（应用化学专业论文）释放NO壳聚糖衍生物的合成及动力学研究.pdf

摘要 壳聚糖( c h i t o s a n ) 为甲壳素的脱乙酰化的产物，在地球上仅次于植物纤维的第二大生 物资源，是一种用之不竭的生物资源。同时壳聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解 性、吸附性、且无毒无害等一系列优点，决定了它在医学上广阔的应用前景。 本论文以壳聚糖为主要原料，首先测定了壳聚糖的粘均分子量、脱乙酰度、水分含 量等一些物理参数。然后以巯基乙酸、壳聚糖等为原料合成了壳聚糖巯基乙酸衍生物； 以半胱氨酸、壳聚糖等为原料合成了巯基化壳聚糖半胱氨酸衍生物，选取了料液比、催 化剂用量、反应温度、反应时间等因素作为考察对象，进行单因素实验和正交实验，确 定了较优的合成条件，为今后进行系列壳聚糖巯基化衍生物的合成提供依据。并用红外 光谱对产物进行了简单的定性，在壳聚糖巯基乙酸衍生物和壳聚糖，半胱氨酸衍生物的 红外光谱图上都出现了2 5 6 5 c m l 特征峰，峰的强度不是很强，与有机硫的s - h 伸缩振 动的红外特征频率一致，因此虽然吸收强度弱，但较为特征。 然后让壳聚糖巯基衍生物与亚硝酸钠的h c l 溶液反应，经过一系列处理。制得亚硝 基化的壳聚糖巯基化衍生物。通过紫外光谱对其做了鉴定，在5 4 5 n m 和3 3 0 r i m 都出现 了s - n o 的特征吸收，这些都可以进一步断定g s n o 的生成。同时用紫外定量分析s - n 健发生均裂释放的n o ，随着时间的延长n o 浓度的变化趋势，可以通过( 3 s n o 浓度变 化来测得。 最后研究了亚硝基化壳聚糖衍生物释放n o 的动力学。首先在5 个不同温度下测定 n o 的释放速率，确定了反应级数和反应速率常数，从而进而从动力学方面证明了n o 的释放对抗凝血的影响。研究结果表明：亚硝基化壳聚糖衍生物释放更符合准一级反应 规律。这些都为进一步研究此类衍生物的抗凝血性奠定了基础。 关键词：壳聚糖；合成；巯基化衍生物；释放n o ；动力学 a b s t r a c t c h i t o s a ni st h ep r o d u c to fd e a c e t y l a t i o no fc h i t i n c h i t o s a ni san a t u r a lp o l y s a c c h a r i d e b i o p o l y m e r i ti st h es e c o n dl a r g e s tb i o l o g i c a lr e s o u r c e sa f t e rp l a n tf i b e r so ne a r t h i tc o u l db e u n l i m i t e dr e s o u r c e s c h i t o s a ni sa l mg o o db i o c o m p a t i b i l i t y , b i o d e g r a d a b i l i t y , a d s o r p t i o n , a n d as e r i e so fa d v a n t a g e s ，s u c h 硒n o n - t o x i ca n dh a r l n l e s s ，w h i c hd e c i d e so ni t sw i d cr a n g eo f p o t e n t i a la p p l i c a t i o n si nm e d i c i n e i nt h i sp a p e r , c h i t o s a ni sr a wm a t e r i a l s ，f i r s tt h ev i s c o s i t y - a v e r a g em o l e c u l a rw e i g h to f c h i w s a l l ，t h ed e g r e eo fd e a c e t y l a t i o n , m o i s t u r ec o n t e n ta n do t h e rp a y s i c a lp a r a m e t e r sw e r e d e c i d e d t h e nm e r c a p t o a c e t i ca c i da n dc h i t o s a na sas y n t h e s i so fc h i t o s a n m e r c a p t o a c e t i c a c i dd e r i v a t i v e s ；t oc y s t e i n e c h i t o s a n 勰as y n t h e s i so fs u l m y d r y lc h i t o s m c y s t e i n e d e r i v a t i v e s t h er a t i oo fs o l i da n dl i q u i d , t h ea m o u n to fc a t a l y