DNA的提取方法.ppt

dna的提取方法,中德美联致臻溯源,dna提取方法：,有机(饱和苯酚-氯仿)提取法chelex-100树脂提取法磁珠提取法,一、饱和苯酚-氯仿抽提法,饱和苯酚-氯仿抽提法提取dna在研究dna基因座的多态性中，特别是在提取完整的基因组dna中应用广泛。,饱和苯酚-氯仿提取原理及步骤,提取原理：1、用酚抽提细胞dna时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了dnase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与dna联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而dna溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了dnase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(a)rna。2.不能完全抑制rnase的活性。2、氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）,3、用酚-氯仿抽提细胞基因组dna时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含dna的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。4、用乙醇沉淀dna时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀dna时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如nacl或naac，na+中和dna分子上的负电荷，减少dna分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。,饱和苯酚-氯仿提取步骤,【实验原理】dna易溶于水，不溶于有机溶剂，而蛋白质在有机溶剂存在时变性沉淀。利用核酸和蛋白质对酚和氯仿变性作用的反应性不同分离核酸与蛋白质后，在高盐存在下用乙醇沉淀收集dna。【实验试剂】14%枸橼酸钠抗凝剂20.2%盐水3ste缓冲液410%sds5蛋白酶k(20mg/ml)6饱和酚7氯仿870及100乙醇9.3mol/l醋酸钠10.无菌去离子水11.te缓冲液,【实验方法】1.样品处理（1）血液样品将抗凝血以20003000rpm离心10min；吸取白细胞层约0.2ml移入1.5mleppendorf管中，加入0.2%盐水1ml，混匀，使红细胞溶解，10000rpm离心10min，弃去上层血红蛋白溶液，白细胞沉淀于管底。重复此步骤至血红蛋白溶液层为透明，弃上清。沉淀的白细胞中加入1mlste，混匀，10000rpm离心10min，吸去上层ste至剩余总体积约为0.5ml。注意事项：根据血液量调整消化提取体积。,（2）血痕样品取适量血斑连同载体剪碎，置于试管中。加适量无菌水（以检材全部浸湿，检材表面还保留有12mm左右高度的溶液层为宜）浸泡10min。10000rpm离心10min，弃上清。加入适量ste液悬浮沉淀物（终体积约为0.5ml）。注意事项：若检材陈旧可适当延长浸泡时间。含杂质很多的检材，可用酚、氯仿进一步提取，用g-50过柱，或用microcon纯化试剂处理。,（3）软组织样品先将组织用灭菌去离子水、乙醇冲洗灭菌。取1020g组织剪碎，加入2mlste，用匀浆器研磨制成单个细胞匀浆。注意事项：为减轻机械剪切力对dna的损伤，应尽量温和操作，缩短均浆时间。2.消化处理后的样品中加入1/10体积的10%sds和1/20体积的20mg/ml的蛋白酶k，使终浓度分别为1%和100g/ml，置于55温水浴中34h。注意事项：消化的温度也可以是37过夜。,3.dna抽提消化完全后，用等体积的酚、酚/氯仿、氯仿各抽提dna一次：（1）加入等体积的饱和酚，温和地上下颠倒混合，将管内溶液混合成乳状液。10000rpm离心10min。（2）转移上层水溶液到另一eppendorf管，加入1/2体积的酚和1/2体积的氯仿，混匀，10000rpm离心10min。（3）转移上层水溶液到另一eppendorf管，加入等体积的氯仿，混匀，10000rpm离心10min。注意事项：酚抽提时如果上清液太粘，不能和蛋白质分开，可以加适量tne稀释，然后再用酚提取；酚具有腐蚀性，氯仿具有神经毒性，操作时必须注意。,4.沉淀dna（1）转移上层水溶液到另一eppendorf管，加入1/10体积的3mol/l醋酸钠和2倍体积冰冷（-20保存）无水乙醇，混匀，沉淀dna。10000rpm离心10min。（2）弃上清，用70冷乙醇洗dna沉淀，三次。除去液体，室温晾干（或真空抽干），（3）加适量的te液溶解dna，溶解后的dna于4保存。注意事项：沉淀的dna凉干时，不宜完全干燥，否则难以溶解。