（光学工程专业论文）块菌、鹅膏菌、牛肝菌和红菇的红外光谱研究.pdf

摘要 摘要 近年来，人们加强了对蘑菇的各种深入研究，因为蘑菇除了提供丰富的高蛋 白、低脂肪营养外，还具有潜在的药用价值，在生物化学和分子生物学研究中也 有重要的应用价值。对蘑菇各种深入研究的基础是首先对其进行鉴别分类。本文 利用傅里叶变换红外光谱技术结合化学计量学方法对蘑菇进行分类鉴别研究。 利用傅里叶变换红外光谱研究了块菌科、鹅膏菌科、牛肝菌科和红菇科蘑菇 的子实体。f t i r 光谱特征表明蘑菇子实体的主要化学成分是蛋白质和碳水化合 物。利用f t i r 光谱的峰形特征和吸收强度比，可以区分不同属、种的蘑菇， 1 8 0 0 - 7 5 0 c m 1 区间有可能作为区分不同属、种蘑菇的特征区。 格纹鹅膏菌孢子的f t i r 光谱与子实体的f t i r 光谱有显著差异，主要表现 出了脂类物质和蛋白质的特征吸收谱峰。隐花青鹅膏菌子实体不同部位的f t i r 光谱有差异，表明化学组分在蘑菇子实体的不同部位有不同分布。此外，利用 f t i r 光谱可以区分不同产地的印度块菌。凹陷块菌和楚雄印度块菌变质前后 f t i r 光谱有明显的变化，主要体现在蛋白质几个特征峰吸收强度的变化上，f t i r 光谱的变化表明块菌样品变质后蛋白质的含量有所减少。 利用化学计量学方法( 主成分分析和系统聚类分析) 对4 种1 9 个鹅膏菌样 品原始光谱、一阶导数光谱和二阶导数光谱不同区间的数据进行分析。结果表明， 原始光谱9 5 0 7 5 0 c m 1 区间光谱数据的主成分分析结果最理想：在p c i - p c 2 的投 影显示中，1 7 个样品能够按照常规分类结果聚为4 类；系统聚类分析不能得到 理想的结果。 研究结果表明，傅里叶变换红外光谱提供了蘑菇组分的有关化学信息，利用 f t i r 技术结合化学计量学方法可以对野生蘑菇进行快速、无损的分类鉴别。 关键词：块菌，鹅膏菌，牛肝菌，红菇，傅里叶变换红外光谱，主成分分析。 。 系统聚类分析 云南师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t r e c e n t l yt h e r eh a sb e e ni n c r e a s eo fg e n e r a li n t e r e s ti nm a c m f u n g i ( m u s h r o o m s ) b e c a u s eo ft h ep o s s i b l em e d i c a la p p l i c a t i o na n dh i g hv a l u ei nb i o c h e m i c a la n d m o l e c u l a rb i o l o g y t h ef i r s ts t e po f a l lt h e s es t u d i o si st h ec l a s s i f i c a t i o no f m u s h r o o m s i nt h i s p a p e r , f o u r i e rt r a n s f o r m i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ( f r m ) c o m b i n i n gw i t h c h e m o m e t r i c sw a su s e dt oc l a s s i f ya n di d e n t i f yw i l dg r o w i n gm u s h r o o m s t h ef r u i t i n gb o d i e so ft u b e r a c e a e ，a m a n i t a c e a e ，b o l e t a c e a ea n dr u s s u l a c e a e m u s h r o o mw e r es t u d i e db yf t i rs p e c t r a t h ef e a t u r eo ff t i rs p e c t r ai n d i c a t e st h a t t h em a i nc o m p o s i t i o no fm u s h r o o mi sp r o t e i na n da ) 0 h y d _ r a t e s a c c o r d i n gt ot h e d i f f e r e n c e so f t h es p e c t r a lp e a k sa n da b s o r b a n c er a t i o s ，t h ed i f f e r e n tg e n u sa n ds p e c i e s o f m u s h r o o m sa r ei d e n t i f i e d n 他r e g i o nb e t w o e l l1 8 0 0a n d7 5 0 c m , 1c a l lb eu t i l i z e dt o d i s c r i m i n a t em u s h r o o m s 1 