s t , r e a c t i o nt e m p e r a t u r e a s r e a c t i o nt i m ea n do t h e rf a c t o r st os e r v e 雒t a r g e t sf o rt h es i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a l e x p e r i m e n t 蠲a s s e s s e dt od e t e n t et h eo p t i m u mp r o c e s s i n gc o n d i t i o n s a n df o rt h es y n t h e s i s o fs e r i e so fc h i t o s a n s hd e r i v a t i v e sp r o v i d et h eb a s i si nt h ef u t u r e i rw a su s e da sab r i e f c h a r a c t e r i z a t i o no ft h ep r o d u c t c h i t o s a n m e r c a p t o a c e t i ca c i dd e r i v a t i v e sa n dc h i t o s a n c y s t e i n ed e r i v a t i v e sh a v ea r i s e n2 5 6 5 e m 1p e a l 【o ni n f r a r e ds p e c t r u m , p e a ki n t e n s i t yi sn o t s t r o n g , a n dt h es - hs t r e t c h i n gv i b r a t i o no fo r g a n i cs u l f u ri nt h es a n l ei n f i a r e df i 它q u e n c y a l t h o u g ht h ei n t e n s i t yo f p e a ks ow e a k , b u tm o r ef e a t u r e s 。 t h e nc h i t o s a nd e r i v a t i v e sr e a c t i o nw i t hs o d i u mn i t r i t eh c is o l u t i o n , a f t e ras e r i e so f l z e a n n e n t t h ec h i t o s 锄uo fs h o n i t r o s ud e r i v a t i v ew a so b t a i n e d u s i n gu l a a v i o l e t - v i s i b l el i g h t s p e c t r a lm e t h o dt oc a r r yo nt h ea n a l y s i sa n dt h ea p p r a i s a l ，b o t h5 4 5 n ma n d3 3 0 h m c h a r a c t e r i s t i ca b s o r p t i o n ，t h e s ec a nf u r t h e rd e t e r m i n et h eg s n og e n e r a t i o n t h eh o m o l y t i c c l e a v a g eo f t h es - nb o n dw i t hn or e l e a s ec a nb ea n a l y s e db yu s i n gu l t r a v i o l e t - v i s i b l e w i 也 t h ee x t e n s i o no ft h et r e n do fc h a n g e si nt h ec o n c 圮n w a t i o no fn 0c a nb em e a s u r e dt h r o u g h c h a n g e si nt h ec o n c e n t r a t i o no f g s n 0 f i n a l l y , w es t u d yt h ek i n e t i c so fc h i t o s a n - n i 缸o s o t h i o l sw i t hn or e l e a s e f i r s tf i v en o r e l e a s er a t em e a s u r e da td i f f e r e n tt e m p e r a t m - e st od e t e r m i n et h er e a c t i o na n dt h er e a c t i o nr a t e c o n s t a n t t h u sf u r t h e rp r o o f o f t h er e l e a