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y 、主8 9 1 2 从废弃铬鞣皮屑中提取胶原蛋白类水解物的研究 硕士研究生：裴海燕指导教师：汤克勇教授 摘要 ， 制革工、i k 所面临的主要问题是所产生的污染和对资源的极大浪费。在制革过程中， 仪禽原料皮重2 0 的物质转化为可以售出的皮革，其余的都作为废弃物丢弃了。这一 方面浪费了优良的原料皮资源，另一方面也对环境造成了极大的危害。随着资源、环 境等全球性生态问题的日益严峻，皮革工业的发展正面临着“可持续发展战略的挑 战。冈此，“制革废弃物的资源化”己成为国内外关注的重要课题。y 利用废铬鞣皮屑制胶原蛋白需要解决两个方面的问题。其是要脱除铬鞣皮屑中 的铬，其二要将皮质中的大分子链处理成适当的短肽蛋白质。本文以制革厂所产生的 皮革边角废弃物( 主要是含铬废弃物) 为原料，经过废铬革屑的脱铬、皮屑的水解两 个过程得到胶原蛋白水解物，并利用所得到的胶原蛋白水解物做可食性包装膜，后一 项j ：作正在进行中。 对于废铬鞣皮屑的脱铬，本文在前人对铬与胶原结合理论研究的基础上，采用酸 法脱铬、配合法脱铬、氧化法与配合法结合脱铬以及综合法脱铬四种方法。文中讨论 了各种脱铬方法的优劣，以及各种因素对脱铬率的影响。结果表明，氧化法与配合法 结台脱铬比单纯的采用酸法或配合法脱铬效果好，在适当怕配比和操作条件下，脱铬 率可达9 4 ；综合法脱铬的脱铬效果最佳，脱铬率可高达9 9 以上。， 对于脱铬皮屑的水解，本文采用了三种方法：酸法水解、碱法水解和酶法水解， 研究了各种水解方法对所得到的胶原蛋白水解物的各项性能指标的影响。结果表明， 碱法水解所得到的胶原蛋白水解物色泽好、粒度小：酶法水解所用时间最短，而且所 得到的胶原蛋白水解物灰分含量最小；酸法水解易出现埋盥。各种水解方法所得 产物的总氮含量相近。 采用s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳初步测得碱法水解得到的胶原蛋白多肽分子量在 1 4 ，4 0 0 9 7 ，4 0 0 之间。 7。 关键词：脱铬水解胶原蛋白水解物应用 。 a b s t r a c t t h es e r i o u sp r o b l e m sw h i c h t a n n e r yi n d u s t r yf a c e sa r et h ep o l l u t i o n t ot h ee n v i r o n m e n t a n dt h ee x t r e m e l yw a s t eo fr e s o u r c e s i nt h et a n n e r yi n d u s t r y , i ti s a c c e p t e dt h a t 1t o no f s a l t e dh i d e sy i e l d so n l y2 0 0 k go f l e a t h e r ( a b o u t2 0 o f t h ei n i t i a lh i d ew e i g h t ) , a n dm o r e t h a n6 0 0k go fs o l i dw a s t e ( m o r et h a n6 0 o ft h ei n i t i a lh i d ew e i g h t ) i sd i s c h a r g e da s r u b b i s h o no n eh a n d ，i tc a u s e st h es e r i o u sw a s t eo f h i g h g r a d er a w h i d er e s o u r c e o nt h e o t h e rh a n d ，i td o e sg r e a th a r mt oe n v i r o n m e n t s i n c e19 8 0 s ，d u et ot h ei n c r e a s i n go fl o c a l r e s t r i c t i o n so nl a n dd i s p o s a la n de s c a l a t i n go fl a n d f i l lc o s t s , t h ed e v e l o p e dc o u n t r i e sh a d s h i f t e dt h e i ri n d u s t r yt h a t m a yc a u s es e r i o u sp o l l u t i o n t ot h e d e v e l o p i n go n e s m a n y r e s e a r c h e r sh a v eb e e n f o c u s i n gt h e i rs t u d i e so n h o wt ou s et h et a n n e r ys o l i d w a s t e , e f f i c i e n t l y 。 