变得与电极的大小和几何形状有关。 在电流电势图中体现为：常规电极上呈现经典的循环伏安图，而超微电极上则呈 现稳态的电流一电势曲线，类似于经典的极谱图和旋转电极电流电势曲线。这种改 变是由于物质盼扩散由在常规电极上的一维扩散转变为在超微电极上的多维扩 散。在超微电极体系中，除了存在平常的轴向扩散外，平行于电极表面的径向扩 散也起着重要的作用。超微电极上的扩散传质速率与其几何尺寸成反比，尺寸越 小，扩散传质速率越大。以超微圆盘电极为伊j ，半径为1 0 肚m 时，其扩散传质速率 与转速为4 5 转s 的旋转环盘电极相当，而当半径为1 岬时，其扩散传质速率则与转 速为4 5 0 0 转，s 的旋转环盘电极相当。由此可见，超微电极比常规电极有着更大的扩 散传质速率，从而超微电极可获得比常规电极更大的电流密度【2 1 。 由于微电极具有非常小的电极尺寸( 微米级) ，因此具有常规电极所没有的电极特 性： ( 1 ) 双层电容小，微电极的时间常数可低于1p s ，因此微电极能够快速响应【6 1 。 ( 2 ) 极化电流小，微电极上的极化电流一般在1 0 母数量级，甚至可达 0 0 2 ，因此欧 姆压降小。 ( 3 ) 高传质速度，微电极半径小于自然对流的扩散层厚度，微盘和微带电极表面 液传质存在“边缘效应”，其传质速度远大于常规电极，能迅速达到稳态，因此可 用于快速电极过程的研究。 ( 4 高信噪比，微电极上的峰电流i p 与电极半径的倒数1 r 呈一定的线性关系，丽 充电电流密度i c 只与扫速呈正比，与电极半径无关，因此电极半径减小时，电极的 信躁( i p i c ) 比增大【”。 1 1 2 超微电极的制作方法 常见的超微电极的制作方法有如下几种方法【8 】： 一、纳米压印起离法 1 9 9 5 年，s t e p h e n 等f 9 j 运用纳米压印方法制得单元直径为2 5n m 的t i a u 金属点 阵列，使得用压印法制备纳米微电极成为可能。纳米压印起离法是将阴模压印在 热塑性聚合物膜上，该热塑性聚合物膜放在基底上，然后将温度升高，使其高于 热塑性聚合物膜的玻璃化转变温度。纳米压印过程结束后，拿走阴模，再用0 2 活 性分子刻蚀法进行刻蚀，以确保压印处没有聚合物残留。然后在该表面上蒸镀上 一层金属，这样在压印处和未压印处均有金属，再将其浸泡在丙酮里，起离除去 聚合物上的金属，就可制得纳米阵列电极，用该方法制得的组台电极的单元特征 硕士学位论文 尺寸可小至1 0n m 【1 0 】。 二、等离子轰击法 张学记等用等离子轰击法已成功制得电极尖端直径为纳米级的碳纤维电极【l 0 】 和金电极【1 1 1 。具体操作为取金丝置于等离子轰击仪中，根据需要，控制各种参数 制得所需尺寸的金丝，将未轰击的一端与导线相连，然后在显微操作系统中将其 穿入已拉制好的玻璃毛细管中，用微操纵器控制外露部分的金丝尺寸，然后将轰 击的一端用快速环氧胶固定，在真空中封熔电极尖端。电极的尺寸可以控制，最 小尖端直径可达3 0n m 。 三、刻蚀一涂层法 该方法一般采用两步来制备纳米微电极：首先，将金属丝用电化学【1 2 1 3 1 或火 焰烧蚀法1 1 4 垓0 蚀成锐利的尖；然后涂上一层绝缘物( 玻璃或聚合物) ，通过升高温 度使绝缘层收缩、固化，恰好将金属丝的最尖端露出来。通过一两次重复的涂层 和固化操作控制金属丝尖端的活化面积，进而得到预期的电极尺寸。目前，已由 该法成功制得尖端直径为铂铱合金电极13 1 、碳纤维电极【14 1 、纳米级的铂电极”】 等，该类电极可用于微小体系的分析检测。 四、模板法 模板法是以一些具有特定纳米结构的物质作为模板，通过对这些物质的结构 进行复制和转录，从而获得具有特定纳米结构材料的方法。