【实验讨论】有机溶剂法dna，应用范围广，适合所有生物性检材，对腐败、陈旧、污染检材及指甲、毛发等无核细胞检材更有效；dna纯度高，可用于所有的dna分析。,一、chelex-100提取法,chelex-100树脂法提取dna目前在获取部分dna片段进行pcr分析中应用较广。,chelex-100提取原理及步骤,提取原理：chelex-100是由苯乙烯与二乙烯基苯的共聚体组成的一种螯合树脂，它对多价金属离子有高亲和力，其亚氨基二乙酸侧链起着螯合金属离子作用。现已证实chelex可以防止dna在煮沸中的降解，并在高温低离子强度下起着催化dna释放的作用。chelex-100能有效除去非核酸有机物，主要用于提取全血或血痕、精液或精斑、混合斑、毛发、培养细胞等。但因生物样本来源不同其操作方法有所差异。,【实验试剂】1.5chelex-1002.蛋白酶k（20mg/ml）3.无菌去离子水4.te缓冲液【实验方法】1.样品处理（1）血液样品取血液15l，加入1.5ml离心管，加入纯水1ml，剧烈震荡，室温下放置15min。1000012000rpm离心23min，弃去上清，收集沉淀。必要时用纯水洗涤12次，直至无色或色素很少。（2）血痕样品剪取15mm2血痕检材，置于0.5ml试管中。加入去离子灭菌水0.20.4ml，剧烈震荡，室温下放置1530min。12000rpm离心3min，弃去上清，保留沉淀及载体。,（3）软组织样品将组织于-20以下冷冻。用手术刀片刮取15g组织.放入1.5ml离心管中。2.dna提取（1）处理后的样品中加入200l悬浮好的5%chelex-100溶液（软组织检材同时还应加入10mg/ml蛋白酶k23l），（2）在56水浴中温浴30min以上，震荡510s。（3）100温浴8min后，剧烈震荡510s。（4）120000rpm离心3min，以沉淀chelex-100颗粒，上清液可用于pcr反应。注意事项：1.chelex-100放置后会沉淀，使用前必须混匀。2.chelex-100法提取dna煮沸非常关键，温度和时间要足够。3.提取的dna应在短时间内使用。若放置时间较长，应充分混匀再离心后，取上清液扩增。,【实验讨论】chelex-100法提取dna，提取过程始终在同一个试管内进行，不涉及转移，减少污染机会，同时也降低了检材的损失，是一个十分简单、快速的方法，很适合微量检材的dna提取；但本法提取的dna纯度不高，仅适用于pcr反应模板制备。,三、磁珠提取法,实验原理磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。硅磁（magneticsilicaparticle）就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料（如deae，cooh）等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒，基于这种技术的试剂盒，名称前都有mag-bind。,核酸分离与纯化的原则核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性;排除其他分子污染。,实验步骤（博坤生物）：1）溶液配制：洗涤液的配制按照洗涤液无水乙醇异丙醇=10.50.5的体积比配制混匀。如试剂盒不能在3个月内用完，可根据使用量分次配制洗涤液，每次使用后需盖紧盖子以防止挥发。1mol/ldtt：称取5gdtt溶解于高纯水中至终体积32.4ml，则dtt终浓度为1mol/l。将dtt分装小管保存于-20备用（一般在精液和头发等检材提取时用，其它检材一般无需加入）。,斑迹样本（血滤纸或fta）中dna的提取：剪取适量斑迹样本（大小约3mm3mm，血液不宜超过6ul）放入0.5或1.5ml离心管中，加入150ul裂解液及1.5ul1mol/ldtt（视检材而定），涡旋振荡混匀后，95温浴30min，温浴后旋涡振荡混匀；长期样本和难以裂解样本，将样本尽量剪碎并95温浴45min，如水浸泡不脱色样本。每次提取时使用的样本量不宜过多，否则获得dna样品的纯度和产率将受影响。这是因为起始样本量大时裂解体系粘度过高将使磁珠不易从溶液中磁吸出来。如需要使用更多的起始样本量，可适当增加裂解液的用量对体系进行稀释）,从离心管中挑离载体（滤纸片或fta卡），加入10ul磁珠（吸取磁珠前应旋涡混匀10s，将磁珠充分混匀后立刻吸取磁珠），旋涡震荡混匀，室温吸附5min（不要置于磁力架上，以保证磁珠充分混匀）。期间可旋涡震荡3-4次；室温吸附后，旋涡振荡混匀，立即将离心管放于磁力架上，待磁珠完全吸附到离心管管壁上（5-10s），吸弃液体；尽量吸净液体，吸液时注意不要碰触磁珠和过快吸取把磁珠带出。如发现磁珠不能有效吸附到管壁或吸液时磁珠随着溶液被带出，说明样本量太大，此时需要用裂解液进行稀释降低样本浓度，直至磁珠能够有效吸附到管壁不会随着溶液被带出）加入150ul裂解液，旋涡振荡混匀，放回磁架，磁吸5-10s，然后吸弃液体；,加入150ul已配好的洗涤液，盖上离心管盖，在离心管不离开磁力架的情况下