s eo f n of r o mt h ed y n a m i c so f t h ea n t i c o a g u l a n t t h e r e s u l t si n d i c a t e st h a t ：- n i t r o s od e r i v a 虹v ec h i t o s a mr e l e a s em o r ec o n f o r m st ot h ef i r s tl e v e lo f r e s p o n s e sr u l e ；t h e s el a i d t h ef o u n d a t i o nf o r f u r t h e l - s t u d y o fs u c hd e r i v a t i v e s a n t i t h r o m b o g e n i c i t y k e yw o r d s ：c m t o s a n ；s y n t h e s i s ；s h - d e r i v a n t ；r e l e a s i n gn o ；k i n e t i c s m 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获孚导河 南工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示了谢意。 论文作者签名：互垄盈日期：丝! 二篁：丛 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南工业大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；本 人授权河南工业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：日期： 导师签名： 有关知识产权的保证 本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。本人在校期间的研究成果及发表的论文，知识产权归河南 工业大学所有。本人毕业后发表的、以本人在校期间研究成果为基础完 成的论文、研究报告及其它科研成果，将署名河南工业大学为作者单位。 论文作者签名： 至盗霆 日期：三! ! ! ：生竺 导师签名；逸牡日期：j 趟嗥二丝 释放壳聚糖衍生物的合成及动力学研究 1 1 课题研究背景 第一章前言 在上世纪6 0 年代初，人们就开始用合成高分子材料制成组织或器官替代品，如透 析膜、血管植入物等，但当时使用的高分子材料并不是针对医用而设计的，当材料作为 异物植入人体后引起诸如血栓、炎症、毒性反应、以及致癌等许多不良的反应。其中当 植入物与血液接触时，将产生蛋白质的吸附和血小板的黏附。一般认为，植入材料与血 液接触后，其蛋白质和脂质吸附于材料表面上，由于这些分子的构象发生变化，导致血 液中各成分发生相互作用，从而诱发以凝血因子活化的内源性凝血反应；继之发生血小 板、红血球等细胞成分附着于蛋白质表面，那些被黏附的血小板发生变性将释放出第1 i i 因子而促使凝血系统的活化，产生凝血反应，进而形成血栓，血管内血栓的形成还可能 引起致命的后果。因此，要求人工血管、人工心脏血囊、人工心瓣膜、人工肺等的生物 医用材料，不但要求具有与人体血管相似的弹性和延展性以及良好的耐疲劳性等，而且 要求具有良好的抗凝血性抗细菌粘附特性，即在材料表面不产生血栓，不引起血小板变 形，不发生以生物材料为中心的感梨”。 由于目前心血管疾病导致的死亡率仍然很高，而供体又严重不足，许多人工器官的 发展均依赖于高分子材料抗凝血性能的提高，因此，抗凝血高分子材料的研究和开发引 起了各国学者的高度重视，成为近年来的研究热点。 以往的抗凝血高分子材料设计概括起来主要有以下三个方面：具有微相分离结构的 材料，高分子材料的表面接枝改性以及高分子材料的肝素化 2 - - 1 2 1 。 考虑到相容性和在体内生理环境下的稳定性，在微相分离结构材料的基础上发展， 形成了多种类型的抗凝血聚氮酯材料。特别值得一提的是，在纳米材料兴起的时代，纳 米碳改性聚氨酯复合材料也得到了研究，而且结果表明，纳米碳改性聚氨酯复合材料的 血液相容性与单纯聚氨酯相比得到了明显的改进。 由于生物医用材料本身特点的局限性，对材料的表面进行接枝改性，也就成为提高 其抗凝血性的一种重要手段。通过化学或物理方法在高分子材料表面进行接枝，接枝单 体的结构，主要是具有抗凝血性天然和化学合成的化合物，如聚氧化乙烯，肝素等，通 过材料表面的聚氧化乙烯化，形成了特殊的疏水表面，降低了血纤维素酶的吸附，从而 起到了抗凝血的作用。 尽管具有抗凝血作用的肝素是最早被认识的天然抗凝血药物，人们对它的研究至今 河南工业大学硕士论文 仍然热情不减，原因在于它确实是行之有效的抗凝血药物。因此，将肝素固定在高分子 材料表面上以提高其抗凝血性，是材料的抗凝血性改性的重要途径。高分子材料的肝素 化，一般有物理吸附法和化学结合法两种。两种方法各有千秋，前者的结合不太牢固， 但肝素的构象能够保持；而后者的结构稳定，但肝素的构象不易保持，从而使得抗凝血 性能降低。