（微生物学专业论文）黑曲霉乳糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达.pdf

摘要 乳及乳制品是人类改善营养、增强体质的理想食品牛乳中含有5 左右的乳 糖，我国人群中有很大一部分人( 约7 5 曲5 ) 患有乳糖不耐受症，严重影响乳及 乳制品的推广乳糖酶能将乳制品中的乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，利用乳糖酶生 产低乳糖制品或口服酶制剂，能够有效解决“乳糖不耐症”问题。 本研究从一株产乳糖酶的黑曲霉a s p e r g i l l u sn i g e rd l l l 6 中克隆获得乳糖酶 d n a 和c d n a 序列，经过序列分析显示，乳糖酶基因d n a 序列长3 3 6 8b p ，其中 含有8 个内含子，c d n a 编码区长2 9 6 7b p 。g c 含量为5 2 8 ，共编码9 8 8 个氨基 酸，氨基酸序列中共含有1 2 个潜在的n 糖基化位点此基因已在g e n b a n k 中注 册，登录号为：a c c e s s l 0 nn o e f l 0 3 1 4 1 将乳糖酶e d n a 序列克隆到分泌型酵母表达载体p p i c 9 k 上，电击转化p i c h i a p a s t o r i sg s l l 5 ，经过m m 、m d 平板筛选出1 5 6 株g s l l 5i - i i s + m u t + 表型转化子，并 对重组酵母进行乳糖酶基因的p c r 分析，选取6 5 株p c r 检测阳性的酵母转化子进 行乳糖酶活性筛选，获得一株高效表达乳糖酶的重组酵母工程菌，将此菌株命名为 l a c 4 7 ，对其进行摇瓶培养，甲醇诱导1 2d 后乳糖酶活力达到2 7 1 1 5u m l ，表达 量为o 6 6m g m l 将发酵液经过超滤浓缩、透析、d e a e - 5 2 纤维素离子交换层析及s e p h a c r y l t m s - 2 0 0 分子筛层析进行分离纯化。纯化后该酶经p a g e 电泳鉴定为单一条带，达到 电泳纯，单亚基分子量为1 3 0 - 1 4 0k d ，比活力从租酶液的2 7 5 5u m g 提高到5 3 2 9 u r a g 对表达的乳糖酶进行了酶学性质的研究，其酶促反应最适温度为6 0 ，6 0 下 保温lh 酶活基本不变；最适反应p h 在3 o q 2 之间，并且p h 稳定性较好，在 p h 2 5 胡0 范围内较稳定，尤其在p h 7 5 9 0 范围内处理2d ，酶活均保持在9 4 以 上，说明该酶有很好的耐碱性所试离子和化学试剂对酶促反应的影响不大，其中 k 7 p b 2 + ，m g + ，f c r 略有激活作用，s d s 略有抑制作用，e d t a 对该酶影响不显 著，从而可以推知这是一种不依赖于金属离子的酶蛋白。6 0 ，p h 3 8 条件下，以 o n p g 为底物，采用双倒数作图法，测定其j 0 值为2 4 3m m o l l ，。值为1 5 2 l u n o l m i n 。 关键词：乳糖酶；克隆；毕赤酵母；表达 ， c l o n i n ga n d e x p r e s s i o n o f l a c t a s e f r o m a s p e r g i l l u s n i g e r i n p i c h i a p a s t o r i s a u t h o r l is h u - j u a a s u p e r v i s o r ：j 1 ay i n g - m i n ；g u or u n - f a n g m a j o r ：m i c r o b i o l o g y a b s t r a e t t h em i l ka n do t h e rd a i r yp r o d u c 缸a r et h ei d e a lf o o d sf o ri m p r o v i n gm a l l s c o n s t i t u t i o n t h e r ei sa b o u t5 l a c t o s ei nt h em i l l 【m a n yp e o p l e ( a b o u t7 5 - 9 0 ) p e r f o r m e d l a c t o s ei n t o l e r a n c e “i nc h i n a , w h i c ha f f e c t e dt h ea p p l i c a t i o no fd a i r y p r o d u a s t h eb e t a - d - g a l a c t o s i d a s e ( e c3 2 1 2 3 a l s or e f e r r e dt oa sl a c t a s e ) h y d r o l y s i s t h ed i s a h a r i d el a c t o s et og l u c o s ea n dg a l a c t o s e l a e t a s e 啪b eu s e df o rt