s i n c e1 9 9 0 s ，w i t ht h ei n c r e a s i n go fs e v e r ew o r l d w i d ee c o l o g i c a lp r o b l e m sa sr e s o u r c ea n d e n v i r o n m e n t ，t h el e a t h e ri n d u s t r yc o n f r o n t st h ec h a l l e n g eo f s u s t a i n a b l ed e v e l o p m e n t s t r a t e g y 。i th a s a g r e a tp r o s p e c t t or e u s et h et a n n e r ys o l i dw a s t e 。 i no r d e rt oe x t r a c tc o l l a g e nf r o mt a n n e r ys o l i dw a s t e ，t w op r o b l e m ss h o u l db es o l v e d f i r s t l y o n ei st h er e m o v i n go fc h r o m i u mf r o mt h ec h r o m es h a v i n g s ，m a dt h eo t h e ri st h e o b t a i n i n go fs h o r t e rp e p t i d ec h a i n sb yd e s t r o y i n gt h ec o l l a g e nm a c r o m o l e c u l ec h a i n t o r e m o v et h ec h r o m i u mf r o mt h ec h r o m es h a v i n g s ，t h em e t h o do fa c i d ，c h e l a t e ，p e r o x i d e c o m b i n e d 诫氇c h e l a t ea n dc o m p r e h e n s i v em e t h o da r eu s e d a m o n gt h e s e 。t h el a s to n ei s t h eb e s t 。t h e d e - c h r o m i n g r a t ec a nr e a c h9 9 。9 8p e r c e n to f t h et o t a lc h r o m ec o n t e n t 。 t oo b t a i nt h eh y d r o l y s i so f c o l l a g e n ，s u c hw a y s a sa c i d ，a l k a l ia n da l k a l i n ep m t e i n a s e a r eu s e d 。t h ee f f e c to f d i f f e r e n tm e t h o d st ot h ep e r f o r m a n c ei n d e xi sd i s c u s s e d t h ec o l o ro f t h eh y d r o l y s i so f c o l l a g e nb ya l k a l im e t h o di st h eb e s t ，b u ti t sa s hc o n t e n ti st h eh i g h e s t w h e n h y d r o l i z a t i o ni sc o n d u c t e db ya l k a l i n ep r o t e i n a s e ，t h er e a c t i o nt i m e i st h es h o r t e s la n d t h ea s hc o n t e n ti st h el o w e s t w h e nt h es a m p l ei sh y d r o l y s i z e db y a c i d ，t h eg e le f f e c tm a y b e o b s e r v e de a s i l y f e wd i f f e r e n c e sa r ef o u n di nt h et 烈( t o t a l 蠲e l d a h ln i t r o g e n ) o fa l lt h e s a m p l e s o b t a i n e db ya i lt h ew a y su s e d t h e h y d r o l y s i sp r o d u c t i sb e i n gu s e dt om a k ee d i b l ew r a p ，w h i c hi su n d e r w a y t h em o l e c u t a r w e i g h t s o f h y d r o l y s i sp r o d u c t w e r ee s t i m a t e d b ys d