然后，对获得的纳米 结构材料进行处理进而可以制得纳米微电极。模板法通常又分为电沉积法【l6 】和化 学镀( 非电镀) 法l ”。引，即分别采用电沉积法和化学镀的方法在模板上获得特定纳米 结构材料。c r m a r t i n 等f 1 在这方面做了大量的开拓性的工作，他们曾分别采用 电化学沉积法和化学镀法在聚碳酸酯模板上制备半径为纳米级的铂、金纳米盘阵 列电极，并对其进行电化学表征，研究表明，用该电极得到的电化学响应与已建 立的电化学理论相一致。 1 1 3 超微电极的应用 按电极的制作材料，超微电极分为：超微铂电极、超微金电极、超微银电极、 超微钨电极以及超微碳纤维电极。 按电极的形状，超微电极可分为超微以下几种类型：超微圆盘电极、超微圆 环电极、超微圆柱电极、超微球形电极、超微半扁球电极、超微带状电极、超微 阵列电极及超微叉指形电极。 超微电极在许多方面应用有着巨大的潜力， 分子分析、固体电化学、化学动力学参数测定、 一、超微电极用于生物细胞分析 细胞是有机体结构与生命活动的基本单位， 如超微电极在生物细胞分析、单 分析化学中的应用1 】： 具有多种维持细胞生物活性的电 碳纤维超微电极直接电化学及其应用研究 化学活性物质。细胞的体积极小，所要测定的物质又是微量的，细胞内的生化反 应时间是毫秒级，所以细胞分析技术需满足样品体积小、高选择性、高灵敏度、 响应速度快等要求，超微电极是满足这些测试要求的最理想的方法。超微电极可 以置于细胞周围环境也可以插入细胞内部，在基本不损伤细胞又不影响细胞生理 功能的情况下实时定量地监测单个细胞内的电活性物质及其变化。e w i n 2 等【1 9 】于 1 9 9 0 年使用毛细管电泳和碳纤维电极首次对单个神经细胞中多巴胺及5 2 羟酪胺进 行了活体分析，并对池塘蜗牛的单个脑神经细胞中的多巴胺进行了研究。何立铭f 2 0 1 等用5 7 肛m 的碳纤维超微电极记录单个突触小泡的量子化递质释放。 w r i g h t m a n 等【2 】使用了刻蚀的碳纤维超微电极和密封在玻璃管中的碳纤维超 微电极对牛肾上腺细胞中儿茶酚胺分泌物进行检测。当牛肾上腺细胞暴露于l o o 肛m 的尼古丁中时，细胞中的囊泡与细胞壁发生融合，并通过挤压把囊泡中的儿茶 酚胺排出细胞外，此时将超微电极置于距细胞壁数微米处，即可通过电流响应检 测到细胞所分泌的儿茶酚胺。 此外，超微电极还可用于细胞光合作用、呼吸作用研究。m a t s u e l 2 2 。2 4 1 研究组 在这方面作了很多研究。 二、超微电极用于单分子分析 b a r d 等【”】运用直径非常小的圆锥状的p t 超微电极( 半径为3 0n m ) 作为s e c m 的探针，穿透一层含有毗啶钌的n a f i o n 薄膜，得到了膜内电极反应的标准电位和动 力学参数。实验中超微电极上电势为o 8 v ( 此时吡啶钌的氧化受扩散控制，基底i t 0 电势为o 2v ( 此时吡啶钌的氧化产物到达基底后可被迅速还原) 。y a s u k a w a 等( 2 6 】 使用1 9 | i m 的超微p t 圆盘电极作为s e c m 的探针，通过测量活体细胞s w 2 4 8 0 周围氧 的还原电流来测定活体细胞的呼吸活性。实验表明，k c n 的加入抑制了细胞对氧 的消耗，通过s e c m 的半定量分析，氰基离子对s w 2 4 8 0 细胞膜的渗透速率大约为 1 0 。7 c m s 。 三、固体电化学中的应用 近十几年来，由于聚合物电解质在制备高能密度全固态电池、光电化学器件、 电化学半导体、气体传感器等方面有着重要的应用前景，聚合物电解质中的电化 学研究成为一个新的热点。