r e n a n a n to f ”l a c t o s ei n t o l e r a n c e ”a n dp r o d u c t i o no f l o w - l a c t o s em i u c d n aa n dc d n as e q u e n c e so fl a c t a s ef r o ma s p e r g i l l u sn i g e rd l i1 6 帆i s o l a t e d b yp c ra n dr t - p c rm e t h o d si nt h et h e s i s s e q u e n c e sa n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h ed n a s e q u e n c e sw e r e3 3 6 8b pc o n t a i n i n ge i g h ti n t r o n s t h ec d n aw a s2 9 6 7b p ，e n c o d i n ga p r o t e i no f9 8 8a m i n oa c i d s 1 2p o t e n t i a ln g l y c o s y l a t i o ns i t e sw e l ea s s u m e d t l l eg e n e h a db e e nr e g i s t e r e di ng e n b a n k 、i t i ia c c e s s i o nn o e f l 0 3 1 4 1 t h el a c t a s eg e n ew a sc l o n e di n t op p i c 9 ka n dc o n s t i t u t e dt h er e c o m b i n a n tv e c t o ro f p p i c 9 k - l a c 1 5 6t r a n s f o r m a n t s w c i es e l e c t e di nm d m mp l a t e sa n d6 5 p o s i t i v e t m n s f o r m a n t ss c r e e n e db yp c ra n a l y s i sw c i eu s e df o rd e t e r m i n i n gt h el a a a s ea c t i v i t y a h i g h - e x p r e s s i o ns u - a l nl a c 4 7w a so b t a i n e da n dt h er e c o m b i n a n tl a c t a s ew a se x p r e s s e d h i g h l y t h ee x p r e s s e dp r o d u c th a dt h en o r m a lb i o a c t i v i t y t h ee n z y m ea c t i v i t yi nt h e m e d i u m w a sr e a c h e d 2 7 1 1 5 u m l a f t e r i n d u c i n g b y m e t h a n o l f o r l 2 d l a c t a s ew a sp u r i f i e db yu s i n gu l t r a f i l t r a t i o n , d i a l y s i s ，d e a e - c e l l u l o s ei o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y a n ds e p h a c r y l l ”s - 2 0 0 9 e l f i l t r a t i o n t h er e s u l t o f s d s - p a g es h o w e d a s i n g l ep r o t e i nb a n dw i t h1 3 0 - - 1 4 0k d t h es p e c i f i ca c t i v i t yo fl a c t a s eh a dr e a c h e d5 3 2 9 u m g t h er e c o m b i n a n te x p r e s s e dl a c t a s es h o w so p t i m u mp hv a l u eo f3 0t o4 2a n dg o o d p hs t a b i l i t , f r o m2 5 t o9 0 ，o p t i m u mt e m p e r a t u r ew a s6 0 ca n dg o o dt e m p e r a t u r e s t a b i l i t ya t6 0 c m o s tm e t a li o n sa n dc h e m i c a l sh a v en oe f f e c to nt h el a c t a s e k + ，p b 2 + ， m g ：z + ，f e 3 + c a ns l i g h t l ya c t i v a t et h ee n z y m e ，a n ds d sw o u l ds l i g h t l yi n h i b i tt h ea c t i v i t y a c c o r d i n gt ot h ee f f e c to fe d t a ，w ec o n c l u d e dt h a tt h el a c t a s ed o e s n 。