s - p a g e ( p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i si ns o d i u md o d e c y l s u l f a t e ) u s i n gal a e m m l is y s t e m t h e m o l e c u l a rw e i g h tr a n g ef r o m1 4 ，4 0 0t o9 7 ，4 0 0 k e y w o r d s ：d e c h r o m i n g ，h y d r o l y s i s ，c o l l a g e nh y d r o l y z a t e ，a p p l i c a t i o n 郑州大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 课题的目的及意义 制革工业所面临的主要问题是所产生的污染和对资源的极大浪费。在制革过程中， 仅有原料皮重2 0 的物质转化为可以售出的皮革，其余的都作为废弃物丢弃t t ”。这 一方面浪费了优良的原料皮资源，另一方面也对环境造成了极大的危害。据报道，印 度制革业每年产生1 5 万吨的固体废物1 2 1 ，美国每年仅产生的含铬废物就达6 万吨1 3 ， 我国每年约产生1 4 0 万吨的皮革边角废弃物( 包括含铬皮革废弃物) 。这些固体废弃物 是造成皮革工业污染严重的重要因素之一。2 0 世纪8 0 年代以来，由于发达国家日益严 格的环保法规的限制，可用于填埋固体废弃物的地点逐渐减少，污染治理费用日益昂 贵，发达国家逐渐将其污染严重的工业向发展中国家转移f 4 1 ，人们也积极开展了制革固 体废弃物资源化的研究和应用工作。2 0 世纪9 0 年代以来，随着资源、环境等全球性生 态问题的日益严峻，皮革工业的发展面临着“可持续发展”战略的挑战1 ”。因此，“制 革废弃物资源化”已成为国内外关注的重要课题之一。 我国是制革工业大国，具有丰富的原料皮资源、廉价的劳动力和先进的制革技术 等优势，现已发展成为世界瞻目的皮革工业的加工中心和商贸中心。据不完全统计， 我国目前每年加工猪、牛、羊等皮革约1 0 亿张( 折合成标准张) ，产生的边角皮屑废 物数量巨大。由于它们没有得到充分的利用，不仅造成资源的极大浪费，而且对环境 也产生严重的污染。因此，充分利用皮革资源，使制革圆体废弃物资源化，而不以牺 牲环境为代价换取暂时的经济发展，已成为我国皮革产业发展面临的严峻挑战和必然 选择。 关于制革废弃物的回收利用已有相当长的历史。然而，在过去它并没有引起业内 外人士的普遍重视。近2 0 年来，随着分子生物学的发展，人们对胶原的认识更加深入， 其应用领域也更加广泛。因此，制革固体废弃物资源化也不再仅仅是利用废弃的皮屑 生产再生革等低附加值的产品【6 1 ，而是被赋予了新的内容，即力求高值转化。胶原是构 成动物机体的重要功能物质，它具有合成高分子材料无法比拟的生物相容性和生物降 解性1 7 】，因此，胶原作为天然的生物质资源，在食品、医药、化妆品、饲料、肥料等工 业中应用的重要性和经济地位正日益突出。利用制革废皮屑提取蛋白质，具有较好的 经济效益和环境效益。 利用废铬鞣皮屑制胶原蛋白需要解决两个方面的问题。其一是要脱除铬鞣皮屑中 的铬，其二要将皮质中的大分子链处理成适当的短肽蛋白质。其中，脱铬是关键环节忙j 。 郑州大学硕士学位论文 1 2 国内外研究现状及发展前景 1 2 1 废铬鞣皮屑的处理原理及方法 ( 1 ) 酸法处理 酸法脱铬的原理是，在酸性条件下铬配合物的水解和配聚平衡使其向解聚方向进 行，配合物的分子变小，失去鞣制作用，达到脱铬的目的。常用的是硫酸，盐酸、磷 酸等均有报道。 b a c k o b a 9 等人将末染色的千铬皮首先用草酸和柠檬酸、磷酸、盐酸或硫酸于2 2 下处理三天。草酸从皮中脱除c r 2 0 3 是有效的( 脱除量 7 0 ) ，其次是硫酸( 脱除 量达4 0 ) 。如果用混合酸处理，可以获得更好的脱铬效果，但胶原损失大，铬也除不 尽，明胶的产率也不高。 t p a k t e h 6 e p t l l 0 1 将小块铬鞣皮用3 8 的盐酸在1 0 0 。c 下煮沸1 0 1 6 小时，则水解 物为多肽，其分子量大小取决于盐酸的浓度和水解的时间。王远亮认为 1 1 i ，酸( h 2 s 0 4 ) 的浓度越大，水解时间越短，但浓度达4 以上于7 0 。c 下，铬鞣皮屑( 削匀屑) 水解 完全( 无残渣) 所需时间为2 小时左右；温度对其所产生的影响也很大，高于7 0 。c 时， 水解对时间的依赖性减弱。 酸法处理铬鞣皮屑只能得到低级皮胶和小分子多肽。 ( 2 ) 碱法处理 铬革屑中的铬是以配合物的形式通过与胶原的羧基配位而与胶原结合的。根据配 位体与铬的配位性质，当采用比胶原的羧基配位能力强的化合物处理革屑时，该化合 物可将胶原的羧基从铬配合物中取代出来，使铬鞣胶原脱鞣。碱处理法是利用游离o h 与铬的配位能力远远大于胶原羧基与铬的配位能力这一性质而对铬革屑进行脱鞣的。 用碱处理时，碱液中游离的o h 。进入铬配合物内界，将胶原羧基从铬配合物中取代出 来，使胶原脱鞣且同时发生一定程度降解，然后溶于水，铬则与o h 结合形成c r ( o h ) 3 沉淀。