但由于聚合物溶剂与常规液体溶剂存在着较大的差别， 聚合物溶剂的粘度较大，通常为固态或半固态，物质的传输阻力较在常规溶剂中 要大许多，所得到的电流较小；而且由于聚电解质的电阻较一般溶液要大几个数 量级，所以实验中体系的i r 降很大。这些不利因素用常规的电化学手段难以克服。 近来发展的超微电极技术正好能解决以上两个问题，由于流过超微电极的电流小， 所以受未补偿电阻的影响较小，可用于各种电导率较低的体系中，所以，超微电 极是研究聚合物电解质中电化学行为的最合适的手段。m u r r a y 等2 8 】用刻蚀技 术把3 支电极组装在一起制成微电解池，中工作电极为1 0 儿m 的铂超微电极。实验 硕士学位论文 中聚合物电解质制成膜覆盖在电极上，研究在固态膜中电活性物质的扩散行为和 电子自交换反应动力学。董绍俊【”】小组运用超微电极对聚合物电解质中的电化学 进行了研究，用铂超微电极测定了二茂铁在聚合物电解质中的动力学参数，并讨 论了各种因素对动力学参数的影响。 四、化学动力学参数的测定 超微电极的欧姆压降和电解池时间常数很小，有利于获得快速反应、中间体 反应的动力学信息。超微电极常用于快速电子转移、电子转移中的化合偶联、扩 散系数的测定等领域。宋永红【3 0 】等采用微电极伏安技术，研究异丙醇在p t 微盘电 极( r = 1 0 m ) 上氧化的稳态和暂态的电化学行为，得出一系列重要的动力学参数， 由计算结果可以推测，异丙醇在p t 微盘电极上酸性水溶液体系中的氧化过程由稳 态传质扩散及电化学极化联合控制。k a o r u 等p l j 用循环伏安法、计时电流法和阻 抗光谱扫描电化学方法研究“离子引出及插入单个l i m n 2 0 。粒子微电极的动力 学过程，测得l i 离子在电极的微粒上的最大迁移电阻和表观扩散系数。 五、分析化学中的其他应用 超微电极的各种特性都可体现出它在分析化学中的优势，在分析化学领域被 广泛应用。对于尺寸很小的超微电极来说，对流和流体力学的影响几乎可以忽略 不计，这就使得超微电极在流动体系如流动注射分析、色谱检测中具有无可比拟 的优势p ”。超微电极较小的r c 时间常数导致充电电流快速衰减，使得超微电极 特别适合于一些化学分析中经常使用的常规脉冲伏安法如差分脉冲伏安法、方波 伏安法等。例如阵列超微电极和方波伏安法结合可以检测人体血液中的微量铅， 线性范围1 2 3 0 0 g 见m j 。对于超微电极，体系造成的i r 降对电流响应的影响很 小，被测体系中可以不加额外的支持电解质，被测样品不须过多的预处理，甚至 可以在被测样品未经处理的情况下，直接用超微电极进行测定，这就为样品的现 场检测带来极大的便利p ”。 1 2 氧化还原蛋白质的直接电化学 氧化还原蛋白质在电极上的直接电化学研究具有重要意义。一方面它为理解 生物电化学和生物代谢过程提供有价值的信息，另一方面，利用电极探讨氧化还 原蛋白质与底物分子之间的电子传递过程，为制备生物传感器提供实验基础【3 引。 但迄今为止，只观察到极少数氧化还原蛋白质可在裸固体电极上表现出电化学活 性【3 。这主要是由于多数蛋白质的电活性基团被深埋在其多肽链的内部，与电极 表面距离较远，很难与电极表面直接交换电子：蛋白质在电极表面的取向往往不 利于其电活性基团与电极之间的电子交换：某些杂质在电极表面上的吸附或蛋白 质本身的吸附变性可能阻碍它们与电极间的直接电子转移。为此，蛋白质的电化 学研究常常不得不借助于某些具有电化学活性的媒介体来实现蛋白质与电极之问 ：=：=：一：墼譬墼塑些璧塞!些兰垒董堡里堑垒：一：=：一=间接的电化学反应【”】。 在早期，人们普遍认为氧化还原蛋白与电极之间进行直接准可逆或可逆的电 子传递是不可能的，然而蛋白质的准可逆直接电化学却在1 9 7 7 年首次得到实现， e d d o w e s 和h i l l 口引用将4 ，4 联吡啶作为促进实现了细胞色素c 在金电极上的准可 逆直接电化学。 