ts l r o n g l yd e p e n d o nm e t a li o n s a t6 0 ca n dp h 3 8 t h ek mw a s2 4 3m m o l la n dt h ev m a xw a s1 5 2 p m o f m i n k e yw o r d s ：l a c t a s e ；c l o n i n g ；p i c h i a p a s t o r i s ；e x p r e s s i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑些盔些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名；碴瓢娟签字日期：跏7 年i 月昭日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑些盎些盘茎有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑些盛些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名绣嘏娲 签字日期：o 7 年f 月j g 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 黜名：砺葵甜 签字日期：2 旷吵年月，纩日 电话： 邮编： 黑曲霉乳糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 1 1 乳糖酶的应用及研究进展 1 引言 乳糖酶( l a c t a s e ) ，系统名为卢d 半乳糖苷半乳糖水解酶够d g a l a c t o s i d e g a l a c t o h y d r a s e ，e c3 2 1 2 3 ) ，或简称卢半乳糖苷酶伊g a l a c t o s i d a s e ) l i l 。它是一类催化 特殊类型的糖苷键劳半乳糖苷类化合物中卢半乳糖苷键发生水解断裂的酶。该 酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，并具有半乳糖苷的转移作用，在乳糖分子的半 乳糖一侧连接l 一个半乳糖，生成低聚半乳糖( g a l a c t o o l i g o s a c c h a r i d e ，g o s ) 2 。 乳及乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维 生素和多种矿物质，尤其是钙含量高，钙磷比例适当，易被人体消化吸收，还含有 免疫球蛋白等抗病因子，所以乳及乳制品有“近乎完美的食物”的美称，是人类改 善营养、增强体质不可缺少的理想食品i ”j 牛乳中含有4 7 5 o 的乳糖，是乳中 最主要的碳水化合物，占其总糖量的9 8 以上，是牛乳能量的主要来源。中国人群 中有很大一部分患有“乳糖不耐症”，严重影响乳及乳制品的推广【w 】 所谓“乳糖不耐症”是指由于人体小肠内缺乏分解乳糖的乳糖酶，饮用牛乳或 乳制品后不能将乳糖消化吸收，乳糖就保留在肠腔中，造成等渗性水潴留和结肠细 菌酵解乳糖产生多种气体及短链脂肪酸，从而形成腹胀、捧气增多、腹痛、腹泻等 胃肠症状】。世界上除了高加索人种以外，绝大多数人口都存在着不同程度的乳糖 酶缺乏，而且有明显的种族差异，其中亚洲人和非洲人的发生率达7 5 - 一1 0 0 。我 国汉族成人乳糖酶缺乏的发生率高达7 5 0 o - - , 9 5 7 ，3 1 3 岁儿童乳糖酶缺乏发生率 为8 7 ，儿童乳糖酶下降的年龄在7 8 岁p “j “乳糖不耐症”的存在很大程度上 限制了人们对乳及乳制品的摄入，会产生一系列不良影响。其长期危害在儿童易表 现为钙吸收不良、腹泻、软骨病、体重低下及生长发育迟缓，在老年人尤其是老年 妇女易表现为骨质疏松等症状。患者除了出现腹泻、肠梗塞和胀气等现象，还会造 成肠道蠕动加快，减少蛋白质和无机盐的营养吸收【m 1 7 1 。 利用乳糖酶水解牛乳或乳制品中的乳糖，生产低乳糖制品( 如乳糖水解乳、低 乳糖奶粉等) 可以有效地消除人体对乳糖的不耐受症状，对于发展我国乳品工业， 提高人们的健康水平具有十分重要的意义 1 “2 6 1 此外，乳糖酶在食品工业中还有许多其他用途。利用乳糖酶水解乳糖的能力， 能够提高浓缩乳制品的甜度：克服奶粉、炼乳、冰淇淋等制品的乳糖析出问题，延 长货架期；改良含乳面包的品质；用于发酵乳制品中，可以缩短发酵时间，减少蔗 糖用量，改善发酵乳的风味和口感p l ：综合利用乳清，生产乳清糖浆、半乳糖果葡 糖浆和功能性低聚半乳糖等制品1 2 7 , 2 8 1 。 