经过压滤或离心分离，可将胶原溶液与c r ( 0 h ) 3 沉淀分离。 一般认为，碱法处理的效果比酸法处理效果好。碱处理法中常用的处理剂有石灰、 氢氧化钠、碳酸钠和氧化镁等碱性材料。这些碱性材料在使胶原脱鞣的同时，也使胶 原发生一定程度的水解。例如，用n a c l h c l 或n a c i - h 2 s 0 4 混合液处理铬皮碎块，仅 能将胶原螺旋体转变温度t t 从1 1 3 。c 降至1 0 6 5 左右，用草酸使n 降至约7 5 。c ，而 用n a o h ( 1 0 0 9 l ) 和n a 2 c 0 3 ( 1 5 0 9 l ) 混合液处理4 小时，便可使t t 降至5 5 7 0 。c 。据测定，这时所有的c r - 胶原联结键均被破坏。使用硫酸脱铬不能充分，而认为 郑州大学硕士学位论文 石灰处理是脱铬的必要条件【l 孙，由此可以看出，在铬鞣废皮屑的脱铬处理中碱所起到 的重要作用。 在德国，以碱法处理铬皮屑常用的碱原料是m g o 。他们认为，铬皮用m g o 加热 可以制取明胶，但提取明胶的温度较高( 1 2 5 1 3 0 。c ) 。s t e i g m a n n t m l 用此法将温度下 降到9 0 。c 。其过程要点为：将铬皮料( 含4 8 的水和2 的脂肪) 在1 0 0 9 m g o 2 5 0 l h 2 0 的溶液中浸泡2 小时，充分洗涤后分步提胶，用3 0 0 9m g o 2 0 lh 2 0 的溶液于9 0 下提取2 小时( 第一步) ；接着在1 0 0 9m g o l g li - 1 2 0 的溶液中9 0 。c 下提取3 小时 ( 第二步) ：再在5 0 9m g o 1 5 lh 2 0 的溶液于9 0 0 c 下提取3 小时( 第三步) 。将此三 步骤所得到的胶经过合并、过滤等处理，即得明胶。然而这样的方法只能得到低级明 胶。氧化镁虽有较好的分离胶原链的作用，但脱铬作用却不明显。 据报道，日本人已将脱铬皮用于制取明胶的技术付诸工业化实施。冈本和吉5 i 等 人直在进行这方面的工作。仅从小试成果看，用石灰法是可取的。将铬皮在石灰水 中浸泡三天，水洗，调整d h 值，用7 0 c 热水提取，收率4 0 。所得产品的质量较好： 粘度1 5 8 r a p ，冻力4 1 5 9 ，铬含量3 0 7 0 p p m 。石灰水和水洗涤液中c r ”含量都小于 0 1 p p m ，且无c r 6 + 。但是，工业性实验的结果却有较大幅度的下降。这进一步显示铬 鞣废皮屑脱铬制取优质明胶仍有相当大的难度。鉴于石灰价廉，用石灰法脱铬的探索 最早见于德国专利。在美国，此法也正在探讨中。 在我国，蒋挺大等人提出了“铬革渣资源化处理”【6 l 方案，其最终产物主要是作 为饲料胶原蛋白粉应用，附加值不高。 ( 3 ) 酸碱交替法处理 单用酸或碱使铬鞣废皮屑脱铬制取明胶，都只能获得低级的明胶、皮胶或简单的 水解产物。k r i s h n a n f l 7 1 等人试图单用酸、碱、六偏磷酸钠、e d t a 或镁盐处理，均未获 得成功。他们认为采用酸碱交替处理可以获得一定的效果。m a n z o l l 8 】等人的实验表明， 先将废铬鞣皮屑经碱和酸连续交替处理，随后用氢氧化钠脱洗铬，所得明胶的稳定性 和粘度均比单用石灰法处理的要优良些。成都制革厂i i9 j 曾用h 2 s 0 4 - n a o h h 2 s 0 4 交 替处理，认为可以除去9 0 以上的铬，明胶得率2 6 。酸碱交替法在苏联一直进行着 研究，并申请了几项专利【2 0 】1 2 1 】【2 2 】。研究结果表明，先用n a 2 c 0 3 h 2 s 0 4 n a ：s 0 4 处理脱 铬，再用硫酸石灰乳处理，可以加快生产进度和提高产品质量。用草酸- 硫氢化钠处理 虽能获得优良的蛋白水解产物，但会造成硫离子对环境的污染。 据报道【2 3 1 ，用消石灰、硫酸、苛性钠、过氧化氢、硫酸等化工材料，将废铬革屑 依次经过浸渍、搅拌、水洗、过滤等简单的工艺操作，能够达到廉价而彻底除去废铬 革屑中所含的铬，并且消石灰液、硫酸、苛性钠可重复使用三次。其具体操作方法如 郑州大学硕士学位论文 下：第一步：先将废铬革屑( 以下简称为试料) 在消石灰乳液中浸渍搅拌、水洗。把 试料切碎成5 1 0 筛目的小块，称取5 0 9 置于5 0 0 m l 烧杯中加入3 0 0 m l 于4 8 小时以前 配好的2 5 浓度的消石灰液，以1 0 r p m 的速度搅拌4 8 小时。然后，再将其放到垫好 纱布的吸滤漏斗中用自来水吸滤过滤。( 每次用水量约为3 0 0 毫升) 直到将消石灰洗尽 为止。在这里所用过的滤液和洗液留着作第五步操作中用。第二步：将处理过的试料 放回原来的烧杯中加入3 0 0 毫升3 5 浓度的硫酸，以1 0 r p m 的速度搅拌2 小时，然后 进行吸滤过滤，用2 5 l 的水反复水洗吸滤过滤，此时试料的脱铬率均达9 9 以上。第 三步：在试料中注入3 0 0 毫升o 5 浓度的苛性钠以1 0 r p m 的速度搅拌- - + 时然后进行 吸滤过滤，之后用1 3 l 的水进行水洗。