普通氧化还原蛋白质的直接电化学的发展，促使人们进一步去探讨酶的直接 电化学。酶作为一类典型的的生物大分子和特殊的催化剂，在生命过程中扮演着 极其重要的角色。尤其是在呼吸链中生物氧化和新陈代谢是靠多种酶的共同作用 才完成的，研究酶的直接电化学无论在理论上还是在实用上都具有重要的意义。 在理论上，酶与电极之间直接电子传递过程更接近生物氧化还原系统的原始模型。 这就为提示生物氧化还原过程的机理奠定了基础。从应用而言，酶直接电化学的 实现可用于研制第三代生物传感器和发展人工心脏用的生物燃料电池。 普通氧化还原蛋白相比，酶的分子量大，分子结构复杂，酶的电活性中心往 往紧紧地被酶蛋白本体所封闭( 或绝缘) ，使其不易暴露难于接近电极表面，因此实 现酶与电极之间直接电子传递要比普通氧化还原蛋白如细胞色素c 困难得多。归纳 起来有四种方法获得一些酶的直接电化学f 3 9 】。 l 、使用电子转移促进剂 促进剂与媒介体不同，它们在所研究的电位窗内无电活性，往溶液中加入特 定的电子转移促进剂，可使少数酶和电极之间的直接电子转移成为可能。 a m s t r o n g 等【4 0 l 首次发现氨基苷类化合物( 包括庆大霉素和新霉索) 能促进细胞色 素c 过氧化物酶( c c p ) 直接电催化比0 2 还原。h i l l 研究小组【4 l 】较全面地探讨了对甲 酚甲基羟化酶( p c m h ) 在热解石墨电极和化学修饰金电极上的直接电化学行为。促 进机理被认为是促进剂通过与酶的静电作用和通过形成氢键将电极表面与酶的氧 化还原各心连接起来，从而使直接电子交换成为可能。可见，促进剂在电子传递 过程中起着桥梁作用。 2 、酶吸附在电极表面的直接电化学 b o c k r i s 等【4 2 j 详细探讨了g o d 吸附在金电极和光谱纯石墨电极表面直接电化 学行为及变性机理。他们用椭圆光度法现场观察了g o d 分子在金电极表面的吸附 过程。发现g o d 分子一开始以两特别是在方式同时吸附到电极表面，即卧式和立 式，然后，随着吸附量的增加，立式定位的g o d 分子因不稳定转变为卧式。这样， 吸附态的酶分子在构象上发生了很大的变化，甚至变为舒展未折叠结构，从而失 去生物催化活性。相应的直接电化学行为，由两电子重叠过程这这单电子反应过 程。在光谱纯石墨电极表面也观察到类似的行为。 3 、酶固定在导电聚合物膜内的直接电化学 a i z a w a 等【4 3 l 曾报道了通过电化学方法将g o d 包理在聚吡咯内，可使酶保持 硕士学位论文 其活性并与电极进行可逆的电子交换。聚吡咯微管的研制成功【4 4 4 5 l 为防止酶失活 发挥了重要。k o o p a l 等【4 6 】首先将聚吡咯微管用于固定化g o d 研制出第三代葡萄 糖生物传感器。g o d 在微管内保持应有的生物活性，可直接电催化葡萄糖氧化。 4 、模拟生物膜修饰电极 模拟生物膜为氧化还原蛋自质在电极上的直接电子转移提供了一个更适宜的 微环境。在此微环境中，许多蛋白质与固体电极之间的电子转移均被大大加速， 获得了良好的、可逆的电化学响应1 4 ”。 蛋白质在模拟生物膜这样一种微环境中的电极过程，很可能更接近于其在生 命体内的电子转移过程。这就有可能使本来在裸电极上难以实现的蛋白质的直接 电子转移在模拟生物膜修饰电极上得以实现。因此，氧化还原蛋白质在模拟生物 膜电极上的直接电化学研究，将为研究蛋白质在真实生命体系中的电子传递提供 一种模型，对于认识生命体内的电子转移机制和酶的催化机理以及某些重要生命 物质在生命体内的代谢过程都有重要意义，同时也为生物传感器的制备提供了一 种新思路。