1 艟s p l e c 缸 u mo fs p o r eo f a m a n i t a f r i f i l l a r i as h o ws t r o n gb a n d sa t2 9 2 6 ，2 8 5 5a n d 1 7 4 7 c m 1 ，w h i c hw e r ea s s i g n e dt oa b s o r p t i o no fc h 2a s y m m e t r i c ，s y m m e t r i ca n d c - - - os t r e t c h i n gv i b r a t i o no ft h ec a r b o x y l i cg r o u p so fl i p i d s ，i n d i c a t i n gs p o r ec o n t a i n m o mo i l f t i rs p e c t r a ld i f f e r e n c e sa r eo b s e r v e da m o n gd i f f e r e n tp a r t so fa m a n i t a m a n g i n i a n a t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h ec h e m i c a lc o n s t i t u e n t sa r ev a r i o u si nd i f f e r e n t p a n so ff r u i t i n gb o d i 髂i ti sa l s of o u n d b eg r e a tc h a n g e sb d c w 嘲m o l d ya n dh e a l t h y t r u f f l e s ，w h i c ht h em a j o rd i f f e r e n c e sa l eo b s e r v e di nt h eb a n d so f a m i d eo f p r o t e i n i n a d d i t i o n , f t i rs p e c t r a ld i f f e r e n c e sa r eo b s e r v e da m o n gt u b e ri n d i c u mo fd i f f e r e n t p r o d u c i n ga r e a s p r i n c i p a le n m p o n e n ta n a l y s i s ( p c a ) a n dh i e r a r c h i c a lc l u s t e r i n ga n a l y s i s ( h c a 、 w e r eu s e dt oa n a l y s i sf o ro r i g i n a la n dd e r i v a t i v es p e c t r ai nd i f f e r e n ti n t e r v a lo f1 9 s a m p l e so f a m a n i t am u s h r o o m s ，w h i c hb e l o n gt o4s p e c i e s t h er e s u l t ss h o w t h a tt h e e f f e c to fp c i p c 2p r o j c c t o nd i s c f i m i n a t o nb a s e do no r i g i n a ls p e c t r ai nt h ei n t e r v a l o f 9 5 0 - 7 5 0 c m 1i s b e t t e r t h a n o t h e r i n t e r v a l s a c c o r d i n g t o t h e p r o j e c t i o n o f p c i - p c 2 ， 1 7s a m p l e sw e r ec l u s t e r e dt o4c l a s s e s i nc o n c l u s i o n , i ti ss h o w e dt h a tt h ef o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y c o m b i n i n gw i t hp c ai s v a l u a b l et o o lf o rr a p i da n dn o n d e s t r u c t i v ea n a l y s i so f m u s h r o o m s k e y w o r d s ：t r u c e s ，a m a n i t a ，b o l e t u s , r u s s u l a ，f t i kp c a , h c a ：i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进 行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标 