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hplc 法快速检测大豆籽粒中大豆低聚糖的含量王晓岩 1， 郝再彬 1， 邱丽娟 2*(1.桂林理工大学，桂林 541002；2.中国农业科学院作物科学研究所， 国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程/农业部作物种质资源利用 重点开放实验室，北京 100081)摘要： 建立了高效液相色谱法同时快速测定大豆籽粒中大豆低聚糖的 3 种组分蔗糖、棉籽糖和水苏糖含量的检测方法。采用 0.5 量程示差折光检测器，4.6 mm250 mm，5 m 瑞典 kromasil-nh2 原装进口柱，流速 1.0 ml/min，检测温度 35 ，流动相乙腈水=6040，10 l 进样量。在上述检 测条件下，最低检出限蔗糖为 0.0610-6 g、棉籽糖为 0.0710-6 g、水苏糖为 0.0610-6 g，标准曲 线相关系数分别为 0.9965、0.9996 和 0.9994，平均回收率分别为 99.3%、94.7%和 95.6%，rsd (n=10) 分别为 1.73%、2.01%和 0.80%。该方法简单，快速，准确，可用于大豆籽粒中低聚糖含量的快速 分析。关键词 ：低聚糖；大豆食品；高效液相色谱中图分类号 ： ts 207文献标志码 ： a文章编号 ： 1005-9989(2010)07-0287-04the method for rapid detection of soybean oligosaccharidecontent by hplcwang xiao-yan1, hao zai-bin1, qiu li-juan2*(1.guilin university of technology, guilin 541002; 2.the national key facility for crop generesources and genetic improvement(nfcri)/key lab of crop germplasm utilization(moa), institute of crop science, chinese academy of agricultural sciences, beijing 100081)abstract: established a high-performance liquid chromatography method for detecting the content of sucrose、raffinose and stachyose in soybean grains. use refractive, index detector with range 0.5, kromasil-nh2 column imported from sweden, and its model is 4.6 mm 250 mm 5 m, the velocity of flow is 1 ml/min, the detection temperature of column is 35 , and the acetonitrile: water=6040. under the conditions of the above-mentioned test, the minimum detection limit of source is 0.0610-6 g, the minimum detection limit of raffinose is 0.0710-6 g, and stachyose is 0.0610-6 g. the correlation coefficients of standard curves were 0.9965, 0.9996 and 0.9994. the average recoveries were 99.3% , 94.7% and 95.6% . the rsd of samples with 10 tests are 1.73% , 2.01% and 0.80%. the method is simple, rapid, accurate, and can be used in the oligosaccharide content in soybean quick analysis.key words: oligosaccharides; soybean food; hplc收 稿 日 期 ： 2009-10-19* 通讯作者基 金 项 目 ： 国家“863”重点项目(2006aa100104，2006aa100110)；国家“十一五”科技支撑计划课题(2006bad13b05)。作 者 简 介 ： 王晓岩(1982)，安徽人，硕士研究生，研究方向为活性物质的开发与利用。287食 品 科 技food science and technology食品安全与检测2010 年 第 35 卷 第 7 期大豆低 聚 糖 (sbos)是 大 豆 中 可 溶 性 糖 类 的 总称，主要由蔗糖、棉籽糖和水苏糖组成。3 种糖组 分在成熟大豆中的干基含量分别为 5%、1%、4%，具有稳定性高、安全性好、甜度低、热值低和防龋齿等良好的功能特性，是一种功能性低聚糖1-4。其主要功能包括：促 进 双 歧 杆 菌 的 增 值 ； 防 止 便 秘 和 腹 泻 ； 保 护 肝 脏 功 能 ； 降 低 血 压 ； 增 强 免疫力；抗癌；延缓衰老；抑制 病原菌的增长等作用5-12。