第四步：在试料中加入3 0 0 毫升5 浓度的苛 性钠以1 0 r p m 的速度搅拌2 小时然后进行吸滤过滤。之后用1 3 升的水反复水洗以充 分洗净过氧化氢为止。 ( 4 ) 配合法处理 配合法脱铬原理是利用配体的相互取代反应【2 4 】，常见配体与三价铬离子配合能力 的大小顺序为： h 2 0 c 1 0 4 n 0 3 。 s 0 4 。 h c 0 0 。 s 0 3 2 - 胶原羧基离= j c h 3 c o o 。 磺化苯二甲酸根 丁二酸根 丙二酸根 柠檬酸根 中性酶 空白。 工艺流程如下： 皮料处理一水洗去杂一石灰乳浸泡一水洗一水浴升温一酶脱铬一升温杀酶一水冲 洗一进入下一工序提胶或制蛋白粉。 该方法具有脱铬时间短，对环境及水源污染少的优点。但是该方法只能得到低分 子量的蛋白水解产物，其应用范围也很有限( 如作农肥) ，且费用很高。美国东部农业 研究中心的t a l y o r 3 1 】等人在酶法脱铬基础上研究出种两步法脱铬法。首先在温和的 碱性条件下处理废革屑生成高分子量的凝胶蛋白，然后用酶处理剩下的沉淀，回收铬 和小肽。其工艺流程如下： ( 1 ) 将革屑溶于含有非离子表面活性剂的水中。加入m g o 和碱或碳酸盐的混合物， 调节p h = 9 0 _ - 4 - 0 5 ，t = 7 0 7 2 。c ，搅拌6 h 。通过离心作用和热样品的真空过滤分离出 凝胶蛋白溶液。 ( 2 ) 过滤剩下的残渣含有铬和1 0 2 0 的残留蛋白质。为回收残留蛋白质，将此 残渣再溶于含有非离子型表面活性剂的水中( t = 7 0 7 2 ) ，震荡1 5 h ，混合物接着用 碱性蛋白酶处理( 先用m g o 调p h 至最适) ，将此热溶液用1 8 滤纸过滤，铬饼在室温 下空气干燥，蛋白液储存在4 c 的环境下。 ( 3 ) 铬饼中3 5 的成分是脂肪、c a 、m g 和有机残渣。为除去有机残渣，用1 0 h 2 s 0 4 溶液( p h 1 o ) 溶解。将溶液酸度慢慢调节至p h = 2 ( 用0 2 5 m o l l n a o h ) ，生成的溶液 在6 0 。c 下加热数分钟，非铬成分可用絮凝剂处理。通过进一步提高p h 值，将铬沉淀 出来。 t a y l o r 等【3 2 1 进一步研究发现，所加碱试剂的不同可能生成一系列性质不同的产品。 他们研究了碱试剂对凝胶和水解蛋白灰分含量、蛋白成分中铬含量、凝胶蛋白产物的 物理性质和蛋白产物分子量分布的影响。基于碱试剂的不同选择可得到具有不同物理 性质的蛋白质。与只用m g o 相比，使用m g o 与k o h 混合物将增加凝胶蛋白产物中 郑州大学硕士学位论文 的铬含量。用n a 2 c 0 3 代替n a o h 、k o h 可降低凝胶蛋白产物的铬含量，但对水解蛋 白中铬含量影响不同。就凝胶蛋白产物的物理性质，如明胶粘度而言，只用m g o 的效 果最好，加入碳酸盐和氢氧化物将影响明胶物理性质。他们还提出，为使明胶中灰分 含量降低，可用去离子树脂处理，使蛋白灰分含量降低至1 以下。在进一步的研究中 他们还发现，加入的碱的类型将影响蛋白质的分子量分布及热稳定性。酶法脱铬虽然 具有很多优越性，但只有实验室意义，对于大量的铬鞣废皮屑的处理来说，还未见报 道。 1 2 2 胶原蛋白的应用 1 2 2 1 胶原蛋白在食品中的应用 l 胶原适用于食品的一些属性3 4 i 食用级胶原通常外观为白色，口感柔和、味道清淡，易消化。此外，胶原的一些 独特的品质，使得它在许多食品中用作功能物质和营养成分，具有其它替代材料不可 比拟的优越性： ( 1 ) 胶原大分子的螺旋结构和存在着结晶区，使其具有一定的热稳定性。 ( 2 ) 胶原天然的紧密的纤维结构，使胶原材料显示出很强的韧性和强度，适用于 薄膜材料的制备。如用食用胶原膜包装肉食品【3 5 】和香肠1 3 6 】。 ( 3 ) 胶原用作制造肠衣等可食用包装材料的独特之处是：在热处理过程，随着水 分和油脂的蒸发和熔化，胶原几乎与肉食的收缩率一致。其它的可食用包装材料 还没被发现具有这种品质。 ( 4 ) 由于胶原分子链上含有大量的亲水基团，所以与水结合的能力很强，这一性 质使胶原在食品中可以用作添加剂。 胶原在食品中的应用 1 i 胶原在食品工业中有以下可能用途： ( 1 1 食品添加剂； ( 2 ) 营养强化剂( 添加于饮料中) ； ( 3 ) 烘烤食品； ( 4 ) 代替传统的鱼胶作为啤酒和白酒的澄清剂； ( 5 ) 固化酶的膜材料； ( 6 ) 肉食品标签； ( 7 1 火腿和冻肉的包装膜。 ( 8 ) 宠物咀嚼物 ( 9 ) 猪皮爆花食品 6 郑卅i 大学硕士学位论文 m e u l l e n e t 【j7 】等人研究了在鸡肉腊肠中添加胶原对其质地( 如强度、弹性和汁液量 等) 和口感的影响。结果认为，胶原的添加量为2 、水的添加量为2 0 左右时，腊肠 的感官、质地和口感最好。g r a v e s ( 3 s l 等的研究认为，牛肉馅饼中添加2 的胶原和8 的水得到的低脂馅饼( 9 的脂肪) 与含脂18 的馅饼一样可口，而且质地更好。这可 能为低脂产品的生产提供了一种方法。此外，胶原可以添加于饮料中作为营养强化剂， 还可用于烘烤食品等【3 9 】【4 0 】。 