明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发 表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：褓墀 洲年r 月妒日f 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文 的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论 文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权云 南师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存和汇编本学位论文。 学位论文作者签名：多赡珲 删年嵋1 3 指导教师签名：1 冈7 五耐年、f 月伽日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 大型真菌分类学的研究现状 蘑菇属于大型真菌，无论是在生态系统，还是在社会生活中都扮演着重要的 角色。一些蘑菇是营养价值极高的美味食品，可以提供丰富的高蛋白、低脂肪营 养物质，此外，蘑菇富含的各类多糖物质还具有提高人体免疫能力和抗肿瘤的功 能，具有较高的药用价值【l - i o 】。因此，近年来对蘑菇的研究兴趣增加了，一方面 加强了对野生蘑菇的驯化栽培技术研究，另一方面对野生蘑菇的食、药用价值、 药理活性成分进行深入研究。而开展各种研究的基础是首先对蘑菇进行鉴别分 类。 蘑菇的鉴别分类无论对学科建设、还是对蘑菇的迸一步研究和开发利用都具 有重要意义。传统的蘑菇分类鉴别方法是建立在蘑菇子实体的外观形貌、孢子的 显微形貌、生长特性等分类特征基础上的，这类方法既需要丰富的经验，又耗时 费力，而且缺乏样品的化学信息。更重要的是，蘑菇的形态特征复杂，少数形态 特征和生理生化指标会随环境的变化而变化，从而可能导致不能正确地鉴别蘑菇 1 1 - 1 3 。 近年来，随着生物化学、遗传学以及分子生物学等相关学科的发展，在蘑菇 的现代分类学中引入了分子生物学技术鉴定方法【1 3 1 。如d n a 碱基组成、限制性 片段长度多态性( r f l p ) 、随机扩增多态性d n a ( r a p d ) 、s o u t h c m 印迹分析、 脉冲电场凝胶电泳( p f ( 昆) 以及小亚基r d n a ( 或r r n a ) 序列测定等方法已广 泛地应用于蘑菇的界级分类、系统发育以及疑难种的鉴定。 l e o n a r d i 等 t 4 1 利用r r s 和r f l p 序列分析技术评估了美昧牛肝菌种问和种内变 异性，结果表明，分子生物学分析方法可以在种的水平上区分j b o l e t u se d u l i s 、丑 a e s t i v a l i s ，丑p i 粥砷i f 埘和b a e r e u ss p p ，并给出了它们之间的系统发生关系。李 泰辉等【1 5 ，1 q 从分子系统学角度出发，对鸡油菌属、喇叭菌属和钉菇属模式种的 2 5 s r d n a 部分序列进行了测定，并与另外1 0 目的1 3 个担子菌和1 个接合菌的2 5 s r d n a 序列进行比较分析，以接合菌总状毛霉为外类群构建出这些担子菌的部分 2 5 sr d n a 序列的系统树图，探讨它t n 3 属之间及它们与其他担子菌的关系及其系 云南师范大学硕士学位论文 统学上的意义。张引芳等【1 7 】采用单个、l o 碱基的随机引物p c r 扩增香菇的多态 性d n a 。结果表明r a p d 方法可用于鉴别香菇菌株间的差异，在食用菌遗传育种 研究中具有广泛的用途。龚利娟等【埔l 进一步对3 2 个中国栽培香菇品种和2 个野生 香菇子实体的遗传多样性进行了姗标记研究，结果显示3 4 个香菇菌株间均有 遗传上的差异，但遗传相关性极高，表明中国栽培菌株间的遗传背景单一。张瑞 颖等【9 1 则运用酯酶同工酶、r a p d 、i g s i 、i g s 2 四种方法鉴别2 个野生香菇菌株 和1 9 个栽培香菇菌株，并比较了这四种鉴别方法的分辨率，结果表明，四种鉴别 方法中r a p d 的分辨率最高，与这4 种鉴别方法的综合分析结果相同，指出r a p d 可以作为香菇菌株鉴别的可靠依据。 牛永春 2 0 i 对在真菌系统分类与鉴别研究中应用较多的d n a - d n a 杂交、 r a p d 、多聚酶链式反应技术和核酸测序等几种技术进行了简要评述。王彪等叫】 概述了核酸、蛋白质电泳技术以及与核酸电泳有关的r f l p 、r a p d 分析技术，回 顾和展望了上述生物技术在食用真菌学研究应用上的现状和前景。指出r a p d 技 术是一种快速、准确评估食用蘑菇种质资源的有效方法，己广泛地应用于食用蘑 菇遗传育种、种性鉴定、种内及种间遗传多样性分析等。蒋盛岩等吲综述了真菌 的分子生物学鉴定方法，包括d n a 碱基组成分析、核酸分析技术和真菌核型的 脉冲电泳分析，指出应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明真菌种群之间和种 间内在的分类学关系是目前真菌分类学研究的热点。