随 着经济的发 展 和 生 活 的 提 高 ， 我 国 居 民 的健康状况有了良好的改善，但由于饮食结构的不合理，如脂肪、糖类摄入量过多等，各种常见病的患病率增加，功 能性糖的引入可部分代替 或完全代替食品中的蔗糖，以适于特殊人群的需要13-15。目 前 ， 大 豆 低 聚 糖 的 测 定 方 法 有 纸 色 谱 法 、 薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法。检 测大豆低聚糖的方法中较为准确的是气相色谱法 和高效液相色谱法。其中气相色谱法需要将样品制备成易挥发且对热稳定的衍生物后才能进行测 定，而液相色谱法可以直接对提取出的低聚糖进 行检测，样品的处理比较简单，并且减少了样品 糖分的损失16，因此，本实验对高效液相色谱法检测大豆低聚糖进行了研究。以往的研究中，使得 低聚糖的成分完全分离的保留时间大约在 25 min， 分离较慢，不利于对批量种质的检测，为此，本 文通过对检测条件的优化，建立了简单快速同时 分析低聚糖中 3 种成分含量的高效液相色谱方法， 可使低聚糖的 3 种成分在 12 min 内有效分离开来，效果较好，且其保留时间的大幅缩短在文献中未 见报道，此方法简单、快速、准确，可作为常规 方法使用。sigma 公司。1.3色谱条件色 谱 柱 ： kromasil - nh2 色 谱 柱 ( 4 . 6 mm 250 mm，5 m)；流动相(超声波振荡脱气 20 min)，流 动相采用乙腈-水体系(6040，v/v)，流速 1 ml/min； 柱温 35 ；进样量为 10 l；检测系统为 ri 2000 示差折光检测器。1.4样品和标准 品的制备1.4.1标样的制备准确称取蔗糖、棉籽糖和 水 苏 糖 各 250 mg， 先 用 10 ml 纯 水 溶 解 ， 后 用 15ml 乙腈定容至 25 ml，即为 10 g/l 的储备液。分别从储备液中精确移取一定量于 10 ml 的容量瓶 中，用流动相定容后即配制成一系列浓度的标样， 溶液经 0.45 针头式过滤器过滤，备用。1.4.2样品的制备精确称取过 100 目筛的大豆粉样品 1.000 g，用 10 ml 70%的乙醇溶解，以微 波 浸 提 法 提 取 ， 微 波 浸 提 2 min， 将 浸 提 液 于 高 速 冷 冻 离 心 机 以 4000 r/min 离心 10 min。取上 清 液经 0.45 滤膜 过滤，取 10 l 样 液 进 行 hplc 检测。结果与分析22.1 流动相的选 择采用乙晴水的比例分别为 5545、6040、6535、7030 和 7525 5 种组合进行实验研究，流速1 ml/min，考察蔗糖、棉籽糖和水苏糖 3 种组分的分离度及保留时间。结果表明, 随着流动相中乙腈 比例的增加，低聚糖 3 种成分的分离度降低，保留时间缩短。经实验考察可知，选用乙腈水=6040(v/v)的比例，既可以使大豆低聚糖的 3 种组分进行有效分离，又可尽量缩短分析时间，且整个分 离测定过程可在 12 min 内完成，并且，在所查文 献中未见保留时间如此短的报道，该比例有效地 缩短了保留时间，实现了快速分析的目的。材料与方法11.1主要仪器agilent 1100 高效液相色谱：安捷伦科技有限 公司；ri 2000 示差折光检测器：labindex 仪器有限公司；ga-3200dts 超声变频清洗机：无锡上佳生 物 科 技 有 限 公 司 ； mhr -02 实 验 室 用 微 波 炉 ： 青岛迈可威微波应用技术有限公司；dl-01 溶剂 过滤器：天津东康科技有限公司。1009080706050403020100试剂乙腈：色谱纯，fisher scientific 公司；乙醇： 分析纯，北京化工厂；实验所用的水为娃哈哈纯 净 水 ； 低 聚 糖 标 准 品 ( 蔗 糖 、 棉 籽 糖 、 水 苏 糖 ) ：1.20123 45 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15时间/min标准品的色谱图谱图 1288电压/mv2.5232.7403.1655.9327.0238.10710.13211.498蔗糖棉籽糖水苏糖食 品 科 技food science and technology食品安全与检测2010 年 第 35 卷 第 7 期1 g/l。将各浓度的 标样在同等 条件下连续 进样 5次，将 5 次所得的峰面积取平均值，该平均值即 为相应浓度下对应的峰面积。以峰面积(y)为纵坐标、标准液 浓度(x)为横坐 标建立标准 工作曲 线 ，得到蔗糖、棉籽糖和水苏糖的线性回归方程和相 关系数。按实验所选定的色谱条件，分别进一 定体积(该实验进样为 10 l)的标准样品，根据极限噪音3 倍的方法可分别计算出蔗糖、棉籽糖和水苏糖的 检出限，如表 1 所示。表 1 蔗糖、棉籽糖和水苏糖的线性方程、相关系数及检出限10090807060504030201000 1 2 3 4 56 7 8 9 10时间/min样品的色谱图谱11 12 1314 15图 22.2 柱温的选择采用示差折光检测器测定低聚糖时 ，温度直 接影响基线的稳定性，实验过程须经程序恒温控制。综合考虑缩短样品保留时间、考虑氨基柱所能 承受的最高 温度和保证 较 高 的 柱 效 ， 通 过 30、35、40、45 4 个柱温比较(图 3 及图 4)，可以看 出，随着温度的升高，3 种低聚糖组分的保留时间缩短，且随着温度的升高，理论塔板数有先升高 后降低的趋势。