模拟生物膜电极可望用于酶的直接电化学研究，为第三代酶传感器【4 8 1 的研制和开发提供了一种新的思路。 近年来，氧化还原蛋白质和酶的直接电化学研究得到了迅速的发展，这些研 究对于了解生命体内的能量转换和物质代谢，了解生物分子的结构和物理性质， 探索其在生物体内的生理作用及作用机制，开发新型的生物传感器均有重要的意 义。但由于蛋白质和酶在金属电极上的氧化还原通常是不可逆的，且浓度很低， 用常规电极难以有效地进行研究。为了克服这一问题，人们提出用超微修饰电极 对生物分子进行研究。超微电极表面修饰一层媒介体，加速氧化还原蛋白质和酶 与电极间的电子转移，可提高测定的选择性；回时在超微修饰电极上扩散速度快， 电极表面电流密度高，测定的信噪比高，从而可提高测定的灵敏度。因此。超微 修饰电极已成为壹接研究生物大分子电化学的有力的手段。陈洪渊等在这一领域 傲了一系列的工作，例如在l 半胱氨酸微银修饰电极上进行了血红蛋自的电化学 行为研究1 4 9 1 。实验结果表明，l 半胱氨酸微银修饰电极通过半胱氨酸与铁原子的 结合。加速血红蛋白和电极间的电子传递速率，从而促进血红蛋白的氧化还原反 应，在微银修饰电极上得到较好的电化学响应。 酶直接电化学和第三代生物传感器已成为生物电化学研究的最重要发展方向 之一。制备性能优越稳定可靠的第三代生物传感器，以满足生物医学，环境监测 和工业快速分析的需要，必将成为这个领域的发展趋势。 1 3 纳米材料在生物传感器中的应用 1 3 1 用纳米修饰层的催化作用构建化学生物传感器 将金属纳米粒子组装在基体电极表面，形成纳米超结构电极，制备电化学传感 碳纤维超微电极直接电化学及其应用研咒 装置，是非常有前途的传感器发展方向【50 1 。采用不同的方法，可以在电极表面形成 纳米修饰单层，或利用适当的交联物质在电极表面组装多层纳米颗粒，达到与特定 分析对象选择性相互作用的目的【5 1 1 ，在基体电极表面形成的单层或多层纳米粒子可 以看作表面可控制的纳米电极【5 2 】。形成的纳米修饰层具有优良的电催化活性，可以 明显减小分析组分的过电位，提高电化学传感测定的灵敏性和选择性，甚至某些在 普通电极上氧化还原不可逆的物质，在纳米修饰电极上成为氧化还原可逆物质。例 如，在a u 微电极表面，通过半胱胺自组装，在电极表面获得端- n h 2 ，再利用此_ n h 2 与纳米a u 强静电相互作用，在电极表面形成纳米a u 层，可有效地将抗坏血酸与 多巴胺的氧化峰分开，从而实现对多巴胺的选择性测定【53 】：类似的方法还构建了 c u ”、0 2 和s 0 2 等气体传感器【5 4 5 5 1 以及d n a 杂化传感器【56 】等。 1 _ 3 2 构建纳米活- 陛界面用于固定生物材料 采用适当的物理、化学方法，通过对换能器表面修饰后，获得纳米亲合基团， 再在其上形成纳米活性界面；也可以用特殊的交联试剂通过层层组装的方法将纳米 颗粒修饰到换能器表面，形成纳米活性界面。然后利用形成的纳米活性界面来固定 生物材料，制备生物传感器。j i a 等p7 j 通过3 一巯基丙基三甲氧基硅烷在金电极表面 自组装，在金电极表面获得含巯基的溶胶凝胶膜，再将纳米a u 结合到巯基上，最 后将h r p 固定到纳米a u 表面，由此固定的h r p 可以直接电化学测定h 2 0 2 ，构建 无需电子媒介的第三代h 2 0 2 生物传感器：c h e n 等人【5 8 】在a u 电极表面修饰一层半 胱胺，并共价结合戊二醛，通过戊二醛，再结合一层半胱胺，半胱胺的s h 端基用 于固定纳米a u ，于是，在金电极表面形成纳米a u 活性界面，用此活性界面固定 h r p ，制成h 2 0 2 传感器，研究结果表明：固定在纳米a u 上的h r p 活性得到有效 保持，对h 2 0 2 有很强的催化能力。