医药工业中乳糖酶可作为助消化类药物，适用于婴儿各种消化不良症，如先天 性乳糖酶缺乏症，因胃障碍及缺铁所致的幼儿慢性腹泻、幼儿及新生儿腹泻。霉菌 嚣l 农娩文学嫒士学位( 擎韭) 论文 乳糖酶隧适合作为医用黼制剂，因为它的最适p h 与胃液环境栩近，将其制成阴服 药裁，鞠辍嚣聪鲣食晶孛豹巍蘩在傣内转诧残人体易吸收豹蘩莓糖移拳襞耱，鸯皴 防止乳稽不耐癜1 2 o l 的发生。c a y l e 用糕曲霉乳糖酶制成粉状和颗粒状药剂，获得 了美国嬲专剥i 引i 。 分析方面，利用分析纯乳糖酶将乳糖水解，测定所产生的葡萄糖和半乳糖，以 计算乳糖的浓度，这种方法已被用于乳糖的常规分析。将乳糖酶和其他酶( 如过氧 亿物酶、葡萄耱氧话酶) 联合使用可戬分析踩淇淋、干黼和奶粉中的氍耱含量，该 法简便快捷，费用低廉 3 2 , 3 3 1 。z a r b 和h o u r i g a m 发展了一种新的乳糖测定方法，即 在毒其京还嚣i 穗转存在下，巍耱薅将羲耱承孵鬣。其冰纛会发警交甏二，羧器滚蠡戆 变化即可测定乳糖的浓度。此外，乳糖酶还可用于多糖的结构分析。 免疫、捡测及疾痰诊叛方瑟，姆矿拳瑰耪蓦瓣与入抟您乡 淀粉状蛋巍藏髂融合 形成融含蛋白，w 作为a l z h e i m e r 病的免疫源，并进一步制备其单克隆抗体。还有报 道将少半乳糖芬酶作为种辅鬣自，用来稳定和增加u r 5 - u r l 融合蛋囟的溶织谯， 双l l ：俸为猫自赢病毒g p 7 0 的疫荫。在诊断方面，将抗菌往h i v 稍毒基戮与舻半乳 糖苷酶基因l a c z 重组尉作为诱导基因在c o s 细胞中产生h i v - l a c z 缺陷型病毒。 最后在c d 4 + 靶缁稳串袭达扩拳巍耱营释。胄l 这系统可定量h i v 乖l 薅循环静荦麓 抑制作用，并预先化合物抗h 的活性。在环境检测方面，大肠杆菌的毋一半乳糖管 薅活牲稔溺可快速分扳滚场窝瀵场建区海零拳钵受撵灌携污染纛溲l 琊5 l 。 由予乳糖酶的广泛应用，其研究越来越受到人们的荚注。迄今为止商业上所有 豹乳糖憋都来源乎微生物发酵法，基本上由酵母髑霉萤发簿获德，但其爨耱酶产璧 较低且提取、纯化工艺繁杂，致使生产成本居高不下；通过基因工程技术改造和异 源表达乳糖酶基因是实现丈规横低成本生产的葶争有效途径。羁翦这方灏的研究已 鞭得了定静避震：h u a n g 等克隆了来源子童n i g e r 的羲糖酶基因，他们针对不同 的受体，构建了不同的表达系统，将此蕊因分别在霉菌自身、e c o i l 及非人的哺乳 劝兹缨稳孛表达涮；l 。d o m i n g u e s 翻用静霉豹絮凝往来麓亿巍耱瓣瓣分离步骤，德 们构建裁体将来源于a n i g e r 的乳糖酶潦因转入絮凝酵母瞧c e r e v i a s e ) 中，用乳糖 镀碳滚瓣酶矮鸯1 7 u m l ，惩蘩饕耱骰蔹源瓣，黪活楚8u m l ( 瘩薅ln m o l o n q o ) 1 3 7 1 ：张伟等将亮白曲霉产乳糖酶基因在毕赤酵母中得到高效表达，其表远产物分泌 于骢外，产量达到6g 兄；酶活达到3 6 0 0u m l i 硎。 目前，国外酷进入疋业化生产乳糖酶阶段，如荷兰g i s t - b r o c a d e s 公司生产的商 品名为m a x i l a e t 的酵母乳糖酶已被用于王业化生产低乳耱乳。面嗣内相关报道较少， 还依然存在巍耱酶的单靛产量较低、胞内酶撵取豳难、掇取工艺繁杂、生产成本嵩 屠不下、酶学性质欠佳等关键问题【3 9 1 。因此基因工程技术的发展特别怒真核表达 系统静发震为巍穗酶豹缀产震示出广阔瓣蘸景。 黑曲霉乳糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 1 2 毕赤酵母表达系统 毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 是一种甲醇酵母，生化研究表明，甲醇代谢需要一 系列的酶参与1 4 0 1 。从表达观点看，最令人感兴趣的是乙醇氧化酶( a o x ) ，它是甲 醇代谢途径中的第一个酶。毕赤酵母可以利用甲醇为唯一碳源进行生长，其基因工 程菌的外源基因，由胞内a o x 酶( 乙醇氧化酶) 基因启动子调控。在非甲醇碳源 条件下( 如甘油、葡萄糖、乙醇等) ，a o x 酶基因表达被抑制，外源基因不能被表 达。而当以甲醇为唯一碳源时，a o x 酶在胞内大量合成，同时外源基因被调控表 达【4 “ 毕赤酵母表达系统为上世纪八十年代发展起来的优良酵母表达系统【4 2 1 。同动植 物系统相比，它具有操作简单的优点；但它又与原核生物( 如大肠杆菌等) 不同， 毕赤酵母能对所表达的多肽和蛋白质进行翻译后加工处理，如毕赤酵母对外源蛋白 的糖基等更接近于哺乳动物细胞，而目前最为广泛使用的酿酒酵母则往往出现过度 糖基化。另外，毕赤酵母生长培养基中的盐、微量元素、生物素和碳源等都较易得 到，价格并不昂贵，且不含有毒物质和致热原。这些是毕赤酵母日益受到重视的主 要原因。 作为外源d n a 表达的宿主，毕赤酵母比酿酒酵母具有明显的优剧叫：使用 a o x i ( a l c o h o lo x i d a s e ) 启动子，是己知最强的可控启动子，可使异源蛋白的表达 量达到细胞总蛋白的5 * 0 - - 4 0 ；可以高水平分泌到几乎无杂蛋白的培养基中，便于纯 化；以单拷贝或多拷贝定点整合入基因组中，遗传稳定；良好的发酵方法，容易发 酵至高细胞浓度。