来自食品科学的研究表明：用胶原膜包装肉食具有抗氧化作用：在保鲜冷藏和冰 冻保存的解冻过程能减少汁液的流出1 4 1 】f 4 2 1 ，且肉食品的颜色保持鲜亮。在2 0 世纪3 0 年代，美国的f r e u d c n b e r g 等便积极投入了胶原肠衣的研究，并且于1 9 3 8 年申请了专 利。此后，化学家们研究此类材料的热情不断高涨。到2 0 世纪6 0 7 0 年代，不仅继续 深入研究单独的胶原或明胶的成膜性能，而且，还将胶原材料与其它的可食性材料如 聚糖、调味料、果胶、淀粉等混合在一起，以弥补胶原材料成膜时某些性能的不足， 或者将胶原作为填料加入到上述材料中以对它们进行改性。上世纪6 0 年代， u n i l e v e r n v 主要研究了纤维状蛋白与可食性多糖的混合材料的性能【4 3 1 ，并分别于 1 9 6 3 年和1 9 6 6 年申请了英国和法国专利，：e m a n u e lr l i e b e r m a n 研究了胶原一明胶材 料制造管式肠衣材料的性能m 】；接着，u n i l e v e r n v 对胶原糊的连续挤出过程进行了 研究，并于1 9 6 8 年继续申请了专利【4 ”。2 0 世纪7 0 年代，日本、前苏联、捷克等国的 许多研究人员都投入到该领域的研究工作中，取得了非常重要的进展。这一时期，美 国和欧洲的其它国家则保持着强劲的势头。c o h l ym a n j | 4 6 j 等继续研究了用铝盐鞣制肠 衣的效果，t h o r na s e n g e l 使用了交联剂，并用非胶原成份作为分散剂及一系列机械方 法来更好地分散胶原”。 上世纪末，日本学者对此项的研究逐步增多，且研究者们更多地投入到复合膜的 研究之中。欧洲学者则向胶原膜中添加一些香料、辣椒粉、果胶、酯类、阿拉伯树胶 等其它类型的添加剂。另外，还有众多国外学者活跃于该领域的研究，并做出了一定 的成绩。在实际生产中，日本的四国工业技术研究所、林源生物化学研究所、大阪化 学合金公司、三菱人造丝公司先后开发出的多种动、植物胶可食性包装膜，均具有透 明、强度高，印刷性、热封性、阻气性、耐水、耐湿性较好的特点，已用于调味品、 甜味料、汤料、油肠等食品的包装【4 8 】。美、欧等国对于该领域的研究则较少。中国也 有人在进行这方面的研究工作。寇柏权于1 9 8 9 年对肠衣的制造作了一定的研究；陈志 强、黄炳华、周亚仙也较为详细地对此方面进行了探讨。其中，陈志强先后研究了粘 和胶原蛋白肠衣4 9 i 、碱性胶原蛋白肠衣【5 0 】、酸性胶原蛋白肠衣的制作方法 5 l 】，黄炳华、 周亚仙分别于1 9 9 5 t 5 2 1 年和1 9 9 6 t 5 3 1 年申请了可食性胶原膜的专利。但是，他们主要是以 郑州大学硕士学位论文 天然原料皮为原料，研究经过酸碱溶胀、分散后借助机械作用而产生的分散胶原的成 膜性能，对水解胶原的成膜性能则涉入较少，也并未实现工业化；阚建全、陈永红等 对明胶可食性膜的机械强度和热封性能做了较为深入的探讨，对胶原成膜的基础理论 和工艺条件进行了一定的探索【5 4 1 。 胶原多肽除了符合人们对“低脂高蛋白”食品的需求以外，还具有以下两个重要 的性质： ( 1 ) 胶原多肽对肠胃的吸收更有利。过去人们总认为，人体摄入的蛋白质是在 胃和小肠内由多种蛋白质分解酶( 蛋白酶) 作用完全水解，然后以氨基酸小分子形式 被吸收。但是近年的研究表明【5 5 1 ，多肽可以由肠道直接吸收；肽类与氨基酸以不同的 途径被吸收，而且肽类吸收途径比氨基酸具有更大的吸收量。 ( 2 ) 动物蛋白质一般的生物学价值比植物蛋白高，其中最主要的原因之一是植物 蛋白中蛋氨酸的含量很低。蛋氨酸为必需氨基酸，除了与其它氨基酸组成人体蛋白质 外，它还具有独特的作用。人体缺乏蛋氨酸时，会出现脂肪肝、肝坏死、卵磷脂缺乏 等疾病【5 。但在植物蛋白中，蛋氨酸含量很少，甚至在营养丰富的大豆蛋白中，其含 量也很低。 随着经济的发展和生活质量的提高，我国的饮食结构也逐步由温饱型向营养健康 型转变。作为一种具有较好的生物相容性、生物可再生性和生物可降解性胶原多肽材 料，它的氨基酸种类丰富，蛋白质含量高，而且不含脂肪，已逐渐显示出在食品行业 应用的潜力。在日本，近年来由于社会“老龄化”问题日益严重，胶原食品已被厚生 省作为“健康食品”推向市场，已经有胶原多肽、氨基酸口服液等保健性食品上市。 我国目前对植物蛋白的研究较多，但对于胶原多肽的生理功能及有关食品的研究和开 发还没有引起足够的重视。 我国的食品结构中蛋白质偏低，奶源严重缺乏，人均牛乳占有量不足发达国家的 1 1 0 。另外，在乳制品中，奶粉占7 5 左右，新的加工领域亟待开发。值得注意的是， 近十年来，蛋白饮料在我国得到迅速发展，其主要原因是消费者从单纯的满足消暑解 渴的碳酸饮料逐步转向有营养、保健功能的要求，这也是软饮料发展之必然。据介绍， 我国软饮料工业己由1 9 9 5 年总产量约6 0 0 万吨发展到2 0 0 0 年的1 0 0 0 万吨，其中碳酸 饮料约占7 5 ，果蔬汁饮料、植物蛋白饮料、含乳饮料、矿泉水等约占2 5 。可见， 蛋白饮料所占比例还很小。随着人们生活质量的提高，对饮料的要求趋以营养、保健、 安全卫生、回归自然。