从过去依赖形态和生理生化 等表型特征描述逐渐引入分子生物学鉴定方法，按其亲缘关系和客观的反映系 统发育的规律对真菌进行自然分类，达到人们追求已久的自然分类目的，无疑是 真菌分类学发展过程中的重要转折。 然而，尽管这些分子生物学方法特异性高，准确可靠，但需要对样品作分离 提纯，分离成本高，操作技术复杂，一般的实验室没有这样的条件。常规的化学 成分分析需要对样品进行分离提取 2 3 。2 5 l ，而各种化学提取技术总会改变样品的化 学结构和组成。因此，在不改变样品化学结构的前提下，预先获取样品的有关化 学信息从而为制定合适的提取方案提供必要的参考就显得十分必要，同时也可根 据得到的化学信息对样品进行鉴别分类。 1 2 傅里叶变换红外光谱在大型真菌研究方面的应用 第一章绪论 傅里叶变换红外光谱( f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ) 测量分子官能 团的振动模式，反映的是分子的精细结构振转结构，具有指纹特性，能够提 供分子的化学结构信息。f t i r 技术结合化学计量学方法，可以对样品进行定性 和定量分析 2 6 2 7 。目前，傅里叶变换红外光谱技术已经成为探测生物组织中大分 子结构及相互作用的有力手段【2 8 - 4 2 。n a u m a n n 等【4 3 1 就指出f t i r 技术可以在亚种 水平上对微生物进行区分、鉴别和分类。傅里叶变换红外光谱技术已广泛地应用 于各种微生物的分类鉴别研究1 4 4 制，特别是细菌、真菌的快速鉴别研究，然而已 报道的文献大多是对临床医学细菌、真菌的f t i r 光谱研究 4 s - 5 7 1 ，仅有少量的文 献报道了对部分蘑菇的振动光谱研究f f s - 6 6 1 。 m o h a 6 e k - g r o c v 【5 8 】等比较系统地研究了3 7 个属7 0 余种担子茵类和子囊菌类 野生菌草孢子和子实体的傅里叶变换红外光谱，发现傅里叶变换红外光谱技术可 以用来鉴别子囊菌和担子菌类蘑菇予实体不同部位所含葡聚糖的不同构型；不同 属的蘑菇在1 2 0 0 1 0 0 0 c m 1 区间内表现出不同的光谱特征；同属不同种蘑菇孢子 的光谱和同属不同种蘑菇不同部位相应的光谱没有明显差异；同种蘑菇不同部位 的光谱差异显著，表明蘑菇所含化学物质在不同部位分布有差异。 孙素琴等1 5 9 , 6 0 l 利用傅里叶变换红外光谱技术对药用真菌六色灵芝和3 6 种灵 芝产品作了快速无损鉴别，结果表明：白、黄、黑、青、赤和紫灵芝均有自己的 红外特征光谱，根据谱图吸收峰相对强度的差异可以达到灵芝类同的鉴别：灵芝、 孢子粉和菌丝体的红外谱图差别较显著；不同厂家所生产的灵芝产品由于所选用 灵芝的产地不同、所用辅料的种类以及所添加辅料的多少不同，均引起了谱图的 相对峰强度和波数位置的改变。 刘刚等【6 l - 6 5 研究了担子菌木耳目、非褶菌目和伞菌目六个科九个属的l o 种 食用菌子实体和部分伞菌类野生菌蕈不同部位的傅里叶变换红外光谱。指出根据 光谱峰值和吸收强度比可以鉴别不同的食用菌；9 5 0 7 0 0 c m “区间有可能作为区 分不同属蘑菇间的指纹区；蘑菇同一子实体不同部位的振动光谱各具特征，各个 部位中构型和b 构型葡聚糖的比例有差异；通过傅里叶变换红外光谱可以区分 蘑菇的不同部位，而通过不同部位的光谱又极有可能区分不同种类的蘑菇。 王宜祥等嘲利用f t i r 技术直接鉴定了冬虫夏草及其伪品古尼夏草，试验结 果表明，冬虫夏草和古尼夏草的子座上部表皮及横切面、子座底部表皮及横切面、 - 3 - 云南师范大学硕士学位论文 虫体腹部表皮、虫体背部表皮和虫体横切面的红外光谱均有很大差异，由此可以 鉴别冬虫夏草和古尼夏草及其碎片；红外光谱的不同反映出冬虫夏草及古尼夏草 化学成分的差异，吸收峰的强弱可以反映出含化学成分量的不同。 对部分蘑菇傅里叶变换红外光谱的研究表明，不同属、种的蘑菇，同种蘑菇 的不同部位，不同产地的同种蘑菇，由于化学成分的差异，其傅里叶变换红外光 谱特征有差异，可以利用这些特征来区分鉴别它们。 1 3 化学计量学在红外光谱分析方面的研究现状 化学计量学( c h c m o m c t r i c s ) 是将数学和计算机科学应用于化学的一门新兴 的交叉学科，它运用数学、统计学、计算机科学以及其他相关学科的理论与方法， 优化化学量测过程，并从化学量测数据中最大限度地获取有用的化学信息。随着 计算机技术的迅速普及，化学计量学的内容得到了充实和扩展，使其成为化学、 生物学、药学、环境科学和材料科学等学科中处理信息的强有力手段 6 7 ，6 s l 。各种 化学计量学方法，如主成分分析技术( p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s ) 、模式识别 技术( p a t t e r nr e c o g n i t i o n ) 等，已广泛应用于生物、医学、农业和食品科学领域 中的红外光谱分析。 