近年来，毕赤酵母己被公认是一个外源蛋白的优秀表达系统 4 4 1 。 毕赤酵母作为外源基因的表达宿主己成功表达出一系列胞内和胞外蛋白，并已 建立起了一套较成熟的发酵工艺。另外，这种甲醇酵母能够实现高密度发酵，而且 其转化子能够非常稳定地表达外源蛋白质，因此更适应于工业化生产【4 5 l 。 1 2 1 毕赤酵母表达宿主菌 毕赤酵母能利用甲醇作为唯一的碳源和能量来源，含有特有的乙醇氧化酶基因 ( a o x ) 启动子。目前，已在其基因组中鉴定了2 个a o x 基因( a o x i 和a o x 2 ) ， 并已被分离和克隆，两者所编码的蛋白质有9 7 的同源性和几乎相同的特异催化活 性，不同的是a o x i 启动子受甲醇强烈诱导，a o x 2 启动子则很弱，而且，a o x l 的表达遵从抑制诱导规律，在以葡萄糖、甘油或乙醇为碳源时不表达，用甲醇诱导 时它的表达量则可占总细胞蛋白的8 0 d a 上m 朋j 。 大多数应用宿主菌是通过对野生型石油酵母y 1 1 4 3 0 进行突变改造而来。它们 一般具有一个或多个选择标记，因组氨酸脱氢酶基因( h i s 4 ) 突变而形成的营养缺 陷型宿主菌常作为选择标记。根据a o x l 个或2 个基因的缺失而造成对甲醇利用能 力高低的变化，可分为3 种表型：( 1 ) m u t + ，它含a o x i 和a o x 2 ，在含甲醇的培 弼j 农挂大学琰圭学位( 毕韭) 谂文 养基上以野生型速率生长。常用的g s l l 5 就是m u t + 宿擞菌；( 2 ) m 酊，如i c m t i 薤拣，窀豹a o i x l 较致溪酵母熬a r g 4 鏊困爨代替，戴密主蓥哭有菝羧a o x 2 基 因合成己醇氧化酶，在禽甲醇培养基中低速生长# ( 3 ) m u t 一，如m c1 0 0 - 3 菌株的 2 个a o x 基因都被去除，不能在含甲醇豹培养綦上生长。在实验过程中当通过瑚 ( m d h ) 和m m ( m m h ) 平税筛选便w 鉴定箕为m u t 还是m u t + 表型。 上述宿主麓的进一步改造，还可得划其他的衍生宿燕菌，目前已有l o 几种不 黼基西凝s m d l l 6 3 ，s m d l l 6 5 ，s m d l l 6 8 等建最近群发的一类蛋自瓣缺夫静宿 主菌，可减少所表达外源蛋白的降解，具有广泛的应用价值1 4 8 4 9 】。 1 2 2 毕赤酵母表达载体 毕赤酵母表达载体都是穿梭载体，主要有三丈类：o r i g i n a lp i c i i i a 袭达载体， e a s y s e l e e tp i c h i a 表达载体和m u l t i - c o p yp i c h i a 表达载体1 5 ”“。一些常用寝达载体及 特点觅袈1 ， 囊i 辜蠢酵霉掌蔫的囊运载蒋 t a b l e i t h e e x p r e s s i o n e 味甜s 碰p i c 删o t t l 肇券酵母表达载体舆有施肉分泌和脆蘼分泌之掰，般应雨脆外分泌登载棒。 而且该载体还有自我复制的游离载体和整合型载体两种类型，大多数实验室都采用 整台垄鼗髂，蘩舍鍪载襻逶遂髑苓溺静瓣甥f 翔o g tl l 、n o tl 或p m el 、s a cl 等) 线 化后，使之以单一交叉或双重交叉替换间源重组方式整含到酵母基因组的a o x i 或 h i s 4 綦因豹垃鬟，莠随簿母豹生长瑟稳定毒在。下嚣是基毒鼗袭性豹甲簿表达载体 结构： 5 ，a o x i ：食有a o xl 启动子，可强烈启动外源蛋囱的表达，同时也是载体赖 宿主菌发生重缀的位置。当酵母的a o x i 基因被替换丽丢失后，使酵母利用甲醇鹩 速度变慢，此时宿主菌利用弱的a o x 2 基因启动合成，即产生了m u t s 表型( m e t h a n o l u t i l i z a t i o ns l o w ) 反之帮称为m 心表塑：m c s ：多克隆像点，爨侯乡 涿纂霞插入耱 位点；s i g n a l ：编码n 术端信号肽序列，可引导外源蛋囱分泌到细胞外；c m y c ：方 黑曲霉乳糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 便检测外源蛋白位点；6 h i s ：纯化外源蛋白的标签，为蛋白的下游加工提供方便； 3 a o x lt t ：3 末端转录终止序列和终止位点，同源重组位置之一；z c o c i n ：既可 在大肠杆菌中筛选，又可作为阳性重组酵母转化子筛选的抗性基因：p u co r i ：大肠 杆菌复制起点【5 2 5 3 1 。 1 2 3 毕赤酵母表达系统的优点 巴斯德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 表达系统是近几年来发展起来的较为完善的， 被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。