目前我国植物蛋白饮料正处于发展时期，而动物蛋白饮料还未 开发。在日本等讲究饮食结构的发达国家，胶原蛋白及其降解产物己被作为众多功能 性食品和饮料的原料【5 7 】。 郑州大学硕士学位论文 】2 22 胶原蛋白在医药品中的应用 由于胶原具有较好的生物相容性和生物可降解性，使其在医药、卫生行业具有广 阔的应用前景。 i 胶原适用于医药品的性质 胶原的力学性能、止血功能、促进细胞生长的作用以及其极低的抗原性和可生物 降解性，使胶原具有在医药中广泛应用的可能性基础。 ( 1 ) 胶原的力学性能 胶原的力学性能主要由它的化学组成( c h e m i c a lc o n s t i t u t i o n ) 、交联( c r o s s l i n k s ) 和螺旋结构( h e l i c a ls 仃u c t u r e ) 所决定。胶原的肽键非常牢固，要想得到所有游离的氨 基酸残基，必须使胶原在1 0 5 c 、6 nh c l 中水解2 4 h r ，这一点就足以证明其肽键的稳 定性。胶原的交联键是赖氨酸或羟赖氨酸的侧链氨基和醛基，在赖氨酸氧化酶的作用 下，进行氧化脱氨反应形成的，所得到的联赖氨酸( s y n d e s i n e ) 式共价键非常稳定。 天然胶原的螺旋结构对胶原高强度的力学性能起重要作用。应力应变实验表明，天然 胶原表现出少许弹性态和粘弹态两个阶段的力学行为；而变性胶原( 没有螺旋结构) 仅表现出少许弹性态性质，其断裂拉力仅为天然胶原的一半。由此可见，天然结构是 维持胶原力学性能的关键。 ( 2 ) 胶原的止血功能 胶原的止血功能主要通过两方面发挥作用：促进血小板凝聚和血浆结块【58 1 。胶原 与血小板之间的作用机理还不完全清楚，但是有关其相互作用的许多现象已经得到证 实。胶原使血小板凝聚的能力似乎来源于游离的氨基，尤其是赖氨酸侧链氨基。封闭 胶原侧链羧基，不会造成凝聚能力的明显下降，不过却减弱了胶原促使血浆结块的作 用。所以，胶原的天然结构尤其是足够发达的四级结构，是胶原具有凝聚能力的基础。 ( 3 ) 胶原在促进细胞生长中的作用 胶原不仅对细胞起铆定和支持作用，还为细胞的生长提供适宜的微环境，参与细 胞的迁移、分化与增殖等行为。实验表明，细胞在胶原基质中能存活得更久。另外， 成纤维细胞( 合成胶原的细胞) 依赖胶原基质来迁移，这是因为胶原的a 链和一些胶 原水解多肽具有对成纤维细胞的向化性能，也即它们能吸引成纤维细胞，分泌促进伤 口愈合的物质。这个现象可以从一个侧面解释胶原在伤口愈合中的作用。抗坏血酸似 乎能促进细胞生长，其实质是抗坏血酸能刺激胶原的合成，而胶原在细胞生长中起重 要作用。此外，胶原促进伤口愈合的原因还有”：( 1 ) 引导功能，胶原纤维与血蛋白 功能一样，能引导成纤维细胞并生成血管；( 2 ) 成核作用，胶原可能作为成核点形成 新的胶原纤维。 郑州大学硕士学位论文 ( 4 ) 胶原的抗原性 胶原的抗原性相当低，在1 9 5 4 年以前甚至认为胶原不具有抗原性。最近的研究表 明，胶原有三种类型的抗原因子”：第一类是由胶原肽链非螺旋的端肽引起的；第二 类是由胶原三股螺旋的构象引起的；第三类只出现在变性胶原中：而第一类抗原因子 在天然和变形胶原蛋白中均存在。 t a k e d a ”等的研究表明，天然胶原即使作注射试剂用也是无毒的，只有在剂量过 大时才会产生免疫反应。胶原的抗原性可以通过去除端肽或使胶原蛋白链结成网状结 构来抑制。利用这一原理，l u c k ”等申请了非抗原胶原的制备专利，他们是用蛋白酶 处理饲养动物的胶原组织，得到能溶于稀酸的胶原；然后去除尾肽( t e l o p e p t i d e ) ， 得到不具有免疫性或免疫性很低的改性胶原( a t e l o p e p t i d ec o l l a g e n ) 。进一步处理， 将这种胶原溶液在轻微的剪切力的作用下，从溶液中分离出来，就会得到纤维状的沉 淀。事实上，它是由规则排列的绳状胶原纤维构成。形成的聚集体称为天然纤维的微 聚物，经脱盐后，还可以进一步修饰，如引入交联使纤维稳定。这种产品具有多种用 途，尤其适合应用于生物移植等医用材料。另外，用糖胺聚糖处理也可起到同样的作 用。 值得强调的是使用非变性胶原的重要性，因为这样可以避免n 链抗原因子造成的 胶原生物材料的抗原性。 ( 5 ) 胶原的可生物降解性 天然胶原紧密的螺旋结构使得大多数蛋白酶只能打断胶原侧链，削弱胶原分子的 交联。而胶原肽键只有在胶原酶的水解作用下，才会被打断。胶原肽链的断裂随即造 成螺旋结构的破坏，这样胶原就可以被蛋白酶彻底水解。 胶原的生物降解性可以通过胶原分子侧链之间产生的交联来减小或抑制( 在制革 中，鞣制就是起到这样的作用) 。生物材料最常使用的交联剂是戊二醛，其优点是易产 生交联且稳定。但是，戊二醛也带来两大缺点：它是细胞毒素，并对生物材料产生钙 化作用。法国l y o n 理学院的c o u l e t “3 1 等研究了胶原中引入叠氮基的方法以弥补上述方 法的不足。差热分析表明，以这种方式处理的胶原，其变性温度比天然胶原和重组胶 原的变性温度至少高1 0 。c 。并保持了天然胶原的结构，因此胶原的大部分性能、尤其 是力学性能保存了下来，抵抗蛋白酶作用的能力也得到提高。 