p r a i s l e r _ 等1 6 9 , 7 0 l 建立了基于光谱特征主成分分析( p c a ) 和神经网络( n e u r a l n e t w o r k s ) 的专家系统，可以快速、准确地把安非他明类似体( a m p h e t a m i n e a n a l o g u e s ) 和非安非他明物质( n o n a m p h e t a m i n e s ) 区分开来：并且比较了以原 始光谱数据作为输入的纯神经网络( n n ) 和以主成分得分作为输入的神经网络 ( p c 小i n ) 对样品的区分鉴别效果，结果表明纯神经网络( n n ) 系统的准确率 达到了1 0 0 ，而在p c - n n 系统中，以前九个主成分得分作为输入的9 p c - n n 系统 最为灵敏，准确率为9 0 9 1 。 。 在国内，中药质量控制方面的研究一直是此类研究的重点。徐永群等t 7 1 ，7 2 1 借助黄芩的红外指纹图谱，采用主成分分析法对来自1 5 个产地的黄芩进行了聚类 分析，将其分为六个产区，这一分区结果与各产地的地理位置和气候条件有一定 的相关性，同一产区内黄芩的化学组分相似；采用三种模式的人工神经网络分析 栽培黄芩、野生黄芩和粘毛黄芩的红外图谱，从监督集识别结果来看，隐含层节 点数为3 的非线性线性人工神经网络的识别能力最强，其识别正确率可达9 7 。 第一章绪论 程存归等 7 3 - 7 6 采用主成分分析方法对蛇足石杉、紫丁地花、石斛属和香茶莱属等 中药材的红外光谱进行分析，结果表明，基于红外光谱的主成分分析在反映不同 样品植物化学组成差异程度上具有应用价值。孙素琴等【7 7 ，7 8 1 采用模式识别技术的 s i m c a ( s o f ti n d e p e n d e n tm o d e l i n go fc l a s sa n a l o g y 或s t a t i s t i c a l i s o l i n e a r m u l t i c a t e g o r ya n a l o g y ) 法对山药和枸杞的红外光谱进行聚类分析，结果表明， s i m c a 法可以对来自不同产地的山药和枸杞进行快速、准确的鉴别，为客观评 价中药材的来源提供了一种新的方法。汤彦丰等【嘲将傅里叶变换红外光谱法和人 工神经网络用于鉴别正品和非正品大黄样品，结果表明，在优化的条件下用该方 法对大黄样品的鉴别正确率达到9 8 ，为含大黄中药生产的质量控制提供了一种 可行的方案。 。 在食品分析方面，基于红外光谱和各种化学计量学的技术大量应用于葡萄 酒、果汁、牛奶、食用油脂、淀粉及蜂蜜的质量检测和生产过程控制。n i e u w o u d t 等哪利用主成分分析方法对3 2 9 种不同产地、不同酒精度和糖度、处于不同发酵 阶段的葡萄酒的红外光谱数据进行研究，取得了很有意义的结果，为葡萄酒生产 的质量检钡4 和控制提供了有力的技术手段。d u a r t e 掣8 1 】利用傅里叶变换红外光谱 技术和化学计量学方法预测芒果汁的蔗糖浓度，一阶导数光谱的偏最小二乘回归 ( p a r t i a l c a s ts q u a r e sr e g r e s s i o n ) 模型给出了理想的预测精度。e t z i o n 等i 明在主成 分分析的基础上，利用人工神经网络技术分析牛奶光谱中蛋白质的特征区，进而 预测牛奶中的蛋白质浓度，准确率达到9 9 8 。y a n g 等【8 3 】分别测试比较了1 0 种 食用油脂的f r i r 、f t - n i r 、f t - r a m a n 光谱，发现f t i r 结合c v a ( c a n o n i c a v a r i a t e a n a l y s i s ) 方法在食用油脂的鉴别分类中最为有效，鉴别准确率达到9 8 ，研究结 果表明傅里叶变换红外光谱结合化学计量学方法可以快速、方便地检测食用油 脂。d u p u y 等斟1 则利用此类方法区分鉴别不同种类的玉米淀粉。 人体肿瘤的中红外光谱法早期检测是生物医学领域的前沿课题之一。李庆波 等1 8 5 】研究了中红外f t i r 光谱技术与化学计量方法中的模式识别技术相结合对人 体恶性肿瘤进行检测的方法，并讨论了如何通过采用光谱预处理方法以及波长 范围的选择来提高模式识别技术中s i m c a 法分类判别的准确率。研究了6 3 个胃 癌病人的癌变组织和癌旁正常组织光谱，选择有代表性的4 0 个样品作为训练集， 剩余的2 3 个样品作为预测集，该方法的准确率为9 1 。这一研究结果表明傅里叶 云南师范大学硕士学位论文 变换红外光谱法与化学计量学方法相结合可以对良性、恶性组织进行鉴别诊断， 有希望发展成为一种肿瘤快速诊断的新方法。w o o d 等隅q 利用模式识别技术中的 系统聚类分析法( h i e r a r c h i c a lc l u s t e r i n ga n a l y s i s ) 分析研究了人体宫颈癌细胞的 显微红外光谱，建立了一种鉴别良、恶性肿瘤及不同病变时期组织的诊断方法， 为宫颈癌的临床诊断提供了一种方便快捷的补充技术手段。l i n 等伟7 1 分析了 1 5 0 0 - 8 0 0 c n f l 区间l i s t e r i am o n o c y t o g e t i e s ( 一种病原体) 的f t i r 光谱，结果表明 在不同菌株之间以及健康菌株和受损菌株之间存在着明显的光谱差异，而利用主 成分分析技术则可以对上述菌株做出清晰的聚类。 