目前离子键合、共价键合、及等离子法是研究较多结合方法，在技术和工艺 上相对较成熟。但是由于肝素化材料上的肝素生物活性不能很好地保持，至今没有合成 临床上可直接应用的抗凝血材料，随着血液凝固机理及材料结构与抗凝血之间关系的深 入研究，可预见肝素化抗凝血材料必将在临床上得到广泛应用。 近年来，一类通过释放n o 控制材料表面血栓形成的新材料引起了人们极大的兴趣 f m 蛳。n o 从血管内皮释放后，迅速在细胞外液中弥散，并与血管平滑肌细胞上受体结 合，通过激活鸟苷酸环化酶，使环磷酸鸟苷含量增加，从而发挥一系列生理效应。当血 管内皮功能正常时，在正常条件下乙酰胆碱可刺激n o 分泌，使局部血管呈舒张状态。 当血管内皮功能不正常时，乙酰胆碱不能促使n o 分泌增加从而导致血栓的形成。而给 予外源性的n o 可发挥替代作用，给予外源性的n o 可发挥替代作用，从而使冠状动脉 内动脉粥样硬化( a s ) 病变进展延迟，冠心病患者临床症状和预后改善。最常用的是外源 性的硝酸酯类药物。硝酸酯类药物进入体内后通过脱氨作用形成亚硝基硫酯，然后通过 膜表面系统进行一系列反应最后形成n o 。硫醇对硝酸酯类药物的生物转化是极为关键 的，当血管内皮功能减退时，血管平滑肌对外源性舒血管物质的敏感性增加，所以外源 性给予硝酸酯类药物的作用更为重要。另外当血管内皮功能减退时产生的氧化代谢产物 减少，其消除n o 作用减弱，硝酸酯类药物的作用更为明显。给予硫醇供体乙酰半胱氨 酸和卡托普利也可增加n o 生成，减少对硝酸酯类药物的耐药性。所以，研究通过释放 n o 来控制材料表面血栓形成就成为一种趋势【l “。 这类材料中，释放n o 的分子主要是n 一亚硝基化合物和s 亚硝基化合物。如j e s a a v e d r a 等【1 7 1 将哌嗪亚硝化后再与肝素结合，研究发现，用哌嗪亚硝化产物衍生的肝素， 其凝血酶抑制活性和抗血小板聚集活性都有所提高，而且认为，抗血小板聚集活性的增 加与肝素衍生物水解时释放的n o 能够逆转二磷酸腺苷诱导的血小板剧聚集有关。k a m o w e r , 等【1 明制得分别含有n ，n 二甲基1 ，6 已二胺和聚乙烯亚胺的亚硝化产物的聚 合膜，并将哌嗪的亚硝化产物与聚氯乙烯共价结合，发现这些材料都能不同程度降低血 小板黏附。h p z h a n g 等【1 9 】先将硅橡胶表面分别与n ( 6 氨已基) - 3 - 氨丙基三甲氧基 硅烷进行交联，然后通入n o 气体进行亚硝化，发现改性的硅橡胶通过局部释放n o 能 提高材料的抗凝血性。s m s h i s h i d o 等【2 0 】将s 亚硝化谷胱甘肽和s - 亚硝基- n - 乙酰半 胱氨酸分别与f 1 2 7 凝胶结合，研究了材料释放n o 的动力学，但没有研究其抗凝血性 2 释放n o 壳聚糖衍生物的合成及动力学研究 能。另外壳聚糖由于其无毒无害，并具有良好的生物相容性和生物可降解性等一系列优 点，最近在壳聚糖表面接巯基乙酸或含巯基的化合物引起了人们的兴趣。c e k a s t 【2 l 】 在壳聚糖表面接上了巯基乙酸并研究了c h i t o s a n - t g a 对新鲜猪肠黏膜的粘附实验。a b e m k o p s c h n u r c h 研究了巯化聚合物的合成和特点，这些都为合成释放n o 的亚硝基化 合物的研究奠定了基础圈。 1 2 壳聚糖及其衍生物的性质和应用 1 2 1 壳聚糖的性质 壳聚糖( c h i t o s a n ) 为甲壳素的脱乙酰化的产物，是一种天然的生物高分子线形多糖。 在自然界中，壳聚糖广泛存在于低等植物菌类、藻类的细胞，节肢动物虾、蟹、蝇蛆和 昆虫的外壳，贝类、软体动物( 如鱿鱼、乌贼) 的外壳和软骨，高等植物的细胞壁等，每 年生物合成的资源量高达1 0 0 亿t ，是地球上仅次于植物纤维的第二大生物资源，其中 海洋生物的生成量在1 0 亿t 以上，可以说是一种用之不竭的生物资源瞄l 。此外壳聚糖 具有良好的生物相容性、生物可降解性、吸附性、且无毒无害嗍，同时由于它可溶于酸 或酸性水溶液，因此在工业废水的处理、日用化学品、食品、生物工程、农业和医药等 方面得到了较为广泛的应用。尤其是它具有无毒、成膜性、良好的生物相容性和可生物 降解性等独特优点，近年来作为生化药物和药剂辅料方面的应用研究异常活跃。 壳聚糖不溶于水、乙醇和丙酮，可溶于稀盐酸、硝酸等无机酸和大多数有机酸，不 溶于稀硫酸、磷酸瞄碰填结构如下图1 - 1 所示，由于壳聚糖分子中有- n h 2 和- o h 活性 基团，故可对其进行化学改性，通过酚化、醚化等反应制备多种衍生物，这些衍生物具 有成膜性、抗凝血性、促进伤口愈合、防止胃溃疡及降低胆固醇、防止癌细胞转移、防 腐抗菌等功能；故其在医药方面的应用尤令人关注，已成为当前研究的热点之一 2 7 j 。 甲壳素壳g e t 图! - 1 甲壳素、壳聚糖分子的结构示意图 f 培1 - 1t h ec o n f i g u r a t i o ns c h e m a t i co f c h i t i na n dc h i t o s a a 河南工业大学硕士论文 1 2 2 壳聚糖衍生物的制备l 昝删 ( 1 ) 羧甲基化 由于壳聚糖仍然只能溶解于酸或酸性水溶液，不能直接溶于水，这限制了它的应用。 