纳米活性界面除了可以固定酶外，还可以固定 免疫试剂，构建免疫传感器，w a n g 等”刚利用半胱胺用交联剂将纳米a u 多层组装 在金电极表露，由于修饰了纳米层，使得电极面积增大、电极性能更好及对抗体具 有良好的吸附能力，可以对相应的抗原进行高灵敏度检测。 1 4 本研究工作的构思 在广泛查阅生物传感器相关最新文献报道的基础上，结合本实验室原有工作 基础，针对目前氧化还原蛋白质在电极上的直接电化学研究中的热点问题，即如 何发展简便、可靠的方法将酶稳定地、并保持其高活性固定到基体电极表面，制 备响应性能优良、使用寿命延长的新型电化学生物传感器，具体考虑从以下几方 面开展研究工作： f 1 1 研究表明：碳纤维有较大的强度和弹性模数，导电性好、耐温、耐磨、耐 烧蚀，而且不溶于一般溶剂、直径小，因而广泛用作制微电极的理想材料。超微 硕士学位论文 电极的具有优良的电化学特性。灵敏度高，响应速度快；高度的稳定性和较强的 抗干扰能力；运用碳纤维超微电极作为工作电极就是利用上述优点来发展传感器。 对于超微电极扩散传质速率很快，可以用在低支持电解质浓度甚至无支持电解质 溶液中。因为酶的活性中心是深埋在蛋白质内部的，氧化状态的酶从电极上直接 得到电子是非常困难的，人们一直以来都在致力于无媒介体传感器的研究。因此， 酶微电极结合了酶的生物选择性和微电极的优良特性，用于研究直接电子传递， 发展了一种新型的第三代生物传感器。 ( 2 ) 研究表明：很多纳米颗粒具有良好的生物相容性，可以有效保持生物材料 的活性；另一方面，表面效应是纳米颗粒最重要的效应之一，纳米颗粒的表面效 应使得其具有很高的表面吸附能力，是固定生物材料合适的媒介，同时纳米粒子 可与生物分子的某些特定基团定向结合，使固定的生物分子达到定向排列、取向 规则的目的，可望进一步提高固定生物材料的活性。因此，直接利用在传感换能 器表面形成的纳米活性界面固定生物材料，将具有固定稳定、高效地保持生物活 性等优点，是生物传感器敏感膜构建的有效方法，可望构建性能优良的新型电化 学生物传感器。本研究中拟选用纳米a u 为材料，通过化学修饰的方法获得纳米 a u 亲合电极表面，然后，通过纳米a u 与亲合基团的强相互作用，在电极表面形 成稳定的纳米a u 活性界面，用于酶的固定，研制基于纳米a u 活性界面固定酶的 直接电子传递的生物传感器。 ( 3 ) 研究表明：把工作电极、参比电极和辅助电极集成于一体，且体积小；具 有微电极的优点，且可操作性强；为进一步研究微型生物传感器上的酶及酶介体 的固定提供了新的可靠方法；制作方法简便，且基础电极易于更新；材料价格低 廉，为传感器的推广应用奠定了基础。超微修饰电极表面修饰一层媒介体，加速 氧化还原蛋自质和酶与电极问的电子转移，可提高测定的选择性；同时在超微修 饰电极上扩散速度快，电极表面电流密度高，测定的信噪比高，从而可提高测定 的灵敏度。因此，超微修饰电极已成为直接研究生物大分子电化学的有力的手段。 结合纳米a u 和微电极的优点，研究细胞色素c 的直接电子传递。 第2 章基于碳纤维超微电极沉积铂纳米颗粒的无电子 2 1 引言 媒介h 2 0 2 生物传感器的研究 利用酶催化反应的高度专一性与电化学信号检测的高灵敏度相结合的电化学 酶传感器在近二十多年中得至了迅速发展1 6 “6 3 j 。在电化学酶传感器的制造中，研 究新型酶固定技术，以保持酶的高生物活性及延长传感器的使用寿命一直是热门 研究课题。经典的酶固定方法主要包括共价和非共价( 包埋和吸附) 方法，然而， 传统的酶固定技术在酶固定稳定性、活性保持及传感器使用寿命等方面仍面l 临许 多挑战。h 2 0 2 是很多工业过程的原料或中闯产物，同肘也是生物体内许多氧化酶 反应的副产物，因