i i 胶原在医药中的应用 胶原在医药工业中有多种应用形式，根据临床要求的不同，对胶原进行相应的加 工处理，可制备成胶原注射液、胶原止血粉剂以及以纤维形式的缝合材料和心脏瓣膜 修补材料，以及膜形式的外科敷料、海绵形式的皮肤移植材料、管状形式的血管、食 郑州大学硕士学位论文 管和气管等的替代材料等。这些材料被广泛应用于创伤和烧伤的修复、整形和美容、 皮肤及神经生长，以及血管瓣膜手术“”等。由于胶原具有很高的抗张强度、较低的抗 原性，加上它与其它介质融合，能被机体自身的酶所分解的特点，胶原可用作移植材 料，如人造皮肤等。 y a n n a s 和k i r k “”申请了在气相醛介质中，胶原与糖胺聚糖交联制备分子量m c 为 8 0 06 0 0 0 0 胶原一糖胺聚糖材料的方法。由这种材料制造的人造皮肤，比其它方法制备 的同类材料长期贮存更稳定。 美国b o s t o n 生物医学材料研究中心的d a v i s o n ”63 申请了一种使用二胺或氨基乙醇 盐提取动物胶原的方法，得到的胶原产品可以作为细胞生长的培养基、敷伤材料、合 成皮肤。k e m p ”7 1 等申请了应用胶原凝胶制备组织替代物的专利。他把人的表皮细胞放 置在已收缩处理过的胶原凝胶上，供应营养成分使之生长，制备皮肤组织的替代物。 法国的m a i nt t u c “”及其研究中心的工作者，在胶原生物材料领域进行了1 0 余年的研 究，申请了几项专利，开发了一些产品。其中有化妆品工业和人造皮肤用的胶原溶液、 胶原膜、胶原管、止血海绵、止血粉剂、手术缝合线、细胞培养基、酶或其它大分子 的支持物等。其中有的产品已经产业化，其它的还正处于实验研究阶段。 日本的冈村浩”等提出了从制草灰皮边角料中提取胶原蛋白，用于制备医药品( 手 术线、人造皮肤等) 和化妆品。 此外，胶原在医药工业中的另一重要用途是基于胶原微囊包封 ( m i c r o e n c a p s u l a t i o n ) 的药物运输系统( d r u gd e i v e r ys y s t e m ) 。微囊包封就是把 细小颗粒独立包裹上保护性涂层。涂层起到分离、贮存和运输的作用，以使被包裹物 在预定的条件下释放出来，从而起到控制或缓释的效果。释放的条件取决于湿度、p h 、 化学结合作用，释放的机理与保护层的构造有关，如膜的滤过性、腐蚀、破裂等。微 胶囊的直径一般在3 - 8 0 0um 之间，核的重量占1 0 9 0 。被包裹的核材料种类很多， 包括粘合剂、农药、活细胞、香水、药剂和墨水等。胶囊外壳材料多数为有机聚合物， 也有的采用脂类和蜡。美国首先出现微胶囊应用的专利 7 0 】【7 l 】【7 2 1 。现在，以明胶改性聚 合物制造控制药物释放的微球和微胶囊正越来越受青睐。 a k i n 和h a s i r c i 1 7 3 l 研究了与戊二醛交联的胶原微球的制备和性质。在他们的研究 中，采用基于温度变化的相分离技术，制备不同交联度( 戊二醛的用量不同) 的胶原 微球。美国东部农业研究中心的c a b e z a 7 4 】等从含铬废弃物中分离出明胶，并研究了明 胶在微囊包封( m i c r o e n c a p s u l a t i o n ) 中的应用。通过比较得出：商品明胶( 霜值7 5 9 和2 2 5 9 ) 和碱法或酶法提取的明胶在制备微胶囊时没有差别。明胶在这一领域的潜在 应用，将促使制革废弃物回收利用，而不是大量地被填埋。 郑州大学硕士学位论文 1 2 2 3 胶原蛋白在化妆品中的应用 皮肤内层的真皮层中含有大量的胶原，其纤维结构形成支持皮肤力学性能( 如强 度、弹性) 的网络。胶原是由成纤维细胞( f i b r o b l a s t t s ) 合成的，正如其它的生命物质 一样，随着生理年龄的增加，可还原性交联向不可还原性结构转化，从而使胶原结构 趋于更加稳定。与此同时，成纤维细胞的合成能力也变弱，因此皮肤就会老化，显得 干燥，失去柔软、弹性和光泽，皱纹增多。这是从胶原的角度解释皮肤的老化。 胶原蛋白及其水解产物由于具有很好的保湿性、对皮肤和头发良好的亲和性、乳 液稳定性等优点，在化妆品中的应用发展很快，已成为类十分有效的有保健美容功 能的化妆品原料。它们能滋润皮肤，赋予皮肤平滑感觉，对头发也有很好的调理作用。 在美国、德国、日本等国家，许多高档化妆品中添加有胶原蛋白，甚至有人面部注射 胶原以求减少皱纹，永葆青春。 胶原蛋白类产品性能温和、多功能、使用安全，是符合当代人们需要的化妆品的 重要原料。国际市场销售的化妆品用的蛋白质类原料近5 0 种，我国却只有n 酰化胶原 水解蛋白缩合物、肌氨酸、粗丝氨酸和透明质酸等少数几种产品 7 5 1 。 1 3 本工作的主要研究内容 本文以皮革厂的含铬废屑为研究对象，借鉴高分子材料科学、生物学、化学及国 外有关铬革屑综合利用研究的经验，结合实际，从废弃铬鞣皮屑的脱铬、脱铬后皮屑 的水解及对所得到的胶原蛋白多肽粉的理化性能指标进行了一定的研究。其中，废弃 铬鞣皮屑的脱铬部分已经应用到河南省辉县市金星饲料厂，产生了明显的经济、社会 和环境效益。 在废弃铬鞣皮屑的脱铬方面，对酸法脱铬、配合法脱铬、氧化法与配合法结合脱 铬进行了研究，并结合这几种脱铬方法，研究出了脱铬更为彻底的综合法。用此方法，