因此，改善壳聚糖的溶解性能，是其应用研究中的方向之一。将壳聚糖在碱性条件下， 以氯乙酸为改性剂，制备羧甲基壳聚糖，其产物有良好的水溶性。具体的制各方法如下： 将精制的壳聚糖装入带有搅拌的反应瓶中，加入一定量2 0 的氢氧化钠溶液和异 丙醇，于室温下搅拌6 0 m i n 后，缓慢滴加定量的氯乙酸，在室温下反应5 h 。反应停止 后用稀盐酸中和至p h 7 ，产物用丙酮沉淀后过滤，用8 5 的甲醇溶液多次洗涤，再用 无水甲醇洗涤，6 0 c 下真空干燥后得到纤维状白色羧甲基壳聚糖。通过控制反应温度或 反应时间，可制备出不同取代度的羧甲基壳聚糖。如温度愈高或反应时间愈长，其取代 度越高。但是，温度越高，产物的色泽越深。同时，产物的特性粘度m 也逐渐下降， 平均分子量也呈下降趋势，这是因为在碱性反应条件下，伴随着分子链的断裂。因此， 为了制备高粘度、高分子量的衍生物，以室温反应为宜。 ( 2 ) 羟丙基 壳聚糖的羟丙基是在碱性条件下，用环氧丙烷为醚化剂制备。加入装有回流、搅拌 的- - - v j 反应瓶中，再加乙醇，于室温下搅拌3 0 m i n 后，加入过量的环氧丙烷反应，反应 停止后用1 ：l 的盐酸中和至p h = 7 ，产物用丙酮沉淀( v v = 2 ：i ) ，多次洗涤后，再用甲 醇洗涤，在6 0 ( 2 下真空干燥，壳聚糖与氢氧化钠及异丙醇重量比为1 ：1 ：1 6 ，反应温度在 1 5 , - 4 5 c 范围内，反应时间3 h 以上，均可获得完全溶于水的改性产物，它可形成粘度不 同的粘稠溶液，因有成膜性及保湿性，可望在医用水凝胶和化妆品等方面得以应用。 ( 3 ) 磺化羟乙基 磺化羟乙基壳聚糖的制备步骤如下： 壳聚糖的乙基化 将高脱乙酰度的壳聚糖，加入5 0 氢氧化钠溶液中，搅拌均匀，置冰箱冷冻1 0 d 以上，制成碱化壳聚糖。碱化壳聚糖解冻后，挤压除去剩余碱液，置于三口烧瓶中。分 别加入异丙醇和2 氯乙醇，微压下沸腾回流反应2 4 h 后。倾去溶剂，加入适量去离子水， 用盐酸中和，于6 0 下烘干，即获得乙基化壳聚糖。 乙基化壳聚糖的磺化 以甲酰胺为反应介质，先制备氯磺酸甲酰胺磺化试剂。甲酰胺2 0 m l 置于三口烧 瓶中，放入冰盐浴。在搅拌条件下，滴加一定量氯磺酸。控制氯磺酸的滴加速度，使温 度保持在5 以下。滴加后所得的白色粘稠液体，供磺化使用。将上述三口烧瓶移入恒 温水浴中，加入经乙基化的壳聚糖，开动搅拌，升温到指定温度，保温反应4 h 。反应 4 释放n 0 壳聚糖衍生物的合成及动力学研究 体系成为红褐色，在烧瓶底部伴有少量不溶性无机盐生成。加入适量去离子水，得到红 褐色溶液。移入透析袋中，用去离子水充分透析，直到透析液中无s 0 3 存在为止。 脱氨及纯化处理 透析后含磺化羟乙基化壳聚糖的水溶液，加入氢氧化钠溶液调整p h l 2 1 4 ，有氨 逸出。脱氨至中性后，将溶液移入透析袋中，用去离子水透析3 d ，充分清除小分子物 质。透析后的溶液在5 0 c - 6 0 c 下浓缩，即获得纯净的磺化羟乙基化的壳聚糖。 ( 4 ) 金属配合物 壳聚糖可与碘、锌、硒和铜等金属形成金属配合物，发挥新的药理作用。将壳聚糖 与碘在非均相条件下发生反应，可得壳聚糖碘聚合物，该聚合物保留了壳聚糖的成膜性， 又具有碘的杀灭病原微生物的功能，起到缓释作用。 缪锦来，李光友，王波等【3 l 】对制备的硒化壳聚糖用原子荧光光谱法进行了测定，证 实其含有较高的硒含量。对硒化壳聚糖的理化性质进行了测定，并与壳聚糖和磺化壳聚 糖的理化性质进行了对比，对三者具不同理化性质的原因作了分析：分子中引入了不同 的基团从而具有不同的理化性质，这是主要原因，分子量的不同对理化性质也有影响。 通过紫外和红外光谱分析，确认了硒化壳聚糖含有硒，而且是有机硒。通过氢谱和碳谱 基本确认硒化壳聚糖中的亚硒酸根是连接在c 2 和c 6 位。 另外，王爱勤等【3 2 】，在均相条件下，通过甲壳胺( c t s ) 与c u s 0 4 反应合成了甲壳胺 一c u ( i d 配合物，并用元素分析、瓜、x - 衍射和t g a 对c u ( i d 与甲壳胺形成的配合物进 行了结构表征。不同p h 值下形成的配合物有不同的构型在p h j 7 时配合物是由1 个 c u ( i d 与1 个甲壳胺单元中c 2 和c 3 位上的- n h 2 和o h 进行配合并通过羟基形成了桥式 配位结构 1 2 3 壳聚糖衍生物的应用 壳聚糖的结构决定了它的性质，通过改性，可以广泛地应用于食品方面【3 3 删，由 于壳聚糖难被人体吸收，当摄入体内后，它们可与相当于自身质量许多倍的甘油三酯脂 肪酸、胆汁酸和胆固醇等脂类化合物生成络合物，该络合物不被胃酸水解，不被消化系 统吸收，从而阻碍人体吸收这类物质，使之穿肠而过排出体外，因此，国外已经用壳聚 糖作为糖尿病和肥胖病保健食品添加剂【3 习。 同时由于壳聚糖的抗菌性也可在调味品种应用，例如在食用醋中添加壳聚糖，不仅 可以抑制醋酸的臭味，还可以维持食用醋对食品的防腐作用【3 q 。 在农业方面的应用【3 刀，壳聚糖作为种子处理剂、植物病害诱抗剂、降解性地膜、肥 河南工业大学硕士论文 料和土壤改良剂、农药等。