m a r i e y 等疆习在2 0 0 1 年系统地回顾了傅里叶变换红外光谱技术结合化学计量 学方法在各种微生物的鉴别分类方面的应用研究进展，列出了最近十余年来报道 的相关文献舱余篇，指出傅里叶变换红外光谱技术结合化学计量学方法已经成 为微生物研究领域的有力手段。 由此可以看出，傅里叶变换红外光谱技术结合化学计量学方法已经成功地应 用于药物化学、食品分析、临床医学、微生物等各个研究领域，为食品和药品质 量检测及生产过程控制、临床医学肿瘤病理诊断、各种微生物病菌的鉴定等提供 了一种快捷、简易的途径。 1 4 论文选题的目的和意义 尽管傅里叶变换红外光谱技术结合化学计量学方法已经在现代科学研究中 得到了广泛的应用。但是对于大型真菌( 蘑菇) ，这方面的研究仅有少量报道， 如b a s t e r t 等【黔】利用系统聚类分析技术区分鉴别节皮菌科( a r t h r o d e m a t a c e a e ) 癣 茵属( t r y c h o p h y t o n ) 和微孢菌属( m i c r o s p o u r m ) 三个种2 7 个蘑菇子实体，取 得了比较满意的聚类效果。 蘑菇种类繁多，其中既有块菌、鸡纵菌等美味营养的食用蘑菇，灵芝、冬虫 夏草、茯苓等具有药用价值和医疗保健作用的药用蘑菇，又有含致命毒素的毒簟， 它们都具有重要的经济价值和科学研究价值。新鲜蘑菇子实体中大约9 0 的是水 分，干物质的主要成分是蛋白质和多糖类碳水化合物，但各种蘑菇的成分含量及 组分的分子结构各不相同，傅里叶变换红外光谱技术可以探测这些异同，利用这 些异同，可以区分鉴别不同属、种的蘑菇和同种蘑菇的不同部位，并在不改变蘑 6 第一章绪论 菇化学结构的前提下获取其有关的化学信息。利用化学计量学方法的各种技术对 蘑菇f t i r 光谱特征指纹区的光谱数据进行分析，应该可以得到比较理想的分类、 鉴别结果。 因此，对大型真菌傅里叶变换红外光谱化学计量学的研究具有重要的应用价 值和开发前景，也有一定的创新性。本文利用傅里叶变换红外光谱技术结合化学 计量学方法来鉴别分类蘑菇，一方面为大型真菌的药用价值、药理活性成分的深 入研究提供必要的化学信息，另一方面也为蘑菇的常规分类和分子生物学分类方 法提供一种补充技术手段。 1 5 本论文研究的内容 本文结合云南丰富的野生菌蕈资源，用傅里叶变换红外光谱技术结合化学计 量学方法来区分、鉴别蘑菇，以期建立云南部分野生菌蕈的红外光谱图谱及特征 数据库，给出它们的化学信息，进而建立一种简便快捷的分类鉴别方法作为常规 分类方法的补充，为蘑菇的保健、药疗开发提供必要的参考。 主要研究内容如下： 1 ) 采集云南野生块菌科、鹅膏菌科、牛肝菌科、红菇科4 0 余个种的蘑菇， 测试并分析它们的傅里叶变换红外光谱，分析不同属、不同种蘑菇的傅里叶变换 红外光谱特征，根据光谱特征( 光谱峰位和吸收强度比) 对其进行鉴别分类研究。 对部分担子菌类蘑菇，分别测试其不同部位( 菌褶、菌皮、菌肉、菌托、菌环、 菌柄及孢子) 的红外光谱，从多部位比较研究各种蘑菇； 2 ) 测试一些纯物质的傅里叶变换红外光谱，如多糖标样b 1 ，3 葡聚糖 ( p - i ，3 - g l u c a n ) 、脱乙酰壳聚糖( c h i t o s a n ) 、淀粉( s t a r c h ) 以及蛋白质标样粘 糖蛋白( g l y c o p r o t e i n ) 等，比对标样物质和蘑菇的f t i r 光谱，定性说明蘑菇光 谱，给出蘑菇的部分化学信息； 3 ) 对部分蘑菇样品的红外谱图进行标准化、平滑、微分、插值等处理，提 取1 8 5 0 7 5 0 、3 7 5 0 2 5 0 0 c m 1 区间每相隔2 c r n 1 的光谱吸收强度值，做化学计量学 统计分析，如基于主成分分析的投影显示法( p r o j e c t i o nd i s c f i m i n a f i o nb a s e do n p c a ) 、系统聚类分析法( h c a ) 等。比较化学计量学分类结果和常规分类结果， 找出最适合基于f t i r 光谱数据对蘑菇进行分类的化学计量学方法； - 7 - 云南师范大学硕士学位论文 4 ) 建立一个基于傅里叶变换红外光谱的化学计量学分类方法作为常规分类 方法的补充技术手段鉴别几个科的野生蘑菇。 8 第二章傅里叶变换红外光谱技术简介 第二章傅里叶变换红外光谱技术简介 2 1 红外光谱的基本概念 红外光谱在可见光区和微波区之间。其波长范围约0 7 6 一1 0 0 0 ：a n 。习惯上 把红外光区划分成三个区域：近红外区( o 7 6 2 卸血) 、中红外区( 2 5 5 0 a n ) 和远红外区( 5 0 1 0 0 0 胛) 【帅】。当一束具有连续波长的红外光通过物质时，其 中某些波长的光要被物质吸收。物质分子中某个基团的振动频率和红外光的频率 一致时，二者发生共振，分子吸收能量，由原来的基态振动能级跃迁到能量较高 的振动能级。将分子吸收红外光的情况用仪器记录下来，就得到红外光谱图。在 红外吸收光谱中，可用波长五、频率k 和波数矿等参数来表示吸收谱带的位置。 其中： 伊= 高= 为如。