该系统与其它蛋白表达系统 相比具有许多优点，概括为： ( 1 ) 具有强有力的乙醇氧化酶基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达： ( 2 ) 可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表达出的蛋白具有生 物活性； ( 3 ) 营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产； ( 4 ) 可高密度规模发酵培养； ( 5 ) 和酿酒酵母相比，许多蛋白可达到每升克以上，如破伤风毒素c 片段表 达量高达1 2 班p ”，其它表达系统一般为毫克级： ( 6 ) 毕赤酵母表达糖蛋白的糖链长度平均每条侧链为8 1 4 个甘露糖残基，较 之酿酒酵母每条侧链平均5 0 1 5 0 个甘露糖残基短的多。此外，酿酒酵母核心多糖 末端存在m l ，3 糖苷键，一般认为酿酒酵母中糖蛋白的小l ，3 糖苷键使得这些蛋 白具有高度的抗原性，因而不适合治疗用途，毕赤酵母分泌的糖蛋白糖基化位点与 哺乳类细胞相同，免疫原性较低，更利于临床应用l 州； ( 7 ) 在甲醇营养型酵母中表达的蛋白既可存在于胞内，又可分泌到胞外，由 于甲醇营养型酵母自身分泌的背景蛋白非常少而培养基中又不含其它的蛋白质，这 样分泌的外源蛋白十分有利于外源蛋白的分离和纯化i5 5 1 1 3 本研究的目的和意义 乳糖酶在食品和乳品工业中的作用日益显著利用乳糖酶的催化水解能力，可 以有效解决“乳糖不耐症”，提高人民健康水平，增强民族体质，提高乳制品的质 量，增加乳制品的消费量和经济效益，促进我国乳品工业的蓬勃发展。目前我国乳 糖酶生产中仍存在着单位产量低，胞内酶提取、纯化困难等问题，而国外产品因价 格过高难以被乳品生产企业接受。因此，乳糖酶在我国具有巨大的开发潜力和广阔 的应用前景，并将在经济效益、社会效益等方面产生深远影响。 霉菌乳糖酶与其它来源的乳糖酶相比，最适温度较高( 一般在5 0 以上) ，生 产中能够有效防止杂菌污染，对热和酸的稳定性较好，不需要活化离子和稳定剂。 但是，产嗜热酶的菌株通常酶活力较低p , 5 6 l 。本论文研究的目的是利用基因工程手 舞l 农照太学磺_ = | = 学位( 毕韭) 论文 段，克隆来源予黑曲霉a s p e r g f f l u sn i g e rd l l l 6 的p - 半乳糖苷酶基因，将其在毕赤 舞母孛袭达， 奄建蒡戆选出毫效表达乳耱酶豹酵母工程藏抹，势对其酶学性质遴霉 研究，为乳糖酶的工业化生产和开发多功能用谂的乳糖酶产品掇供一个技术平台。 6 黑曲霉乳糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 2 1 材料 2 1 1 菌株与质粒 2 材料与方法 黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) d l i1 6 为本实验室保存； e c o l ij m l 0 9 ( 大连宝生物公司) ； 克隆载体p m d 一1 8 t ( 大连宝生物公司) ； 毕赤酵母( ，f c 矗蛔p a s t o r i s ) g s i1 5 ( i n v i t r o g e n 公司) ； 酵母分泌型表达载体p p i c 9 k ( i n v i t r o g c n 公司) 。 2 1 2 酶和生化试剂 t r i z o l 购自i n v i t r o g c n 公司；d e p c 、反转录酶、t a qd n a 聚合酶、d n am a r k e r 、 限制性内切酶、t 4 d n a 连接酶等购自大连宝生物公司：t a qp l u si 、氨卞青霉素、 i p t g 、x - - g a i 、u n i q 1 0 柱式d n a 胶回收试剂盒均购自上海生工公司：i p t g 、( 3 4 1 8 、 山梨醇、酵母无氨基酸氮源( n 帕) 、d 生物素均为b b i 公司产品：其他化学试剂 均为国产分析纯。 2 1 3 仪器 p c r 仪( b i o m e t r a ) 、凝胶成像仪( u v i t c c ) 、基因导入仪( b i o r a d ) 、台式冷 冻离心机( e p p c n d o r f ) 、g l 2 0 g - i i 冷冻离心机( 上海安亭科学仪器厂) 、e c p 3 0 0 0 三恒电泳仪( 北京六一仪器厂) 、台式酸度计( 上海理达仪器厂) 、s p 7 5 6p 紫外可 见分光光度计( 上海光谱仪器有限公司) 、m i l l i p o m 超滤系统( 日本密里博公司) 、 z h w y - 2 1 0 2 c 恒温培养振荡器( 上海智城分析仪器制造有限公司) 、z s d 1 2 7 0 生 化培养箱( 上海智城分析仪器制造有限公司) 、m d f u 3 2 v 超低温保存箱( 日本三 洋) 、电热恒温水浴锅( 北京长风仪器仪表公司) 、h x - 1 0 1 恒温循环水槽( 北京长 流科学仪器有限公司) 、s z - 9 3 自动双重纯水蒸馏器( 上海亚荣生化仪器厂) 2 1 4 培养基及有关溶液的配制 ( 1 ) 溶液 5 x t a e 缓冲液：称取t r i s5 4g ，冰醋酸5 7 m l ，并加入0 5 m o l l e d t a ( p h 8 o ) 2 0 m l ，定容至1 0 0 0 m l ； 7 霹蔻农娩大学嫒士学盈( 毕韭) 论文 溶液i ：5 0m m o l l t r i s - h c i ( p h 8 0 ) ，1 0m n l o l le d t a ( p h 8 0 ) ； 滚滚i i ；0 2 m o l l n a o h ，1 s d s - 溶液l i l ：5m o l lk a c6 0m l ，冰醋酸1 1 5m l ，h 2 02 8 5m l 。 