用壳聚糖处理过的种子具有增收的作用，针对这一功能，有 的人认为是壳聚糖提供了氮营养力，从而提高了产量。也有人认为壳聚糖可能是通过增 加作物的免疫力以达到增产，或可能是以赤霉素的拮抗剂形式调节作物的发育动态。特 别值得一提的就是，利用壳聚糖的成膜性及生物可降解性，可制成具有良好粘附性、通 透性和一定抗拉强度的农用地膜，代替现在广泛使用的聚乙烯地膜，克服了聚乙烯地膜 板结土壤、不利于作物生长的缺点，同时大大降低了白色污染。蒋桂芳等【3 8 】利用壳聚糖 的抗菌性可以植物病原菌生长阻制剂、植物或园艺作物的抗病虫、病原菌的赋活剂、杀 线虫剂等p 哪。 在医药方面，壳聚糖具有良好的组织相容性和体内可降解性，故作为药物载体有着 极大的优越性。壳聚糖及其衍生物具有增强穿透作用及酶抑制作用，加上已被证实的生 物黏附特性和生物可降解性，使其有望成为生物大分子药物的运送载体，增加此类药物 在体内的吸收f 瓤h 1 1 。此外壳聚糖的加入，可以降低药物对胃肠道产生副作用的问题； 壳聚糖可以促进腹腔对药物的输送，从而增加某些药物与靶细胞的结合，使药物在病灶 部位发挥其最大功效【4 2 】。目前对壳聚糖在药物研究中的应用已形成热点，但是仍没有开 发出具有高价值的产品，现在对壳聚糖较成熟的应用仍停留在抗菌方面，因此加大对壳 聚糖在生物医药方面的研究并尽快实现产业化是比较现实的工作。而我们本课题的研究 也响应了此潮流。 在生物化学方面【4 3 】，壳聚糖及其衍生物可以固定酶载体，在制糖业、制药业中发挥 作用，与其它固定酶载体相比具有原料易得、价格低廉、固定酶的效率高等优点m 卅 1 3 壳聚糖及其巯基化合物的研究进展 近年来，在全球形成了甲壳素壳聚糖及其衍生物的开发热潮，各国都加大了对其 产品的开发研究力度，其中又以日本走在了各国的前列。日本政府曾投资6 0 亿日元委 托数十家高校及科研机构历时十余年进行开发研究，取得了大量的科研成果，并已部分 产业化，仅以壳聚糖为主要原料的保健食品就有2 0 个左右的品种上市。1 9 9 4 年，功能 性保健食品救多善的销售额达到了1 0 0 0 亿日元以上，足见其市场潜力之大。通过 美国化学文摘( c a ) 对1 9 9 3 年与甲壳素壳聚糖及其衍生物有关专利及其出版物的统 计，可见各国在该领域研究与开发的广泛程度，具体见表1 - 1 。 6 释放n 0 壳聚糖衍生物的合成及动力学研究 表l 一11 9 9 3 年关于甲壳素麂聚糖及其衍生物的研究 t a b l e1 - 1l e a r n i n g a c t i v i t yo f c h i t i n c h i t o s a n a n d t h e i r d e r i v a f i v e r s m l 9 9 3 进入9 0 年代，中国对甲壳素壳聚糖及其衍生物开发研究也越来越重视，有众多的 科研机构投入到该课题的研究中来，并已取得了不少成果。如无锡轻工业大学夏文水等 研究了甲壳素壳聚糖的酶法降解；中科院长春应化所的王伟等对壳聚糖的溶液性质进 行了大量的研究；华东理工大学的金鑫荣等将壳聚糖用作絮凝剂、壳聚糖降解制备低聚 壳聚糖。1 9 9 9 年在武汉召开的中国化学会第二届甲壳素研讨会不论是论文的数量和质 量都有显著的提高。特别是近年来开发出了一批新产品，使中国的甲壳素、壳聚糖研究 又达到了一个新的水平。 最近壳聚糖巯基衍生物被合成并应用到药学研究中，其优良的生物相容性和黏附性 预示其作为未来功能性药用敷料的广阔前景【4 7 】。 关于壳聚糖巯基化的研究也很多，国外已逐渐把壳聚糖及其复合生物普遍用于在水 处理中【4 8 - - 4 9 。 在国内赵玉清等 s o l 将壳聚糖( c t s ) - 与自制的丙酮酸化壳聚糖( p - c t s ) 、巯基化壳聚糖 ( c t s s m 作为吸附剂，研究了不同吸附剂对污染水体同一金属离子的静态吸附和动态吸 附及对混合金属离子的竞争吸附，分析了p h 值、温度、吸附时间对吸附量的影响，研 究了流速对动态吸附和脱附的影响及洗脱剂、活化剂对吸附剂复原的作用，为用壳聚糖 复合物( c t s - x ) 清除污染水体中金属离子进行了基础研究。同时，赵玉清等自制了壳聚 糖系列复合物( c t s - x ) ：黄原酸化壳聚糖( c t s c s 2 ) 、巯基化壳聚糖( c t s s h ) 、研究了 其对环境菌群的抑制作用。对污水中金属离子的吸附作用，以及对废气中铅的消除作用。 为壳聚糖复合物在环境保护中应用做了基础研究【5 1 恻。 杨声等 5 3 5 4 1 研究了c 岬d 在巯基化壳聚糖( c t s s 哪共价键合修饰的金电极上的循 环伏安行为。利用金电极与硫代乙醇酸易形成a u - s 键及壳聚糖中的活性基团的特殊性。 7 河南工业大学硕士论文 用共价键合的方法制各了巯基壳聚糖修饰的金电极。该修饰电极对金属离子具有很好的 络合吸附作用，能大提高测定金属离子的灵敏度。从而用来选择性富集分离痕量n i ( i i ) ， c u ( i d ，c d ( i i ) 及废水中的p b ( i i ) 。 壳聚糖巯基化合物还可作为水果的保鲜膜，关于这一应用国内外都有报告【5 7 1 ， 如易国斌等利用半胱氨酸( c y s ) 对壳聚糖( c h d 进行改性，得到巯基化壳聚糖( c h i s i ) 。