植物基因克隆的方法.ppt

植物基因的克隆,基因2.基因克隆3.基因克隆的目标,基因：为RNA或蛋白质编码的核苷酸序列。基因克隆：利用体外重组技术，将特定基因和其它DNA顺序插入到载体中。克隆目标：识别、分离特异基因并获得基因的完整全序列，确定染色体位，阐明基因的生化功能，明确其对特定性状的遗传控制关系。,植物基因克隆的方法,序列克隆2.依据序列同源性克隆基因3.人工合成并克隆基因4.表型克隆5.功能克隆6.定位克隆7.转座子标记法,方法一：根据已知基因的序列设计并合成一对引物，从植物中提取DNA进行PCR扩增，扩增的片段经纯化后连接到合适的载体上，用酶切和序列分析检测重子，并与已知基因序列进行比较。,序列克隆,1.1根据已知基因的序列,方法二：在其它种属的同源基因被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后以已知的基因序列作为探针来筛选目的克隆。例子：根据甜菜碱醛脱氢酶基因序列克隆菠菜碱醛脱氢酶基因、自交不亲和基因、花形态建成基因。,1.2根据DNA测序结果,方法一:利用Adams等建立的表达序列标记(EST)寻找新基因.从组织或细胞特异性的cDNA文库中随机挑选克隆5端或3端部分序列(EST,约400bp)测定GeneBank/EMBL检索检测所测序列或氨基酸序列与已知序列是否同源发现新基因,方法二:利用Velculescu等建立的基因表达连续分析法(SAGE).,此种方法只需检测基因表达库中每一cDNA的很短序列(9bp),建立基因表达图,根据基因表达图就可以发现新基因.,cDNA测序法只能分离特定时空下表达的基因,且不能分析基因内和基因间的调控序列,克隆出的新基因的功能也有待鉴定.,方法：根据已知的氨基酸或核苷酸序列，采用植物偏爱的密码子，人工合成并克隆该基因。（可对基因进行改造）例子：根据蜘蛛毒素的氨基酸序列，人工合成并克隆了此肽的基因。人工合成Bt基因。,人工合成并克隆基因,方法：利用植物的表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因。此方法试图把表型与基因结构或基因表达联系起来，从而分离特定表型相关基因。不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就直接分离该基因。例子：利用表型差异从拟南芥中克隆出赤霉素合成酶基因。,表型克隆（phonetypicalcloning）,技术支持：差别筛选法（differentialscreening）扣除杂交技术（subtractivehybridization）mRNA差异显示技术（mRNAdifferentialdisplayreversetranscription-PCR）代表性差异显示（representationaldifferenceanalysis）抑制性扣除杂交（suppressionsubtractivehybridization）,局限性：,表型克隆技术普遍存在着依赖于PCR技术、重复性较差、加阳性率高、对实验材料要求较高、材料间不能存在过多的差异，结果不便确证等缺点。,定义：根据性状的基本生化特性这一功能信息，在鉴定和已知基因的功能后克隆.方法：纯化相应的编码蛋白构建cDNA文库或基因组文库筛选基因。特点：用基因表达的产物蛋白质来克隆基因.,功能克隆（functionalcloning）,1、将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，推测可能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文库中筛选编码基因。2、将相应的编码蛋白制成相应的抗体探针，从文库中筛选相应基因并克隆。3、根据mRNA序列设计相应的寡核苷酸引物,对核DNA或cDNA进行PCR扩增.,1.1根据基因表达的蛋白质,通过阳性克隆或PCR扩增产物的序列分析鉴定分离基因.,关键:首先应根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质进行分离纯化.要求分离一个纯度很高的蛋白质.局限性:大多数基因产物至今还不清楚,即使知道了也不能纯化足够的蛋白质供氨基酸测序或制备抗体.,1.2根据基因的表型突变互补功能,植物的许多基因与细菌或酵母的突变体互补.