s t e ：1 0 0 m m o l l n a c i ，1 0 m m o l l t r i s h c l ( p h 8 ，o ) ，lm l l l o l l e d t a ( d 贮渡，4 c 绦存。溯备平板辩鸯曩1 5 9 l 琼脂粉。 m m 毽葬蒸( 酝i n i m a lm e t h a n o lm e d i u m ) ：在8 0 0m l 去凑予拳孛溶艇1 5g 壕 脂粉。高压灭菌2 0r a i n ，冷却至6 0 左右，加入1 0 0m l1 0 x 1 r n b 、2m l5 0 0 x b ； 1 0 0 m l1 0 x m ，漫匀震立即镳剃平扳，4 援存鍪薅。 墨些苎塾堕堕茎旦箜塞堕墨茎垄兰查壁堡主塑塞垄 m d 培养基( m i n i m a ld e x t r o s em e d i u m ) ：在8 0 0m l 去离子水中溶解1 5g 琼脂 粉，高压灭菌2 0 m i n ，冷却至6 0 c 左右，加入1 0 0 m l l 0 x y n b 、2 m l 5 0 0 x b ； 1 0 0m l1 0 xd ，混匀后立即铺制平板，4 c 保存备用 b m g y 培养基( b u f f e rg l y c e r o l - c o m p l e xm e d i u m ) ：取l og 酵母提取物，2 0g 蛋白胨，溶于7 0 0m l 去离子水水中，高压灭菌2 0r a i n ，冷却至室温，加入1 0 0m l 1 0 x y n b 、2 m l 5 0 0 x b 、1 0 0 m l l 0 x g y 、1 0 0 m l l m o i l 磷酸缓冲液( p h 6 o ) ， 4 c 保存备用。 b m m y 培养基( b u f f e rm e t h a n o l - c o m p l e xm e d i u m ) ：以1 0 0m l 10xm 代替l o g y ，其余成分与b m g y 相同。 2 1 5 p c r 引物 克隆黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 乳糖酶基因所用的p c r 引物由上海生工公司合 成。 扩增乳糖酶基因d n a 片段所用引物为p r i m e r l 、p r i m e r 2 、p r i m e r 3 、p r i m 盯4 ， 其序列为： p r i m a l ：5 g 鱼匹硼a t t a a g c a t c g a a t c a a t g 3 5 m a l p r i m e f 2 ：5 四堑$ a t a g t c g t a g g a g g t g t a t c 3 p a t i p r i m e r 3 ：5 g m g t a t a t g g c r a a t i t c , - c 袷t a o a t - 3 p r i m e r 4 ：5 - 鱼匹硷q 酆t a g t a t g c a c c c t t c c g - 3 n o t l 扩增乳糖酶c d n a 片段所用引物为p r i m e r 5 、p r i m e r 6 、p r i m e r 、p r i m e r 8 ，其序 列为： p r i m e 4 55 t c 坠鱼q t c c a t f a a g c a t c g a a t c a a t g 3 b n i p f i m e f 6 ：5 - a t g a g t a c a g a g a g g t a g g a g t c g t c a g 3 p r i m e r ：5 t a r 1 3 g a g a c a a g a c g t c g c a c a c c g - 3 p r i m e r 8 ：5 q 鱼q q m g t a t g c a c c c t t c c g - 3 n o t i 2 2 方法 2 2 i 乳糖酶基因的克隆 2 2 i i 黑曲霉基因组d n a 的提取i ，5 硼 9 嚣| 农她大学磺士学燕( 孥韭 论文 将在p d a 液体培养基中培养了4 8h 的菌体过滤，用d d h 2 0 洗涤菌丝体两次， 将滤褥鹣蘩丝搭用滤纸吸手，称敬l 。