由于温度过高会缩短氨基柱的使 用寿命，且理论塔板数越大表明柱效越高，色谱 峰的峰形就会越好。因此，经综合考虑，在保证 较好的保留时间及较高的柱效情况下，选择适宜 的检测柱温为 35 。项目线性方程相关系数r检出限/(g/l)蔗糖棉籽糖 水苏糖y=93403x+6631.6y=82322x-6615.4y=82754x-314.630.99660.99960.99940.060.070.07注：y 为蜂面积；x 为浓度。从 3 种糖分的回归方程及其相关性可以看出， 大豆低聚糖的 3 种组分在本实验的色谱条件下能 够呈很好的线性关系，达到实验的要求。精密度的测 定准确称取过 100 目筛的大豆粉样品 0.5000 g， 以 70%的乙醇，料液比为 110 进行微波(t=2 min) 提取，将浸提液于高速冷冻离心机中以 4000 r/min 离心 10 min 和 0.45 m 滤膜过滤后上样进行测定， 进样量为 10 l，连续测定 10 次，记录各色谱峰 峰面积并进行统计分析，根据蔗糖、棉籽糖和水 苏糖的相对标准偏差(见表 2)。本实验的色谱检测 条 件 下 ， 蔗 糖 、棉 籽 糖 和 棉 籽 糖 的 rsd 分 别 为1.7309% 、2.0181% 和 0.8014% ， 样 品 的 多 次 检 测 具有良好的重现性，精密度较高。2.41412108642030 32.5 35 37.540 42.5 45检测柱温 /图 3 标准品的 3 种成分对应的保留时间随温度的变化表 2大豆低聚糖含量测定的精密度11000编号蔗糖/(g/l)棉籽糖/(g/l)水苏糖/(g/l)1000012345678910average sd rsd/%5.25935.20315.23335.12465.18985.26855.24815.4715.25595.19245.24460.09081.73091.09061.1281.10641.09021.13871.10951.13181.08311.08561.07691.10410.02232.01814.17764.18384.22694.18294.25724.27374.24814.21954.24944.23064.2250.03390.80149000800070006000500030 32.5 35 37.5 40 42.5 45检测柱温 /图 4 标准品的 3 种成分对应理论塔板数随温度的变化2.33 种 低 聚 糖 标 准 工 作 曲 线 的 绘 制 及 最 低 检 出 限的 测定分别移取一定量的蔗糖、棉籽糖和水 苏糖储 备液进行稀释成下列浓度：3.5、2.5、1.75、1.25、289电压/mv保留时间/min理论板数2.6072.7324.0823.2234.498 4.7575.1325.4825.7486.2656.548 6.9487.2327.7488.6489.63210.765蔗糖 棉籽糖 水苏糖蔗糖 棉籽糖 水苏糖食 品 科 技food science and technology食品安全与检测2010 年 第 35 卷 第 7 期准确称取标准品为大豆粉中 3 种糖分含量的 50%、100%和 150%各 2 份加入样品 中，进行加 标 回 收 率实验，实验结果如表 3 所示。6 次重复测定结果平均回收率蔗糖为 99.3%、2.5加标回收率 测定以大豆粉为实验材料，准 确称取过 100 目 筛的大豆粉 1.000 g，以 70%的乙醇微波提取，料液比 为 1 10， 按 前 面 方 法 提 取 并 进 行 hplc 检 测 。表 3 样品中 3 种组分的加标回收率测定结果(n=6)蔗糖棉籽糖水苏糖编号加入量/实测值/g回收率/%加入量/实测值/g回收率/%加入量/实测值/g回收率/%123456平均回收率78.1/75.878.1/82.1104.2/103104.2/99.9130.2/128.1130.2/131.397.1105.198.895.898.4100.899.316.8/16.116.8/15.322.4/20.122.4/20.228/25.428/15.995.891.1107.690.290.792.594.764.6/61.264.6/59.886.2/82.886.2/78.8107.7/111.6107.7/101.194.792.696.191.4103.693.995.6棉籽糖为 94.7%、水苏糖为 95.6%。实验证明，该方法的准确度较高，其准确度满足测定的要求。6王良东,陈建文,吴嘉麟.功能性低聚糖制备j.粮食与油脂,2008,(7):38-39 刘军,栾居科,李文涛.大豆低聚糖、乳清蛋白的提取j.中 国油脂,2002,27(4):45l t black, e b baglet. determination of oligosaccharides in soybeans by high pressure liquid chromatography us ing an internal standard j. journal of the ameracan oil chemists society,55:228罗予,毛理纳,蔡访勤.大豆低聚糖对肠道双歧杆菌和肠 杆菌的促生长作用j.现代生物医学进展,2007,7(3):399-400 权静,卢定强,张筱,等.大豆功能性成分的研究现状j.大 豆通报,2004,(3):28-29 史宣明,赖本丽