进 一步制备出不同c h i - s h 浓度的保鲜膜，考察了c h i s h 浓度对西红柿褐变指数、失水 率、v c 含量等的影响，结果表明：c h i s h 浓度为0 0 5 0 5 之间时，西红柿的褐 变指数较低、失水率较低，并可有效地保持西红柿中的v c 含量。减少果蔬的腐烂变质 现象，总体上延长了果蔬的贮存期，减少因贮存时间长而造成的经济损失。 娄翔等以巯基乙酸和4 丁巯内酯为反应试剂采用均相反应法制备了巯基化天然聚 合物衍生物。结果表明，利用壳聚糖和明胶上的氨基等活性基团，可采用不同途径对它 们进行巯基化改性；在水溶性碳二亚胺的活化作用下巯基乙酸的羧基与壳聚糖的氨基形 成酰胺键，从而将活性巯基引入到壳聚糖中，但大部分被氧化；随着贮存时间的延长 各改性物中的巯基含量逐渐降低，所以改性物保存于低温惰性环境中，以保持其反应活 性。这些仿生杂化构建可注射水凝胶支架，是制备组织工程材料的一条有效途径，而天 然聚合物的改性即成为其前提条件。 1 4 研究目的 关于壳聚糖衍生物的研究国内外都有报道，国外一般都是在冷冻干燥条件下进行 的，相对来说条件比较苛刻。在国内也有关于壳聚糖衍生物的研究，一般都用于水果的 保鲜、金属离子的吸附等，如赵玉清在浓硫酸和乙酸酐催化条件下，让壳聚糖和巯基乙 酸反应，经过一系列处理，得到黄棕色明胶状固体。我们也尝试着用这一方法，但是重 现性不是太好，而且产物也不好处理。而且国内大都是仅仅合成了巯基化壳聚糖，并没 有进一步亚硝基化，并进行动力学研究。 本研究以巯基乙酸、半胱氨酸、壳聚糖等为原料合成了能释放n o 巯基化壳聚糖衍 生物，确定了合成的较优化条件； 将巯基化壳聚糖衍生物进一步衍生化又合成了壳聚糖的亚硝基衍生物，用紫外光谱 跟踪对n o 的释放速率进行了测定，测定了n o 释放的动力学，为进一步研究此类衍生 物的抗凝血性奠定了基础。 8 释放n o 壳聚塘衍生物的合成及动力学研究 第二章实验材料与仪器 2 1 实验材料及化学试剂 壳聚糖 巯基乙酸( a r ) 水溶苯胺蓝( b s ) 半胱氨酸( b r ) 对甲苯磺酸( c p ) d c c ( c p ) 碘( a r ) 碘化钾( a r ) 亚硝酸钠( a r ) 乙酸( a r ) 盐酸( a r ) 无水乙醚( a r ) 丙酮( a r ) 硫代硫酸钠( a r ) 2 2 主要实验仪器 6 0 1 超级恒温水浴 鸟氏粘度计 p h s 3 c 型酸度计 e - 2 0 1 c 型p h 复合电极 7 2 2 型分光光度计 b s 2 2 4 s 型电子分析天平 电热真空干燥箱 t h z 8 2 气浴恒温振荡器 l d 4 - 2 离心机 傅里叶变换p r e s t i g e - 2 1 型红外光谱仪 9 国药集团化学试剂有限公司 天津市科密欧化学试剂开发中心 中国上海标本模型厂 中国惠兴生化试剂有限公司 天津市科密欧化学试剂开发中心 国药集团化学试剂有限公司 洛阳化学试剂厂 开封化学试剂厂 洛阳市化学试剂厂 开封市芳晶化学试剂有限公司 洛阳市化学试剂厂 洛阳市化学试剂厂 洛阳市化学试剂厂 北京市红星化工厂 江苏省金坛市医疗仪器厂 上海精科 上海雷磁仪器厂 上海雷磁仪器厂 上海精密科学仪器有限公司 北京赛多利斯仪器系统有限公司 天津天字机电有限公司 江苏省金坛市医疗仪器厂 北京医用离心机厂 日本岛津 河南工业大学硕士论文 t u - 1 8 0 0 p c 紫外可见分光光度计 7 2 2 分光光度计 2 3 几种溶剂的配制 北京普析通用仪器有限责任公司 上海精密科学仪器有限公司 ( 1 ) 1 淀粉水溶液的配制【5 s 】 将1 9 可溶性淀粉加少量蒸馏水条成稀糊状，然后将此稀糊状溶液缓缓加入沸蒸馏 水中，并不停地搅拌，最后用沸蒸馏水稀释到1 0 0 m l 。 ( 2 ) 1 壳聚糖溶液的配制 称取1 9 壳聚糖，然后加入8 m l 0 1 m o l l 盐酸溶液，后加入9 2 m l 重蒸水，用磁子 剧烈搅拌，使壳聚糖完全溶解，形成粘稠的、透明的、均匀的壳聚糖溶液。 ( 3 ) 碘标准溶液的配制 称取6 5 91 2 和2 0 9k i 置于小研钵或小烧杯中，加水少许，研磨或搅拌至1 2 全部溶 解后，转移入棕色瓶中，加水稀释至一升，塞紧，摇匀后放置过夜标定。用时稀释2 0 倍。 释放n 0 壳聚糖衍生物的合成及动力学研究 第三章实验方法及原理 3 1 壳聚糖主要物理参数的测定 3 1 1 壳聚糖粘均分子量的测定例 ( 1 ) 实验原理 在高聚物的研究中，分子量是一个不可缺少的重要数据。因为它不仅反应了高聚物 分子的大小，并且直接关系到高聚物的物理性能。但与一般的无机物或低分子的有机物 不同，高聚物多是一个平均分子量。高聚物分子量的测定方法很多，比较起来，粘度法 设备简单，操作方便，并有很好的实验精度，是常用的方法之一。 实践证明，在同一温度下，高聚物溶液的粘度一般比纯溶剂的粘度大，为了比较这 两种粘度，引入了增比粘度概念，以仉。表示，同时为了消除高聚物分子问内摩擦的作 用，当溶液无限稀释，即c o 时，取比浓粘度( c ) 的极限值为【i 】，同时l n q , c 的极限也是 纠，【们称为高聚物溶液的特性粘度，它主要反映了高聚物分子与溶剂分子 之间的内摩擦作用。