5g 漫蓥髂在滚氮串疆蘑戏耪寒热入到预热至 6 5 的1 5m lc t a b 提取液中，6 5 保温6 0m i n ，5 0 0 0r m i n 离心1 0r a i n 上清液 依次用镣体积酚：氯谤：勇戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 、等体积熏【仿：异发酵( 2 4 ：1 ) 抽提，上瀵加 入0 8 m l 3 m o l l n a a c 溶液，用2 倍体积的冷蠢水乙醇沉淀，冰浴3 0r a i n ，1 0 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，7 0 乙醇洗涤沉淀魏次，风午，溶予t e 中餐用。 2 2 1 2 乳糖酶基因d n a 片段的扩增 爱疲体系： 1 0 x p c rb u f f e r ( 含m g c l 2 ) 盈孵pm i x ( 2 5m m o & ) 啦( 2 - 5 u 批) p r i m e r l 3 ( 1 0t t m o t l ) p r i m e r 2 4 ( 1 0p m o l l ) 模裁d n a d d 2 0 2 5 i l l 2 0 西 0 ，5 “ 1 0 瞳 1 0 儿 1 0 匝 1 7 皿 慧俘积鍪西 以黑曲霉豹总d n a 为模援，分别以p r i m e r l p r i m e r 2 ，p r i m e r 3 p r i m e r 4 为上下 游引物，进行分段p c r 反应扩增乳糖酶基因d n a ，扩璃条侔为；9 4 4m i n ，9 4 lr a i n ，6 4 1r a i n ( p r i m e r l 与p r i m e r 2 ) ，5 6 lr a i n ( p r i m e r 3 与p r i m e r 4 ) ，7 2 1 5 m i n ( p r i m e r l p r i m e r 2 ) 2 5r a i n ( 玮m e t 3 与p r i m e r 4 ) 共3 0 个循环嚣，予7 2 延伸1 0r a i n 。分别连接到p m d l 8 t 载体上，测序，对测序结果进行拼接整理获得 襞耱酶蒸因d n a 序弼。 2 2 1 j 3t r i z o l 法提取黑曲霉总r n a ( 1 ) 将在诱导黑曲霉产乳糖酶的培养基中培养3 6h 的菌丝体过滤、洗涤，取 o 1g 菌丝在渡飘中充分研磨，穆入lm l t r i z o l 巾，混匀后室温下静置5m i n ，使核 蛋自复食物完全解离。( 样品体积不超过所用t r i z o l 体积的l o ) ( 2 ) 加入0 2m l 氯仿，剧烈摇动戏用旋涡震荡器混匀予4 c 下1 2 0 0 0r m i n 离心1 5r a i n 。墩取主清液，重受次或多次该步骤。 ( 3 ) 吸取上清液，每lm l t r i z o l 加入0 2 5 倍体积的异丙醇和0 2 5 倍的r n a 淀淀裁，兖势滋匀嚣，擎室漫敖萱1 0r a i n 。手4 c 下1 2 0 r r a i n 嵩心l or a i n 。 ( 4 ) 收集r n a 沉淀，用7 5 的乙醇洗涤两次，熏复上述离心。 ( 5 ) 惩一次挂楚嬲豹吸头吸尽残存戆乙醇。将打嚣管盖豹离心管放在实验螽 上几分钟，使残余的乙醇挥发摊，不要让r n a 午透。 ( 6 ) 加5 扯1 0 0 “d e p c 处理过的水，将r n a 溶液贮存予7 0 c 。 l o 黑曲霉乳糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 2 2 1 4 反转录合成e d n a 第一链 取l 止总r n a ，加d e p c 处理的d d h 2 0 至9 5 p l ，将r n a 样品在7 5 1 2 变性 5m i n ，立即在冰浴中冷却5m i n ，然后稍微离心一下。按下表在冰浴中依次加入各 种成分： 5 1 s ts t r a n ds y n t h e s i sb u f f e r 1 0m m o l ，ld n t pm i x t u r e o l i g o ( d t ) r n a s ei n h i b i t o r r t a s e ( m m l v ) r n a s e - f r e ed d h 2 0 总体积 2 0 u l 将反应液混合后，室温下放1 0m i n ，然后4 2 ( 2 温育6 0r a i n ，6 5 1 2 水浴中放置5 a l i a ，加入8 0i ld e p c 处理的d d h 2 0 ，稀释至1 0 0 儿，混匀，保存于- 2 0 1 2 2 互1 5 乳糖酶基因全长e d n a 片段的克隆 反应体系： 1 0 x p c rb u f f e r ( 含m g c l 2 )2 5l l l d n t pm i x ( 2 5m m o f l )2 0u l t a q ( 2 5 u ，i i l ) 0 , 5 皿一 p r i m e r s 7 ( 1 0l a m o f l )1 0 儿 p r i m e r 6 8 ( 1 0p m o f l )1 0u l e d n a 第一链1 0 止 d d h 2 0 1 7 u l 总体积2 5 u l 取l “l 总r n a 进行反转录获得e d n a 的第一链，再分别以p r i m e r 5 p r i m e n 5 ， p f i m e h p r i m e r g 为上下游引物，进行分段p c r 反应。扩增条件