如拟南芥的cDNA文库可与酵母的8个营养缺陷突变体互补.根据这一特性可分离一些基因,如来自蛋白激酶基因和葡萄糖载体基因等.利用此法分离基因需做大量的转化工作,且转化细胞中突变体频率较低.,例子,1、分离纯化了黄瓜花叶病毒、马铃薯x病毒等，并克隆了编码这些病毒外壳蛋白的cDNA基因。2、构建天麻cDNA文库，制备抗体探针成功地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因cDNA克隆。,定义：根据遗传连锁分析，染色体步移将基因定位到染色体的一个具体位置上后不断缩小筛选区域进而克隆该基因。连锁分析：通过基因与DNA标记之间的重组系数估计两者之间的距离，若某种性状的基因与DNA标记在子代不分离，即有连锁在一起的趋势。因此可将与某一DNA标记连锁的基因在染色体上定位。,定位克隆(positionalcloning),原理,用该法分离基因是根据功能基因在基因组中都具有相对稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因定位到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小侯选区域，进而克隆该基因。,技术支持：RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SNP等可将待测基因相对准确地定位，利用已知的基因可分离与之连锁的未知因。,方法：构建基因组文库，用已知的A基因为探针，从文库中筛选出与其有同源序列的a克隆，再以a克隆为探针从文库中筛选出与其有同源序列的b克隆，依次类推最后筛选出未知基因并把它分离出来。,定位克隆技术主要步骤,1、筛选与目标基因连锁的分子标记利用目标基因的近等基因系或分离群体分组分析法（BSA）进行连锁分析，筛选目标基因所在局部区域的分子标记。2、构建并筛选含有大插入片段的基因组文库。用与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库，得到阳性克隆。常用载体：柯斯质粒、酵母人工染色体（YAC）、PI、BAC、PAC等。,3、构建目的基因区域跨叠克隆（contig）以阳性克隆的末端作为探针筛选基因组文库，并进行染色体步行，直到获得具有目的基因两侧分子标记的大片段跨叠群。4、目的区域的精细作图通过整合已有的遗传图谱和寻找新的分子标记，提高目的基因区域遗传图谱和物理图谱的密度。,5、目的基因的精确定位和染色体登陆利用侧翼分子标记分析和混合样品作图精确定位目的基因。接着以目的基因两侧的分子标记为探针通过染色体登陆获得含有目的基因的阳性克隆。6、外显子的分离、鉴定阳性克隆中可能含有多个候选基因，用筛选cDNA文库、外显子捕捉和cDNA直选法等技术找到这些候选基因，再进行分离，时空表达特点，同源性比较等分析确定目的基因。,定位克隆的优点和局限性,优点：不必知道基因产物的功能，也不需要知道产生某表型的生化、生理和病理过程。局限性：1、基因定位依赖分子标记。2、构建跨叠克隆群困难。3、精细作图成本高。4、不能提供基因的功能信息。,例子,已在番茄、水稻、玉米、大豆、大麦、烟草等植物中发现了与抗病基因紧密连锁的RFLP标记，并已克隆到相关抗病基因。如番茄Pto基因、水稻Xal21基因。,转座子：是可以从一个基因位置转移到另一位置的DNA。转座子标记法：是把转座子作为基因定位的标记和通过转座子在染色体上的插入和嵌合来克隆基因。,转座子标记法（transposontagging）,原理：,在转座过程中，原来位置的转座子并未消失，发生转座的只是转座子的拷贝。基因发生转座可引起插入突变，使插入位置的基因失活并诱导产生突变型或在插入位置上出现新的编码基因。通过转座子上的标记基因（如抗药性等）就可以检测出突变基因的位置和克隆出突变基因来。,利用转座子克隆植物基因的操作步骤：,转座子与选择标记构建成含有转座子的质粒载体把转座子导入目标植物利用Southern杂交等技术检测转座子是否从载体质粒中转座到目标植物基因组中转座子插入突变的鉴定及其分离。转座子有玉米的Ac/Ds、Mu、En/SmP等.,局限性,利用转座子标签技术对尚未发现转座子的植物进行基因克隆时，需要将异源的转座子导入该植物，但由于转座子在不同植物中转座的频率和活性相差很大，并且需要筛选大量的个体来鉴定转座子突变个体，植物基因组中多拷贝基因