所以通过溶液l n 仉c c 及c c 作图，可求出【们数值。 根据常用的半经验的马克( h m a r k ) 非线性方程 切】= 肼4( 3 1 ) 式中m 为高聚物的分子量；k 和瑾为常数，与温度、高聚物、溶剂等因素有关，可通 过其他方法求得。所以，高聚物分子量的测定最终归结为溶液特性粘度的测定。 考虑到通常测定是在高聚物的稀溶液下进行的，溶液的密度p 与纯溶剂的密度岛 可视为相等。溶液的相对粘度可表示为： ”暑= 嚣a 寺 ( 3 - 2 ) 粘均分子量的测定最终转换为流出时间的测定。 ( 2 ) 实验方法 取一定量的壳聚糖先溶解于6 9 醋酸中，加入适量的水，搅拌下加入1 1 6 8 9 氯化钠， 河南工业大学硕士论文 待壳聚糖完全溶解后，定容于1 l 的容量瓶中，用3 g 玻璃漏斗减压过滤。用移液管取 1 5 m l 滤液轻轻注入到洁净、干燥的乌氏粘度计粗管中，将粘度计垂直固定于2 5 c 1 约水 浴中恒温1 5 m i n 后，用秒表准确地测定溶剂和不同浓度的壳聚糖溶液在乌氏粘度计中留 出时间。实验时，测定两次，求平均值用于数据处理。 3 1 2 壳聚糖脱乙酰度的测定 ( 1 ) 实验原理 按照线性滴定法的原理，当用强碱滴定强酸时，体积与电位的关系如下： ，( 矿) ：k y ；了v o + v ( c h + 一c o w ) l b c ，= ( c a i r o - - 1 c b v o ) x 0 0 1 6 1 0 0 dd=203瓦x孺c吼42x l 。 c 肼，+ 1 6 ( 3 3 ) ( 3 _ 4 ) ( 3 5 ) 式中，( 矿) - a j o h a n s s o n 函数表达式；k 一为滴定达到等电点时n a o h 标准溶液的 体积( m l ) ；v 滴定时使用的n a o h 标准溶液的体积( m l ) ；一为加入的盐酸标 准溶液的体积和( m l ) ；c b 一为n a o h 标准溶液的摩尔浓度( m o l l ) ；c h + 矿离子 浓度( 由测得的p h 值得出) ；c o a ，o h 一的浓度( 本试验体系中可忽略) 通过测定加k n a o h 标准溶液的体积v 与相应得p n 值，根据式3 - 3 可计算出，( 矿) ， 同时通过以f ( v ) 为纵坐标，矿为横坐标作图，在x 轴上的截矩即为第一化学计量点圪。 根据酚酞变色得到，然后根据式( 3 - 4 ) 得到的氨基含量，由式( 3 5 ) 可以求得 脱乙酰度。 ( 2 ) 测定方法 准确称取1 0 5 ( 2 烘干至恒重的壳聚糖样品0 3 9 ，置于2 5 0 m l 三角锥形瓶中，加入 o 1 m o l l 盐酸标准溶液3 0 m l 在2 0 2 5 c 搅拌2 h ，再加入5 0 m l 去离子水。溶解好的 样品中插入p h 复合电极，边搅拌边缓慢加入标准n a o h 溶液。刚开始加入n a o h 溶液 时无需记录p h 值变化，待p h 值达到2 附近时，每加入适量体积的n a o h 溶液，记录 p h 值，直到p h 值到达3 附近，一共记录5 至6 组数据。 释放壳聚糖衍生物的合成及动力学研究 3 1 3 壳聚糖含水量的测定删 ( 1 ) 测定方法 将分别编号为1 、2 的两个干燥铝盒放在恒温烘箱内于1 0 5 士2 干燥l h ，取出后 放干燥器中冷却，用分析天平准确称量，再烘1 h ，直到恒重( 两次质量差不大于0 0 0 5 9 ) 。 在烘干至恒重的铝盒中放入两份壳聚糖，每份2 9 左右，准确到0 0 0 0 1 9 。 放置恒温干燥箱中，1 0 5 。c 烘2 h ，反复烘至恒重为止。 ( 2 ) 计算公式 水分( ) = 塑噬器产x 1 0 。 ( 3 6 ) 3 2 巯基壳聚糖的合成及测定 3 2 1 壳聚糍半胱氨酸衍生物的合成 ( 1 ) 合成原理 hn h 2 o hn h 2 + _ 陋仁叫3 ( d c c ) hn h l c = o 1 r n i l 2 s h h n i - 1 2 ”辄 n i - 1 2 河南工业大学硕士论文 - n = c = n _ ) o h l 酬y m 盯弋l d r 仨啦 呦飞o + 且：- h w “1 p 。i y 撇， o 图3 - 1d c c 催化条件下壳聚糖和半胱氨酸反应路线 f i g 3 1s y n t h e t i c p a t h w a y f o r t h ec o v a l e n t a t t a c h m e n t o f l c y s t e i n e t oc m t o s a na n dc a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s em e d i a t e db yd e c ( 2 ) 合成方法 称取2 9 半胱氨酸和0 0 5 9d c c ，再加入1 0 m ll 的壳聚糖溶液，在2 5 反应l o b ， 反应完毕后离心、过滤，用清水充分冲洗至中性，最后在低于4 5 。c 条件下干燥。 3 2 2 壳聚糖巯基乙酸衍生物的合成 (