1 ) ( 2 1 ) 忙硐2 砑协j 由于波数的数值适中，且它和频率一样直接与能量成正比关系： e = y = 胁矿 ( 2 2 ) 所以通常都用波数来表示吸收谱带的位置。红外光谱图的纵坐标表示红外吸 收的强弱，可以用透过率丁表示，也可用吸光度a 表示。 红外光谱法是通过研究物质结构与红外吸收光谱之间的关系，进而实现对未 知试样的定性鉴定和定量测定的一种分析方法。红外光谱可以用吸收峰的位置和 强度加以表征 9 1 1 。 2 1 1 分子内部的能级 一切物质都有运动，分子是由共价键把原子连接起来的、能独立存在的物质 微粒，因而分子也有运动。分子运动服从量子力学规律。按照量子力学的 b o r n - o p p e n h e i m e r 近似，分子运动的能量由平动能、转动能、振动能和电子能四 部分组成。因此，分子运动的能量e 可以表示为： e = 廓+ e 转+ e 振+ ( 2 3 ) 分子的平移运动可以连续变化，不是量子化的。分子的电子运动、振动和转 - 9 - 云南师范大学硕士学位论文 动都是量子化的。 分子由较低的能级e ，吸收一个能量为 y 的光子，可以跃迁到较高的能级 e ，但需要满足下列能量守恒关系式： 缸= e 2 一e = h v ( 2 4 ) 反之，分子由较高能级跃迁到较低能级时可以发出一个能量为】 p 的光子。 分子的转动能级之间比较接近，也就是能级差较小，分子吸收能量较小的低 频光产生转动跃迁，而低频光在红外波段中处于远红外区( 2 0 0 2 0 c m 1 ) ，所以分 子的纯转动光谱出现在远红外区。振动能级间隔比转动能级间隔大得多，所以振 动能级的跃迁频率比转动能级的跃迁频率高得多，分子中原子之间振动所吸收的 红外光频率处于中红外区( 4 0 0 0 - 2 0 0 e m 1 ) ，所以分子中原子之间的纯振动光谱出 现在中红外区。电子光谱则落入紫外一可见区。 量子力学指出，能级之间的跃迁遵循选择定则，选择定则是由分子的对称性 决定的：如果分子振动时偶极矩发生了变化，则该振动是红外活性的；如果振动 时分子的极化率发生变化，则该振动是拉曼活性的；如果两者都发生变化，则该 振动既是红外活性的，又是拉曼活性的阮9 3 1 。 2 1 2 分子的转动光谱 分子的转动光谱主要是指气体分子的转动光谱。由于气体中分子之间的距离 很大，分子可以自由转动，吸收光辐射后，能观察到气体分子转动光谱的精细结 构。液体中分子之间的距离很短，分子之间的碰撞使分子的转动能级受到微扰， 因此观察不到液体分子转动光谱的精细结构。 每个气体分子都可以围绕不同的轴转动，分子中的原子数目越多，轴的数目 也就越多。对于双原子分子，可以围绕三个轴转动，当分子围绕价键轴转动时， 分子的偶极矩没有发生变化，所以不出现红外吸收光谱。当分子围绕通过分子重 心且垂直于价键的轴转动时，分子的偶极矩发生变化，吸收红外光，并高速转动， 因而在红外区出现转动光谱。气体分子的转动光谱大多数出现在微波区和远红外 区 9 2 , 9 3 。 2 1 3 分子的纯振动光谱 分子的振动能级间隔比转动能级间隔大得多，当分子吸收红外辐射，在振动 第二章傅里叶变换红外光谱技术简介 能级之间跃迁时，不可避免地会伴随有转动能级的跃迁，因此，无法测得纯的振 动光谱，实际测得的是振动一转动光谱，为便于讨论，先考虑纯的振动光谱。 分子中原予之间的振动能级是量子化的。把原子的振动看作谐振子，若振动 能级由拧= 0 向以= 1 跃迁，分子所吸i 旺光的频率等于谐振子的振动频率，这种振 动叫做基频振动，基频振动的频率叫做基频。 从量子力学的角度来考虑，双原子分子两个原子核之间的振动可以简化为质 量为卢的单个质点的运动，可以近似地把这个质点看作是一个谐振子。其动能r 和势能v 分别为： r ：三声口：( 2 5 ) 矿：1 _ k 9 2 ( 2 6 ) 式中，k 为振动力常数。量子力学证明，谐振子的总能量是量子化的。其能量为 e 报= h v ( 吃1 亿， 又： y ：去，厍 ( 2 8 ) 忙瓦j i ( 2 舟) 从而可得： e 擐= 去仨( + 匀 g 当振动能级从行= 0 向行= 1 跃迁时，其能量变化为 皈= 去仨珈= 筹= 加伊 q 加， 即可得到谐振子基频振动吸收波数矿一1 ) ： 站去仨( 2 1 1 )”丽1 i 这就是双原子分子振动的经典方程。如果知道了振动力常数七，可以计算出 双原子分子的基频振动吸收波数矿。反之，知道了矿，可以计算出七。因为双原 子分子振动力常数只与电子云密度和核电荷有关而与质量无关，同种元素的七值 1 1 云南师范大学硕士学位论文 相同，所以上式不仅可以用于计算双原子分子同位素的基频振动频率，还可以近 似地应用于多原子分子同位素中的伸缩振动和弯曲振动频率的计算。 在多原子分子中，所有原子都围绕其平衡位置分别以不同的振幅进行着各自 的简谐振动，除了两个原子之间的伸缩振动外，还有三个或三个以上原子之间的 伸缩振动，此外，还存在各种模式的变形振动，多原子分子中所有这些振动统称 为筒正振动。在多原子分子中，简正振动的数目与原子个数和分子构型有关，由 个原子组成的非线性分子，其简正振动数目为3 n 一6 个；对于线性分子，则 为3 n 一5 a 。在多原子分子的红外光谱中，基频振动谱带的数目等于或少于简正 振动的数目。随着分子中原子数目的增多，基频振动的数目会远远少于简正振动 的数目，这是因为对称性相同的同种基团的简正振动频率发生简并，只出现一个 吸收谱带 9 2 , 9 3 ) 。 2 1 4 分子的振转光谱 当分子吸收红外光，从低能级态竹= 0 向相邻的高能级态以= 1 跃迁时，得到 的纯振动光谱应该是线状光谱。但实际上不可能得到线状的纯振动光谱，而是得 到宽的红外谱带，这是因为在振动能级跃迁时总是伴随着转动能级的跃迁。 随着分子缔合度的增大，或随着分子间作用力的增大，或随着分子中原子数 目的增多，分子的转动惯量逐渐增大，分子的转动能级间距越来越小，在测得的 光谱中将看不到转动的精细结构，而只看到宽谱带。在液体和固体的红外光谱中， 分子的转动受到限制也只能看到宽的谱带 9 2 , 9 3 1 。 2 1 5 分子的振动模式 分子中不同的基团具有不同的振动模式，相同的基团( 双原子除外) 具有几 种不同的振动模式。在中红外区，基团的振动模式分为两大类，即伸缩振动 ( s t r e t c h i n g v i b r a t i o n ) 和弯曲振动( b e n d i n g v i b r a t i o n ) 。伸缩振动是指基团中的 原子在振动时沿着价键的方向来回运动，此时原子的键角并不发生变化。除了双 原子的伸缩振动外，三原子以上还有对称伸缩振动( s y m m e t r i cs t r e t c h i n g v i b r a t i o n ) 和反对称( 不对称) 伸缩振动( a s y m m e t r i cs t r e t c h i n gv i b r a t i o n ) 。弯曲 振动是指基团中的原子在振动时运动方向垂直于价键方向。弯曲振动可以细分为 剪式变角振动( s c i s s o rd e f o r m a t i o n v i b r a t i o n ) 、对称变角振动( s y m m e t r i c d e f o r m a t i o nv i b r a t i o n ) 、反对称( 不对称) 变角振动( a s y m m e t r i cd e f o r m a t i o n 第二章傅里叶变换红外光谱技术简介 v i b r a t i o n ) 、面内弯曲振动( i n - p l a n e b e n d i n g v i b r a t i o n ) 、面外弯曲振动( o u t - o f - p l a n e b e n d i n gv i b r a t i o n ) 、平面摇摆振动( r o c k i n gv i b r a t i o n ) 、非平面摇摆振动( w a g g i n g v i b r a t i o n ) 和卷曲振动( t w i s t i n gv i b r a t i o n ) 。除了摇摆振动外，其余振动键角都 发生变化 9 2 , 9 3 。 2 1 6 倍频峰 在讨论双原子分子的伸缩振动时，把分子看作是谐振子，但是，实际分子不 可能是一个谐振子。量子力学证明，非谐振子不仅可以从，i = 0 的能级向珂= 1 的 能级跃迁，也可以从疗= 0 向盯= 2 ，刀= 3 或更高的能级跃迁。这种振动跃迁称 为倍频振动，其频率称为倍频峰( o v e r t o n e ) 。从刀= 0 向拧= 2 振动能级跃迁时所 吸收光的频率称为一级倍频峰，从订= 0 向打= 3 跃迁时所吸收光的频率称为二级 倍频峰。由于绝大多数非谐振子都是从栉= 0 向玎= 1 跃迁，只有极少数从一= 0 向 疗= 2 ，疗= 3 跃迁，所以，非谐振子的基频振动谱带的吸收峰最强，一、二级倍 频谱带极弱。而且，一级倍频总是小于基频的两倍。在中红外区，倍频峰的重要 性远不及基频振动峰。但在近红外区，观察到的都是倍频峰 9 2 , 9 3 。 2 1 7 合频蜂 合频峰( c o m b i n a t i o nt o n e ) 也叫组频峰，又分为和频峰和差频峰。前者由 两个基频相加得到，它出现在两个基频之和附近；后者则是两个基频之差。在红 外光谱中，和频峰显得更重要。只有在非谐振子中才会出现和频振动，所以和频 峰的频率一定小于两个基频之和。产生和频的原因是一个光子同时激发两种基频 跃迁。在红外光谱中，和频峰是弱峰，不如基频那么重要。 一般来说，在红外光谱中，两个强的基频振动吸收峰加和，很容易观察到和 频峰，一个非常强的基频振动和一个弱的基频振动吸收峰加和，有时也能观察到 和频峰，两个弱的基频峰加和也有可能观察到和频峰，而且，和频峰的强度有时 甚至比基频峰还要强瞰，矧。 2 1 8 振动耦合 当分子中两个基团共用一个原子时，如果这两个基团的基频振动频率相同或 相近，就会发生相互作用，使原来的两个基团基频振动频率距离加大，形成两个 独立的吸收峰，这种现象称为耦合振动( v i b r a t i o nc o u p l i n g ) 。耦合效应越强，产 生的两个振动频率的距离越大。耦合振动现象在红外光谱中很常见，主要有以下 云南师范大学硕士学位论文 几种方式：伸缩振动之间的耦合、伸缩振动和弯曲振动之间的耦合、弯曲振动之 间的耦合阮9 3 1 。 2 1 9 费米共振 当分子中的一个基团有两种或两种以上振动模式时，若一种振动模式的倍频 或合频与另一种振动的基频相近，就会发生费米共振( f e r m ir e s o